Tài liệu Nghiên cứu tách chiết axit 5 aminolevulinic trong lá ổi (psidium guajava) và đánh giá tác động trên chuột bị tiểu đường

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Trung Đoàn NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT AXIT 5-AMINOLEVULINIC TRONG LÁ ỔI (PSIDIUM GUAJAVA) VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG TRÊN CHUỘT BỊ TIỂU ĐƢỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Trung Đoàn NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT AXIT 5-AMINOLEVULINIC TRONG LÁ ỔI (PSIDIUM GUAJAVA) VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG TRÊN CHUỘT BỊ TIỂU ĐƢỜNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trịnh Tất Cƣờng Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Luận văn thạc sĩ của tôi được thực hiện tại phòng Eznyme học và phân tích hoạt tính sinh học trực thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại Học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Tất Cường, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn cho tôi, đã luôn chỉ bảo tận tình để tôi hoàn thành được luận văn này. Thầy luôn ân cần quan tâm, trao đổi và cho tôi những góp ý rất bổ ích về mặt khoa học để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa sinh, đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Hóa sinh và Sinh lý thực vật là những người thầy đã trực tiếp giảng dạy, cung cấp cho tôi những kiến thức phong phú và quý giá giúp tôi ứng dụng tốt trong nghiên cứu của mình. Tôi cũng xin gửi lời biết ơn tới các thầy cô trực thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, các thầy cô giáo trong bộ môn, các anh chị nghiên cứu sinh, cao học, thuộc Bộ môn Hóa sinh và Sinh lý thực vật đã tạo điều kiện đầy đủ về trang thiết bị cũng như phòng thí nghiệm, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ động viên về mặt tinh thần giúp tôi hoàn thành luận văn của mình. Học viên . TRẦN TRUNG ĐOÀN MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3 1.1.Tiểu đường ............................................................................................................3 1.1.1. Tình hình bệnh tiểu đường trên thế giới và Việt Nam ......................................3 1.1.2. Chẩn đoán và phân loại bệnh tiểu đường ..........................................................5 1.1.3. Sinh lý bệnh tiểu đường ....................................................................................8 1.2.Thuốc trị tiểu đường ............................................................................................11 1.2.1. Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin ................................................12 1.2.2. Các thuốc làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin ..................................13 1.2.3. Thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn...................................................13 1.3.5-Aminolevulinic axit trong lá ổi ........................................................................14 1.3.1.Cây ổi 14 1.3.2.5-Aminolevulinic axit ......................................................................................17 CHƢƠNG 2 -ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ..............................................21 2.1. Đối tượng ...........................................................................................................21 2.1.1. Dược liệu .........................................................................................................21 2.1.2. Động vật thí nghiệm ........................................................................................21 2.2. Vật liệu. ..............................................................................................................21 2.3. Phương pháp.......................................................................................................22 2.3.1. Phương pháp tạo mẫu khô từ dịch chiết lá ổi [20] ..........................................22 2.3.2. Phương pháp thử độc tính cấp của dịch chiết lá Ổi từ cây Ổi.........................22 2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ...........................................22 2.3.3.1. Giới thiệu phương pháp ...............................................................................22 2.3.3.2. Nguyên lý tiến hành .....................................................................................23 2.3.3.3.Phương pháp đánh giá định tính và định lượng 5-ALA bằng HPLC ...........24 2.3.4. Đánh giá hoạt tính của 5-ALA trên mô hình bệnh tiểu đường ở chuột ..........25 2.3.4.1. Mô hình gây bệnh tiểu đường trên chuột. ....................................................25 2.3.4.2. Phương pháp đánh giá khả năng điều trị tiểu đường bằng 5-ALA ............................25 2.3.5. Phương pháp định lượng Glucose trong máu .................................................26 2.3.6. Phương pháp định lượng Insulin và HbA1c trong máu. .................................27 2.3.7. Phương pháp xét nghiệm các chỉ số men gan .................................................27 2.3.7.1. Nguyên tắc ...................................................................................................27 2.3.7.2. Xác định chỉ số GOT, GPT, ALP và Bilirubin ...........................................30 2.3.8. Phương pháp làm tiêu bản gan, thận, tụy chuột ..............................................31 2.3.8.1. Nguyên tắc ...................................................................................................31 2.3.8.2. Quy trình thí nghiệm ....................................................................................32 2.3.9. Cholesteol trong huyết thanh ..........................................................................33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................34 3.1. Sơ đồ tách chiết 5-ALA từ là ổi .........................................................................34 3.2. Xác định hàm lượng 5-ALA trong lá ổi .............................................................35 3.3. Tác động của 5-ALA tới chuột bị bệnh tiểu đường ...........................................37 3.3.1. Đánh giá hàm lượng glucozo trong máu .........................................................39 3.3.2. Đánh giá hàm lượng insulin trong máu. ..........................................................40 3.3.3. Đánh giá hàm lượng HbA1c trong máu. .........................................................41 3.3.4. Tác động của 5-ALA đến tế bào thận và tụy trên chuột bị tiểu đường ..........................43 3.4. Tác động của 5-ALA tới các tế bào gan trên chuột bị tiểu đường ...............................46 3.4.1. Hoạt động của GOT trong bệnh tiểu đường....................................................46 3.4.2. Hoạt động của GPT trong bệnh tiểu đường ....................................................48 3.4.3. Hoạt động của ALP trong bệnh tiểu đường. ...................................................49 3.4.4. Hoạt động của Bilirubin trong bệnh tiểu đường. ............................................50 3.4.5. Tác động trên tế bào gan của 5-ALA ..............................................................52 3.5. Tác động của 5-ALA đến chỉ số cholesterol ......................................................53 KẾT LUẬN. .............................................................................................................55 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................57 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1:Tình hình tiểu đường một số vùng trên thế giới [4]....................................4 Hình 1.2: Tốc độ tăng trưởng tiểu đường ở Việt Nam [4]. ........................................5 Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của Insulin. .....................................................................9 Hình 1.4:Các giai đoạn tiến triển của tiểu đường typ 2 [9]......................................11 Hình 1.5:Cấu trúc phân tử của 5-Aminolevulinic axit .............................................18 Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..................................................23 Hình 3.1: Quy trình tách chiết 5-ALA từ lá ổi. ........................................................34 Hình 3.2: Sắc ký đồ của dịch chiết tổng số. ............................................................35 Hình 3.3: Sắc ký đồ của dịch chiết sau khi tinh sạch. .............................................35 Hình 3.4: Sắc ký đồ của 5-ALA chuẩn (sigma). .....................................................35 Hình 3.5: Bước sóng hấp thụ của 5-ALA. ..............................................................36 Hình 3.6: Đường chuẩn của 5-ALA. .......................................................................36 Hình 3.7.Dịch chiết sau tinh sạch được so sánh trênđường chuẩn 5-ALA ..............37 Hình 3.8: Nồng độ glucose trong máu của chuột khi uống 400mg/kg dịch chiết....38 Hình 3.9: Hàm lượng glucose trong máu .................................................................39 Hình 3.10: Hàm lượng insulin trong máu. ...............................................................40 Hình 3.11: Hàm lượng HbA1c trong máu................................................................41 Hình 3.12: Tiêu bản tế bào thận của các nhóm chuột ..............................................43 Hình 3.13: Tiêu bản tế bào tụy của các nhóm chuột ................................................45 Hình 3.14: Chỉ số GOT trong bệnh tiểu đường. ......................................................47 Hình 3.15: Chỉ số GPT trong bệnh tiểu đường ........................................................48 Hình 3.16: Chỉ số ALP trong bệnh tiểu đường. .......................................................49 Hình 3.17: Chỉ số Bilirubin trong bệnh tiểu đường .................................................50 Hình 3.18: Tiêu bản tế bào gan của các nhóm chuột ..............................................53 Hình 3.19: Chỉ số cholesterol ...................................................................................53 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tiểu đường theo IDF năm 2005[16]. ..............6 Bảng 1.2:Một số loại thực phẩm chứa 5-ALA[19]. .................................................20 Bảng 2.1: Công thức pha đệm đo Bilirubin ..............................................................31 Bảng 3.1: Diện tích các Pic ứng với các thể tích là 10, 20, 30, 40, 50µl và dịch chiết sau tinh sạch ..............................................................................................................37 BẢNG CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 5 – ALA 5 – Aminolevulinic acid  Tế bào beta- đảo tụy Langerhans ICA Islet cells antibodies (Kháng thể chống lại các cụm tế bào sản sinh ra insulin) HbA1c Hemoglobin A1c, Hemoglobin glycosylat LDL Low-density lipoprotein (Rối loạn mỡ máu) HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa kỳ) IDF International Diabetes Federation (Hiệp hội bệnh Tiểu đường Thế giới) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay MỞ ĐẦU Tiểu đường là sự rối loạn chuyển hóa carbohydrate do hormon insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể. Biểu hiện của bệnh là nồng độ đường trong máu cao vượt quá ngưỡng. Một trong những bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2011 toàn thế giới có 366 triệu người mắc bệnh tiểu đường. Theo IDF hiện nay có khoảng 415 triệu người[56]. Đây là một trong ba căn bệnh có tốc độ phát triển nhanh nhất và là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước đang phát triển. Ở Mỹ, theo thông báo của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC), bệnh tiểu đường tăng 14% trong 2 năm (2003-2005) và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở Mỹ. Dự tính tới năm 2040 sẽ lên tới 642 triệu người mắc tiểu đường. Trong đó, 90% là người bệnh mắc tiểu đường type 2.[3,5,6]. Việt Nam là nước đang phát triển cũng không nằm ngoài quy luật trên. Theo nghiên cứu của Bệnh viện Nội tiết Trung ương, năm 2002 cả nước chỉ có khoảng 2,7% dân số mắc bệnh tiểu đường nhưng đến năm 2012 điều tra tại 6 vùng trên cả nước tỷ lệ này đã tăng lên gần 5,7%[1]. Với nhu cầu điều trị bệnh tiểu đường, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được các công ty dược phẩm nghiên cứu và phát triển như Tolbutamid, Biguanid, Thiazolidindion. Tuy nhiên, các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối ưu với quốc gia đang phát triển như Việt Nam cũng như trên thế giới, lý do đưa ra là có nhiều tác dụng phụ. Thuốc có nguồn gốc thảo dược đang được các nước quan tâm và phát triển với những ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng.[4,6,8]. 1 Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm và mưa nhiều nên có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Có rất nhiều loại cây được sử dụng là những dược liệu quý. Đã có nhiều hoạt chất được tách chiết từ thực vật có tác dụng hỗ trợ điều trị căn bệnh tiểu đường được tìm thấy như: Mướp Đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), Húng Quế (Ocimum basilicum L.) thuộc họ Bạc Hà (Lamiaceae), lá cây Sung (Ficus glomerata L.)[13],… Do đó, chắc chắn trong thiên nhiên vẫn còn nhiều tiềm ẩn các hoạt chất có tác dụng chống bệnh tiểu đường đang chờ con người khám phá. Cây ổi (có tên khoa học là Psidium guajava L.) là thực vật họ Đào Kim Nương hay họ Sim. Các hoạt tính dược học của 5-Aminolevulinic axit từ lá ổi đã được chứng minh ở in vitro và in vivo. Khả năng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường của lá cây ổi đã được kiểm chứng trên nhiều nghiên cứu. Tuy nhiên, cho tới nay chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng hỗ trợ bệnh tiểu đường của 5-Aminolevulinic axit ở Việt Nam. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu tách chiết axit 5-Aminolevulinic trong lá ổi (Psidium guajava) và đánh giá tác động trên chuột bị tiểu đƣờng ”với mục tiêu: - Tách chiết 5-ALA từ lá ổi. - Đánh giá tác động của 5-ALA đối với chuột bị tiểu đường thông qua các chỉ số (glucozo, insulin, HbA1c). - Đánh giá khả năng bảo vệ của 5-ALA đến các cơ quan gan, thận và tụy đối với chuột bị tiểu đường. - Đánh giá tác động của 5-ALA đến chỉ số cholesterol đối với chuột bị tiểu đường. 2 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tiểu đƣờng Bệnh tiểu đường, theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), “là một hội chứng có đặc tính biểu hiện tăng glucose trong máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc vì có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin” [7,26,56]. Các chuyên gia thuộc “Ủy ban chẩn đoán và phân loại bệnh tiểu đường Hoa Kỳ” đưa ra định nghĩa về tiểu đường như sau: là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose trong máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin; khiếm khuyết trong hoạt động insulin; hoặc cả hai. Tăng glucose máu mãn tính thường dẫn đến sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim mạch và gan[54]. 1.1.1. Tình hình bệnh tiểu đƣờng trên thế giới và Việt Nam 1.1.1.1. Trên thế giới Tiểu đường là một bệnh có tốc độ phát triển rất lớn, là một trong ba bệnh (ung thư, tim mạch, tiểu đường) phát triển nhanh nhất. Mới đây Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã lên tiếng cảnh báo về mối lo ngại này trên toàn thế giới, theo như công bố bệnh có xu hướng tăng rõ rệt theo thời gian và sự tăng trưởng kinh tế. Ở các nước phát triển tiểu đường typ 2 chiếm 80 – 90% tổng số bệnh nhân bị bệnh [15]. Theo các nghiên cứu tại Mỹ (NHANES II) tỷ lệ tiểu đường ở người nghiên cứu từ 20-74 tuổi là 6,6% trong năm 1987 thì đến năm 2002 tăng lên 8,6% cho đến nay tỷ lệ này chiếm hơn 10% trong dân số nói chung. Tỷ lệ tử vong ở nhóm người từ 25-44 tuổi bị bệnh cao gấp 3,6 lần so với nhóm người không bị bệnh tiểu đường ở cùng nhóm tuổi [15]. 3 Tại các nước Châu Á, có khoảng 65 triệu người bị tiểu đường trong năm 1995, cho đến năm 2010 số người mắc bệnh đã tăng lên 130 triệu người (200%). WHO cảnh báo thế kỷ XXI chính là thế kỷ của đại dịch tiểu đường, tim mạch và ung thư. Tại Trung Quốc, tỷ lệ bệnh đang tăng một cách chóng mặt. Năm 1997, Trung Quốc có 16 triệu người mắc bệnh tiểu đường và dự đoán đến năm 2025 sẽ có khoảng 38 triệu người mắc bệnh [15]. Hình 1.1:Tình hình tiểu đƣờng một số vùng trên thế giới [4]. 1.1.1.2. Ở Việt Nam Qua thống kê ở một số bệnh viện lớn cho thấy tiểu đường là bệnh thường gặp nhất và có tỷ lệ tử vong cao nhất trong các bệnh nội tiết. Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi ở các vùng, Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh là hai thành phố có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất cả nước. Tỷ lệ tăng trung bình 170% mỗi năm. 4 Nam Nữ Hình1.2: Tốc độ tăng trƣởng tiểu đƣờng ở Việt Nam [58]. 1.1.2. Chẩn đoán và phân loại bệnh tiểu đƣờng 1.1.2.1. Chẩn đoán. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tiểu đường, được Hiệp hội tiểu đường Mỹ kiến nghị năm 1997 và được nhóm các chuyên gia về bệnh tiểu đường của WHO công nhận vào năm 1998, tuyên bố áp dụng vào năm 1999 [2,16] với 3 tiêu chí: Có các triệu chứng của tiểu đường lâm sàng; mức glucose trong máu ở thời điểm bất kì ≥ 11,1mmol/l (tương đương với 200mg/dl).Mức glucose trong máu lúc đói ≥ 7,0mmol/l (126mg/dl).Mức glucose trong máu ≥ 11,1mmol/l (200mg/dl) ở thời điểm 2 giờ sau khi cho dung nạp glucose bằng đường uống 75gam đường (loại anhydrous) hoặc 82,5 gam đường (loại monohydrat). 5 Bảng 1.1: Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tiểu đƣờng theo IDF[1]. Đặc điểm Khởi phát Tiểu đường typ 1 Tiểu đường typ 2 - Rầm rộ, kết hợp nhiều - Chậm, thường không có triệu triệu chứng chứng - Thể trạng béo - Tiền sử gia đình có người mắc bệnh tiểu đường typ 2. Biểu hiện lâm sàng - Sút cân nhanh chóng - Đặc tính dân tộc, có tỷ lệ - Đái nhiều mắc bệnh cao. - Uống nước nhiều - Chứng gai đen (Acanthosis nigricans) - Hội chứng buồng trứng đa nang. Nhiễm ceton - Dương tính - Thường không có C-peptid - Thấp/mất - Bình thường hoặc tăng - ICA dương tính - ICA âm tính - Anti-GAD dương tính - Anti-GAD âm tính Kháng thể - Thay đổi lối sống Điều trị - Dùng các thuốc hạ glucose - Bắt buộc dùng insulin máu bằng đường uống. - Dùng insulin Kết hợp với bệnh tự miễn - Có - Không khác 6 1.1.2.2. Phân loại:  Tiểu đƣờng typ 1 Phân loại theo hình thái miễn dịch Typ 1a: Chiếm 80%, loại này có các loại tự kháng thể kháng tế bào đảo tụy thoáng qua ngay từ lúc khởi đầu của bệnh. Loại này ít khi kết hợp với một bệnh tự miễn nào khác, thường có các gen kháng nguyên HLA-B15, HLADR4. Thường xảy ra sau khi bị nhiễm virus gây phá hủy tế bào β [13]. Typ 1b: Các kháng thể kháng tế bào đảo tụy dai dẳng với hàm lượng cao. Thường kết hợp với các rối loạn miễn dịch khác như bệnh lý tuyến giáp; bệnh tuyến vỏ thượng thận; giảm chức năng tuyến sinh dục; thiếu máu ác tính. Đa số người bệnh là nữ có gen kháng nguyên HLA-B8 và HLA-DR3 [13].  Tiểu đƣờng typ 2 Những rối loạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin ở gan, cơ vân, mô mỡ và sự suy chức năng của tế bào β, dẫn tới rối loạn bài tiết insulin [13].  Tiểu đƣờng typ 3(bệnh tiểu đƣờng thai kỳ) Là một tình trạng mà phụ nữ có thể gặp phải được khi họ đang ở trong giai đoạn tam cá nguyệt thứ 2 của thai kỳ (ba tháng giữa thai kỳ). Khoảng 4% của tất cả các phụ nữ mang thai có thể mắc bệnh tiểu đường thai kỳ. Không giống như bệnh tiểu đường loại 1 và loại 2, bệnh tiểu đường lúc mang thai sẽ biến mất sau khi em bé được sinh ra. Khi một người phụ nữ có một sự xuất hiện của bệnh tiểu đường thai kỳ trong thời gian mang thai, cô ấy có nhiều khả năng mắc tiểu đường thai kỳ một lần nữa trong lần mang thai tiếp theo và người phụ nữ đó có nguy cơ cao 7 phát triển bệnh tiểu đường loại 2 sau này trong đời. Phụ nữ mang thai ở tuổi cao hơn có nguy cơ mắc tiểu đường thai kỳ cao hơn 1.1.3. Sinh lý bệnh tiểu đƣờng. 1.1.3.1.Điều hòa cân bằng glucose trong máu. Trong điều kiện sinh lý bình thường, glucose máu khoảng 5,6mmol/l (100mg/dl). Khi cơ thể sử dụng nhiều gluxit (lao động nặng, hưng phấn thần kinh, sốt,…) glucose trong máu có thể lên tới 6,7-8,3mmol/l (120-150 mg/dl). Trong trạng thái ngủ nghỉ glucose trong máu có thể giảm tới 4,5mmol/l (80mg/dl). Nếu vượt quá 8,9mmol/l (160mg/dl) thì glucose bị đào thải qua thận, nếu giảm xuống dưới 3,3 mmol/l (60mg/dl) thì các tế bào thiếu năng lượng, có thể dẫn tới hôn mê. Bằng cơ chế điều hòa, cơ thể người bình thường được duy trì lượng glucose trong máu khoảng 4,5-6,7mmol/l (80-120mg/dl). Cơ chế điều hòa được kiểm soát bởi hệ nội tiết và hệ thần kinh [2].  Vai trò điều hòa của hệ nội tiết Một số nội tiết có tác dụng lên enzym chuyển hóa gluxit qua đó tác động đến sự cân bằng glucose trong máu [13]. Có hai nhóm nội tiết kiểm soát đối lập nhau: - Insulin làm giảm glucose trong máu. - Tập hợp các nội tiết và các chất làm tăng glucose trong máu.  Insulin Insulin do tế bào β của đảo Langerhans tiết ra có tác dụng làm giảm glucose trong máu. Insulin là một protein gồm 51 axit amin, được chia thành từ 2 chuỗi alpha (21 axit amin) và β (gồm 30 axit amin), được nối với nhau bằng các cầu nối S-S. Thời gian bán hủy của insulin là 3-5 phút [13]. 8 Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của Insulin.[13] Trung bình mỗi ngày tụy tiết ra 40-50 đơn vị insulin (IU), để đảm bảo nồng độ glucose trong máu được duy trì giới hạn từ 4,4-5,3mmol/l (80-95 mg/dl). Nồng độ insulin cơ bản trong máu cũng đảm bảo sự bài tiết của gan với tỷ lệ 1,9-2,1mg/kg/phút [2,16].  HbA1c(Hemoglobin glycosylat)[33] Glucose trong máu có thể gắn kết với hemoglobin (phần mang oxy) của hồng cầu để tạo nên một phức hợp gọi là HbA1c (Hemoglobin glycosylat). Một khi glucose gắn kết với hemoglobin, nó sẽ ở đó và tồn tại đến hết đời sống của hồng cầu kéo dài khoảng 3 tháng. Như vậy nếu nồng độ glucose trong máu càng cao thì lượng glucose gắn vào hemoglobin của hồng cầu càng nhiều, và như vậy nồng độ HbA1c cũng sẽ gia tăng. Định lượng HbA1C đánh giá tình trạng đường trong máu 2-3 tháng gần đây. Chỉ số HbA1c là chỉ số hữu hiệu trong việc phát hiện sớm và chẩn đoán chính xác bệnh tiểu đường. Do tại thời điểm đó, người bệnh có chỉ số đường huyết bình thường nhưng chỉ số HbA1c cao, chứng tỏ đường huyết không được kiểm soát tốt trong một thời gian dài. Đây là dấu hiệu cảnh báo nguy cơ mắc bệnh tiểu đường và cần 9 được tiến hành lặp lại các xét nghiệm để có chẩn đoán chính xác nhất. Dựa vào chỉ số HbA1c còn có thể đánh giá được hiệu quả phác đồ điều trị đối với bệnh nhân tiểu đường bao gồm chế độ ăn uống, luyện tập, thuốc điều trị, thực phẩm hỗ trợ trong một lộ trình điều trị, từ đó có sự điều chỉnh phù hợp và hiệu quả. Tuy nhiên HbA1c không phải là chỉ số theo dõi đường hàng ngày, do đó không được sử dụng để hiệu chỉnh liều insulin cũng như tình trạng hạ đường huyết. Bệnh nhân cần thường xuyên theo dõi đường huyết hàng ngày để hiệu chỉnh liều insulin phù hợp và phát hiện sớm tình trạng hạ đường huyết để có biện pháp điều trị kịp thời. 1.1.3.2. Cơ chế bệnh tiểu đƣờng  Cơ chế bệnh tiểu đƣờng typ 1 Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, bệnh phát tự nhiên, ít phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Các gen có liên quan là HLA-DR3, HLA-D4 và DQW-8, còn gen kháng là HLA-DRW2, B7 [2]. Bệnh gặp ở 0,2-0,5% số người trong quần thể và chiếm 5-10% số người mắc bệnh tiểu đường. Các giai đoạn trong tiểu đường typ 1 [16]: - Giai đoạn 1. Bản chất di truyền - nhạy cảm gen. - Giai đoạn 2. Khởi phát quá trình tự miễn. - Giai đoạn 3. Phát triển một loạt các kháng thể. - Giai đoạn 4. Tổn thương chức năng tế bào β đảo tụy. - Giai đoạn 5. Tiểu đường lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn tế bào β đảo tụy. Biểu hiện lâm sàng là tiểu đường phụ thuộc insulin có kèm biến chứng.  Cơ chế sinh bệnh tiểu đƣờng typ 2 Sinh bệnh học tiểu đường typ 2 diễn tiến qua 3 giai đoạn: 10 - Giai đoạn 1. Nồng độ glucose máu vẫn ở mức bình thường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thường ở trong máu. - Giai đoạn 2. Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần và xuất hiện tăng glucose trong máu sau bữa ăn. - Giai đoạn 3. Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin suy giảm và gây tăng glucose trong máu lúc đói. Bệnh tiểu đường biểu hiện ra bên ngoài. Hình1.4:Các giai đoạn tiến triển của tiểu đƣờng typ 2 [9]. Trong số các yếu tố, yếu tố môi trường đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh tiểu đường thì béo phì là yếu tố thường được đề cập nhất. Béo phì làm gia tăng tình trạng kháng insulin. Nhiều bằng chứng cho thấy kiểm soát tốt tình trạng tăng cân sẽ làm giảm đáng kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát glucose trong máu tốt [6,16]. Tóm lại sự thiếu hụt trong bài tiết insulin và tình trạng kháng insulin là nguyên nhân gây tiểu đường typ 2 và béo phì là yếu tố thúc đẩy phát triển bệnh. 11 1.2. Thuốc trị tiểu đƣờng Trước sự phát triển nhanh chóng của bệnh tiểu đường, nhu cầu thuốc điều trị là rất lớn. Trên thị trường hiện nay có nhiều loại thuốc khác nhau chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc tổng hợp và bán tổng hợp, dựa vào tác dụng và cơ chế có thể chia thành 3 nhóm sau đây: - Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin. - Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin. - Các thuốc chống tăng glucose trong máu sau bữa ăn 1.2.1. Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin Insulin điều hòa glucose trong máu chủ yếu tại các mô đích là gan, cơ và mô mỡ. Sau khi bài tiết, insulin đến các mô đích gắn vào thụ thể (receptor) đặc hiệu là một glycoprotein gồm hai đơn vị α (nằm ngoài tế bào) và hai đơn vị β (nằm trong tế bào) được nối với nhau bằng cầu disulfid. Insulin gắn vào phần thụ thể α, kích thích tyrosin kinase của thụ thể β trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng làm tăng tính thấm màng tế bào với glucose, giúp glucose vận chuyển vào tế bào nhanh hơn. Sau khi vào tế bào, glucose được phosphoryl hóa thành glucose-6 phosphat (G6P); từ đó G6P chuyển thành glycogen dự trữ hoặc tiếp tục bị oxy hóa để cung cấp năng lượng cho cơ thế [4,3,14]. Các nhóm sulfonylurea: gắn vào các thụ thể của nó ở các tế bào β đảo tụy làm chặn kênh K+, gây khử cực màng tế bào. Kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế mở ra cho phép Ca2+ vào trong tế bào. Nồng độ Ca2+ trong tế bào tăng, khởi động vận chuyển các hạt chứa insulin đến bề mặt tế bào và giải phóng insulin ra ngoài. [6,7,13]. Nhóm Nateglinid (Starlig): Trong cơ thể Nateglinid gắn vào thụ thể đặc hiệu (SUR1) ở tế bào beta đảo tụy làm chặn kênh Ca2+, Ca2+ từ ngoài vào trong tế bào kích thích giải phóng insulin [6,16]. 12