Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ bacillus subtilis có trong natto nhật bản hư...

Tài liệu Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ bacillus subtilis có trong natto nhật bản hướng tới thực phẩm chức năng

.PDF
8
48
99

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Bùi Thị Nhung NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Bùi Thị Nhung NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu được trình bầy trong phần kết quả của luận văn này là do chính tôi thực hiện và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả luận văn Bùi Thị Nhung 1 LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Sinh học. Để đạt được thành quả như ngày hôm nay Tôi xin chân thành cảm ơn:  Toàn thể quý Thầy, Cô khoa sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong thời gian tôi theo học tại trường.  TS. Nguyễn Hữu Phúc – giáo viên hướng dẫn của tôi, một người thầy nhưng cũng rất gần gũi và luôn tận tâm đối với học trò của mình. Người đã hết lòng hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong những lúc khó khăn. Thầy đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này .  Sở Giáo Dục - Đào Tạo tỉnh Bình Dương, Trường THPT An Mỹ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian đi học.  Ths. Dương Nhật Linh và Ths. Nguyễn Văn Minh (Đại Học Mở) đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi làm thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.  Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) và toàn thể các bạn học viên cao học khóa 22 đã luôn giúp đỡ, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.  Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi, là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có được ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn Bùi Thị Nhung 2 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1 LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2 MỤC LỤC .................................................................................................................... 3 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ 6 MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................................. 7 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 8 3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 8 4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10 1.1. Khái quát chung về protease .................................................................................... 10 1.1.1. Khái niệm và phân loại ......................................................................................... 10 1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease ......................................................... 13 1.1.3. Enzyme protease kiềm .......................................................................................... 19 1.1.4. Enzyme Nattokinase ............................................................................................. 26 1.2. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn ....... 30 1.2.1. Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn ........................................................ 30 1.2.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme.................................................. 30 1.2.3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn ......................................................... 31 1.3. Đại cương về Bacillus subtilis ................................................................................... 31 1.3.1. Lịch sử phát triển .................................................................................................. 31 1.3.2. Vị trí phân loại ...................................................................................................... 32 1.3.3. Đặc điểm phân bố ................................................................................................. 32 1.3.4. Đặc điểm hình thái và sinh hóa ............................................................................. 32 1.4. Giới thiệu bệnh huyết khối ....................................................................................... 34 1.4.1. Khái niệm về huyết khối ....................................................................................... 34 1.4.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối ..................................................................... 34 1.4.3. Biến chứng của bệnh huyết khối ........................................................................... 35 1.4.4. Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam ....................................... 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 37 2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 37 2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 37 3 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................... 37 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 37 2.2. Môi trường nghiên cứu ............................................................................................. 37 2.3. Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát) ................ 39 2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto .................................................. 40 2.3.2. Phương pháp cấy truyền VSV .............................................................................. 41 2.3.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng ...................................................... 41 2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc ........................................................... 42 2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................................... 42 2.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A. Peskop .................................................... 43 2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase ..................................................... 43 2.3.8. Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM .......... 44 2.3.9. Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét ....................................... 44 2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................... 44 2.3.11. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ............................... 45 2.3.12. Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân ............. 46 2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến .......................... 47 2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry...................................... 49 2.3.15. Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase ........................................................ 50 2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................. 51 2.3.17. Phương pháp làm natto ....................................................................................... 54 2.3.18. Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men................................... 55 2.3.19. Phương pháp tách chiết enzyme ......................................................................... 56 2.3.20. Phương pháp thu nhận enzyme ........................................................................... 56 2.3.21. Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol58 2.3.22. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 58 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 60 3.1. Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao ........................... 60 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản............................................... 60 3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao.............................................. 61 3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi.... 66 3.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 66 3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái .......................................................................... 68 4 3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử ....................... 68 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................................. 69 3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành ....................................................... 69 3.4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường ...................................................................... 71 3.4.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men ........................................................................ 72 3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu .................................................................................. 73 3.4.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống .................................................................................... 75 3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ ................................................................................... 76 3.4.7. Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease ...... 77 3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm................................................................................... 78 3.5. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase ............................................ 82 3.5.1. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của Nhật Bản ......................................................................................................................... 82 3.5.2. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn ..................... 86 3.5.3. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis ............... 91 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 96 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 103 5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE Angiotensin BT Bào tử CPE Chế phẩm enzyme ĐN & GL Đậu nành và gạo lức ĐN Đậu nành G(-) Gram âm G(+) Gram dương GL Gạo lức KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc MT Môi trường NXB Nhà xuất bản OD Mật độ quang PP Phương pháp STT Số thứ tự TB Tế bào TCA Axit tricloacetic TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật 6
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan