Mô tả:
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Bùi Thị Nhung
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ
BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Bùi Thị Nhung
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ
BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số
: 60 42 01 07
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN HỮU PHÚC
Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu được trình bầy trong phần kết quả của luận văn này là do
chính tôi thực hiện và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình
nào.
Tác giả luận văn
Bùi Thị Nhung
1
LỜI CẢM ƠN
Sau hai năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ
Sinh học. Để đạt được thành quả như ngày hôm nay
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Toàn thể quý Thầy, Cô khoa sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã truyền
đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong thời gian tôi theo học tại trường.
TS. Nguyễn Hữu Phúc – giáo viên hướng dẫn của tôi, một người thầy nhưng cũng
rất gần gũi và luôn tận tâm đối với học trò của mình. Người đã hết lòng hướng dẫn, quan
tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong những lúc khó khăn. Thầy đã truyền đạt kiến thức và
kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này .
Sở Giáo Dục - Đào Tạo tỉnh Bình Dương, Trường THPT An Mỹ đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian đi học.
Ths. Dương Nhật Linh và Ths. Nguyễn Văn Minh (Đại Học Mở) đã nhiệt tình
giúp đỡ và hỗ trợ tôi làm thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) và toàn thể các bạn học viên cao
học khóa 22 đã luôn giúp đỡ, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân yêu trong gia đình đã
luôn bên cạnh, ủng hộ tôi, là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có
được ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn
Bùi Thị Nhung
2
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ 6
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................................. 7
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 8
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 8
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10
1.1. Khái quát chung về protease .................................................................................... 10
1.1.1. Khái niệm và phân loại ......................................................................................... 10
1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease ......................................................... 13
1.1.3. Enzyme protease kiềm .......................................................................................... 19
1.1.4. Enzyme Nattokinase ............................................................................................. 26
1.2. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn ....... 30
1.2.1. Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn ........................................................ 30
1.2.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme.................................................. 30
1.2.3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn ......................................................... 31
1.3. Đại cương về Bacillus subtilis ................................................................................... 31
1.3.1. Lịch sử phát triển .................................................................................................. 31
1.3.2. Vị trí phân loại ...................................................................................................... 32
1.3.3. Đặc điểm phân bố ................................................................................................. 32
1.3.4. Đặc điểm hình thái và sinh hóa ............................................................................. 32
1.4. Giới thiệu bệnh huyết khối ....................................................................................... 34
1.4.1. Khái niệm về huyết khối ....................................................................................... 34
1.4.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối ..................................................................... 34
1.4.3. Biến chứng của bệnh huyết khối ........................................................................... 35
1.4.4. Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam ....................................... 36
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 37
2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 37
2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 37
3
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................... 37
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 37
2.2. Môi trường nghiên cứu ............................................................................................. 37
2.3. Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát) ................ 39
2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto .................................................. 40
2.3.2. Phương pháp cấy truyền VSV .............................................................................. 41
2.3.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng ...................................................... 41
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc ........................................................... 42
2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................................... 42
2.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A. Peskop .................................................... 43
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase ..................................................... 43
2.3.8. Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM .......... 44
2.3.9. Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét ....................................... 44
2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................... 44
2.3.11. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ............................... 45
2.3.12. Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân ............. 46
2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến .......................... 47
2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry...................................... 49
2.3.15. Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase ........................................................ 50
2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp
protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................. 51
2.3.17. Phương pháp làm natto ....................................................................................... 54
2.3.18. Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men................................... 55
2.3.19. Phương pháp tách chiết enzyme ......................................................................... 56
2.3.20. Phương pháp thu nhận enzyme ........................................................................... 56
2.3.21. Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol58
2.3.22. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 58
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 60
3.1. Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao ........................... 60
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản............................................... 60
3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao.............................................. 61
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi.... 66
3.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 66
3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái .......................................................................... 68
4
3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử ....................... 68
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease
của chủng B. subtilis N18 ................................................................................................. 69
3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành ....................................................... 69
3.4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường ...................................................................... 71
3.4.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men ........................................................................ 72
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu .................................................................................. 73
3.4.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống .................................................................................... 75
3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ ................................................................................... 76
3.4.7. Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease ...... 77
3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm................................................................................... 78
3.5. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase ............................................ 82
3.5.1. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của
Nhật Bản ......................................................................................................................... 82
3.5.2. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn ..................... 86
3.5.3. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis ............... 91
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 96
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 103
5
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ACE
Angiotensin
BT
Bào tử
CPE
Chế phẩm enzyme
ĐN & GL
Đậu nành và gạo lức
ĐN
Đậu nành
G(-)
Gram âm
G(+)
Gram dương
GL
Gạo lức
KHV
Kính hiển vi
KL
Khuẩn lạc
MT
Môi trường
NXB
Nhà xuất bản
OD
Mật độ quang
PP
Phương pháp
STT
Số thứ tự
TB
Tế bào
TCA
Axit tricloacetic
TN
Thí nghiệm
VK
Vi khuẩn
VSV
Vi sinh vật
6
- Xem thêm -