Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh khánh hòa

  • Số trang: 49 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 40 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  DIỆP THỊ TỨ QUYỀN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỖN HỢP CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN Ở TỈNH KHÁNH HÒA. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Nha Trang, tháng 07 năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  DIỆP THỊ TỨ QUYỀN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỖN HỢP CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN Ở TỈNH KHÁNH HÒA. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm GVHD: TS Nguyễn Duy Nhứt Nha Trang, tháng 07 năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài này Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Chế Biến đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập ở trường. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang cùng các anh chị làm việc ở Viện đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập vừa qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, bạn bè đã tận tình động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Diệp Thị Tứ Quyền ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN............................................................................................................ i MỤC LỤC ................................................................................................................ ii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. v DANH MỤC HÌNH................................................................................................. vi MỞ ĐẦU................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH ..................................... 2 1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp....................................................... 2 1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp......................................... 2 1.1.3. Các chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển.................................................. 2 1.1.3.1. Acetogenins ........................................................................................ 2 1.1.3.2. Terpenoids .......................................................................................... 3 1.1.3.3. Alkaloids ............................................................................................ 4 1.1.3.4. Phenolics ............................................................................................ 5 1.1.3.5. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển ...................................... 6 1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM ............ 10 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio spp ........................................................... 10 1.2.2. Bệnh ở tôm do vi khuẩn Vibrio spp ......................................................... 11 1.3. ỨNG DỤNG CHẤT CHUYỂN HÓA ĐỂ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG WSSV. ................................................................................................................. 12 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ CẤP TỪ RONG BIỂN ......................................................................................... 13 1.4.1. Acetogenins............................................................................................. 13 1.4.2. Terpenoids............................................................................................... 13 1.4.3. Alkaloids ................................................................................................. 13 1.4.4. Phenolics ................................................................................................. 14 iii 1.5. KẾT LUẬN RÚT RA TỪ TỔNG QUAN ..................................................... 15 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................................. 16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................ 16 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 17 2.3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ưu ở công đoạn chiết cồn của quy trình tách chiết .......................................................................................................................... 17 2.3.1.1. Qui trình dự kiến tách chiết hỗn hợp chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 17 2.3.1.2. Giải thích quy trình: .......................................................................... 18 2.3.1.3. Bố trí thí nghiệm: .............................................................................. 19 2.3.2. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa bằng phương pháp chiết ethanol. ....................................................................... 22 2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. ................................................ 23 2.3.3.1. Nguyên tắc........................................................................................ 23 2.3.3.2. Tiến hành.......................................................................................... 23 2.3.4. Tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng các dung môi phân cực khác nhau. .......................................................................................... 24 2.3.5. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách trên các dung môi có độ phân cực khác nhau..................................................... 26 2.3.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa thứ cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cực khác nhau .................... 27 2.3.7. Các máy móc thiết bị dung trong nghiên cứu khoa học............................ 27 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................. 28 3.1. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu của quy trình chiết ethanol..................... 28 3.1.1. Kết quả xác định nồng độ ethanol trong công đoạn chiết ethanol............. 28 3.1.2. Kết quả xác định nhiệt độ chiết ethanol ................................................... 29 3.1.3. Kết quả xác định thời gian chiết ethanol .................................................. 30 iv 3.2. Kết quả xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa bằng phương pháp chiết ethanol. ................................................................... 32 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. ....................................... 34 3.4. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách trên dung môi có độ phân cực khác nhau. .................................................................... 36 3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa thứ cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cưc khác nhau .............................. 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ....................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 39 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 40 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục các loài rong dùng tách chiết chất chuyển hoá thứ cấp............. 16 Bảng 3.1. Kết quả định lượng chất chuyển hóa thứ cấp từ các loài rong biển .................... 32 Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol từ một số loài rong nghiên cứu được pha đến nồng độ 50g/ml bằng ethanol..................................................... 35 Bảng 3.3. Hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp trong các phân đoạn được phân lập bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau .......................................................... 36 Bảng 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết các dung môi khác nhau từ một số loài rong nghiên cứu................................................................................................. 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của acetogenins............................................................................. 2 Hình 1.2. Cấu trúc của terpenoids............................................................................... 3 Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids ............................................................. 3 Hình 1.4. Cấu trúc của alkaloids................................................................................. 4 Hình 1.5. Cấu trúc của phenolics ................................................................................ 5 Hình 1.6. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong đỏ ................................................. 6 Hình 1.7. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong nâu ............................................... 7 Hình 1.8. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong lục ................................................ 8 Hình 1.9. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ tảo lam ................................................. 9 Hình 1.10. Vibrio spp phân lập từ tôm sú bệnh đốm trắng ........................................ 11 Hình 1.11. Đốm trắng trên vỏ đầu ngực của tôm nhiễm bệnh đốm trắng................... 11 Hình 2.1. Sơ đồ qui trình dự kiến tách chiết chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol................. 18 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ethanol ..................................... 19 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết ethanol............................. 20 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết ethanol............................ 21 Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng các dung môi phân cực khác nhau. ........................................................................... 25 Hình 3.1. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nồng độ ethanol................................. 28 Hình 3.2. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nhiệt độ............................................. 30 Hình 3.3. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào thời gian............................................ 31 Hình 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol ................. 34 Hình 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn khác nhau...... 36 vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT DIẾN GIẢI WSSV White Spot Syndrome Virus LHM Lobster Haemolymph Medium 1 MỞ ĐẦU Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất. Rong nâu chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose,...); 17 axít béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự do nguy hiểm; fucoidan fucan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư, đồng thời làm tăng chỉ số chức năng gan; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu, alginate là chất giải độc tự nhiên và laminaran là chất chống đông tụ máu và ung thư. Nước ta có bờ biển dài hơn 3.200 km trải dài từ Bắc xuống Nam, bao dọc hết phía Đông và phía Nam đất nước với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 , được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú trong đó rong mơ (Sargassaceae) được phát hiện trên 60 loài với sản lượng khai thác ước tính trên 10.000 tấn/năm. Tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu phong phú, ngày nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về rong biển và đã đưa vào thực tiễn ứng dụng trên người, động vật và thủy hải sản. Tuy nhiên nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ rong biển thì không nhiều. Vì vậy, đề tài ”Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa ” là cần thiết, góp phần mở rộng nguồn nguyên liệu dược liệu, công nghệ sinh học và nông nghiệp. Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Diệp Thị Tứ Quyền 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH 1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp Các chất chuyển hóa thứ cấp là các hợp chất không cần thiết cho sự tăng trưởng và tái sinh của thực vật, tuy nhiên các chất này góp phần giúp cho thực vật ngăn cản các loại động vật ăn cỏ sử dụng chúng làm thức ăn, giúp thực vật chống đỡ các loài vi khuẩn, và giúp cho thực vật nhận ra các mối đe dọa xung quanh [6]. Các chất chuyển hóa thứ cấp là chìa khóa cho sự tương tác giữa thực vật với môi trường hữu sinh và vô sinh đang gây ảnh hưởng lên chúng. Theo suốt lịch sử phát hiện và ứng dụng của các chất chuyển hóa thứ cấp phục vụ cho loài người, có thể phân chúng thành 4 nhóm chính: alkaloids, phenylpropanoids, flavonoids và terpenoids và đối với rong biển các chất chuyển hóa thứ cấp có trong rong biển có thể liệt kê thành 4 nhóm cấu trúc: Terpenoids, Acetogenins, Alkaloids và Phenolics.[9] 1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp có thể liệt kê ra như sau:  Antistaphylococcal [4]      Sử dụng chúng như tín hiệu phân loài [7] Kháng khuẩn, chống ôxy hóa [10] Hoạt tính gây độc tế bào [5] Chống mùi hôi [2] Kháng virus đốm trắng của tôm [8], tăng cường miễn dịch cho tôm [13] 1.1.3. Các chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển [3] 1.1.3.1. Acetogenins Hình 1.1. Cấu trúc của acetogenins 3 Acetogenins là những hợp chất tự nhiên rất phức tạp, luôn có mặt nhiều tâm đối xứng. Cấu trúc thông thường của acetogenin có ankan mạch chính thẳng dài đến 35 hoặc 37 nguyên tử carbon với đầu cuối mạch là một -lactone. Gốc ưa nước thường là 1 đến 2 vòng tetrahydrofuran, một vài nhóm hydroxyl ở các vị trí khác nhau. Hầu hết các trường hợp, tâm đối xứng trong acetogenin chính là các tâm phân cực. Acetogenin trong rong thường có mạch carbon 11 hoặc 15 nguyên tử. 1.1.3.2. Terpenoids Terpenoids, đôi khi còn có tên gọi isoterpenoid là các hợp chất hữu cơ tự nhiên giống như terpene, gồm các dẫn suất tạo thành từ isoprene, ví dụ như: Hình 1.2. Cấu trúc của terpenoids Trong tảo, rất nhiều terpenoids còn có chứa halogen gọi chung là halogenate terpenoids. Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids 4 1.1.3.3. Alkaloids Alkaloids là hoạt chất có nguồn gốc từ sinh vật, thường là thực vật. Phân tử alkaloids luôn luôn có chứa C, H, N, và rất hay gặp oxi, đặc biệt có vài alkaloids có chứa lưu huỳnh. Có ít hoặc nhiều phản ứng kiềm, những alkaloids đầu tiên phát hiện được gọi là các chất kiềm thực vật. Chúng được coi như là các bazơ nitơ hữu cơ và cho các muối với axít. Các muối này dễ kết tinh. Về danh pháp, tên của chúng (thường nhắc đến tên cây mà từ đó chúng được chiết xuất) mang đuôi in. Hàm lượng alkaloids trong thực vật thay đổi trong giới hạn rất rộng. Ngày nay người ta qui ước nói đến thực vật có alkaloids khi hàm lượng của chúng lớn hơn 100ppm. Nhiều alkaloids có trong thực vật 2 đến 3%. Đặc biệt trong vỏ cây canh ki na có hơn 10%. Alkaloids hòa tan trong dịch tế bào, ít thấy ở trạng thái tự do, thông thường ở dạng muối (malat, xitrat, tactrat …) hoặc kết hợp với tanin. Trong một loài thực vật hiếm thấy chỉ có một alkaloid, mà hay gặp một nhóm bazơ ít nhiều giống nhau về cấu trúc. Trong alkaloids, thường gặp amin bậc 1 bậc 2 hay bậc 3. Thông thường nitơ tham gia vào nhân dị vòng, nhưng đôi khi cũng có thể ở ngoài vòng. Nhiều alkaloids có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương như là chất gây trầm uất hoặc làm chất kích thích. Một số lớn các chất tác dụng lên dây thần kinh tự chủ: chất kích thích giao cảm, các chất liệt giao cảm, các chất kích thích phó giao cảm, các chất liệt phó giao cảm, các chất phong bế hạch giao cảm. Trong số các alkaloids có các chất gây tê tại chỗ, có chất trị co giật. Một ít alkaloid có tác dụng trên tim chống rung tim cũng có chất gây trầm uất. Nhiều alkaloids có khả năng diệt ký sinh trùng, trị amip hoặc giun và kháng virus ở liều cao. Một số alkaloids từ rong biển như: Hình 1.4. Cấu trúc của alkaloids 5 1.1.3.4. Phenolics Phenol thường không có ở dạng tự do trong thực vật, nhưng lại thường gặp ở dạng phenyl. Nhiều phenol ở dạng ete-oxyt trong tinh dầu như esragol, safrol, apion, aneton. Trong số các diphenol, pyrocatechol là một sản phẩm của sự nhiệt phân từ catechol, gaiacol, ete monometylic của nó có trong các sản phẩm chưng cất của nhựa Guaiacum officinale, hắc ín của gỗ. Hydroquinol không có ở trạng thái tự do mà ở trạng thái kết hợp dưới dạng glycozit trong acbutozit. Các diphenol có chuỗi ngang thường gặp gồm có laccol, uruxitol… Trong các triphenol, pyrogalon là dẫn xuất từ sự nhiệt phân của axít galic, chất này là thành phần của vài tanin, nhân plurogluxinol có trong phân tử của thành phần có tác dụng trị giun sán. Phenolics có hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm nhiễm, chống ung thư, chữa dạ dày, kháng khuẩn … Phloroglucinol (algae polyphenolic) từ rong biển: Hình 1.5. Cấu trúc của phenolics 6 1.1.3.5. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển Hình 1.6. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong đỏ 7 Hình 1.7. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong nâu 8 Hình 1.8. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong lục 9 Hình 1.9. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ tảo lam 10 1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio spp [1] Đặc điểm chung các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc nơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Cơ bản chúng đều sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, liên quan đến các động vật biển. Một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển. Vi khuẩn vibrio có rất nhiều trong nước mặn, và độ mặn càng cao thì vibrio càng nhiều, vì chất Natri (Na, Sodium) trong nước mặn là yếu tố phát triển của vi khuẩn vibrio, do đó khi độ mặn cao trên 20 phần ngàn thì phát sang nước thường xảy ra. Loại vi khuẩn này thuộc nhóm Gram âm sống dưới nước và phân chia tế bào rất nhanh ở độ mặn 0-40 phần nghìn đặc biệt khi nhiệt độ nước tăng cao. Do đó bệnh thường hay xảy ra vào mùa hè. Ngoài ra vi khuẩn loại này còn phát triển ở môi trường nước có hàm lượng chất hữu cơ cao, hàm lượng oxy thấp. Các triệu chứng bệnh như: mòn đuôi, đứt râu, đường ruột, đen mang, đỏ than, đỏ đuôi. Tôm bơi gần bờ phát hiện có màu đỏ nhạt và các chứng bệnh như trên. Vi khuẩn vibrio có nhiều trong môi trường nước mặn, do đó khó phát hiện ra là chủng loại nào thật sự gây bệnh. Có rất nhiều tranh luận về tác nhân gây bệnh vibrio, nhưng những báo cáo khoa học về bệnh vibrio không chung một chủng loại ở một nơi nhất định. Cũng có nhiều ý kiến cho rằng tác nhân gây bệnh vibrio chính là một protein độc của vi khuẩn này sau khi chết được tiết ra trong cơ thể tôm gây ngộ độc, vì có rất nhiều trường hợp khi phát hiện tôm nhiễm vibrio người nuôi thường dùng kháng sinh trị bệnh, nhưng tôm lại có dấu hiệu bệnh nặng hơn trước khi dùng thuốc. Vi khuẩn này có thể sống được trong môi trường thiên nhiên, tuy nhiên chúng sẽ chết dưới ánh sáng mặt trời, sức đề kháng yếu. Sống được khá lâu ở sông ngòi, ao hồ. Môi trường nuôi cấy thường là canh thang, pepton kiềm ph = 8,6 hoặc thạch kiềm muối hoặc thạch TCBS hoặc thạch TSB. 11 1.2.2. Bệnh ở tôm do vi khuẩn Vibrio spp Những loài gây bệnh cho tôm là: V. alginolyticus, V. anguillrium, V. ordalii, V. salmonicida, V. parahaemolyticus, V. harvey, V. vulnificus…[1]. Bệnh Vibrio thường đi chung với bệnh khác do virut, nấm ,môi trường tốt và dinh dưỡng đầy đủ thì cơ thể tôm đủ mạnh để ngăn cản sự xâm nhập của vibrio. Vibrio spp gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin, bệnh hoại tử mắt, bệnh đốm trắng…[1]. Hình 1.10. Vibrio spp phân lập từ tôm sú bệnh đốm trắng Hình 1.11. Đốm trắng trên vỏ đầu ngực của tôm nhiễm bệnh đốm trắng
- Xem thêm -