Tài liệu Nghiên cứu sự lưu hành của gene netb ở các chủng clostridium perfringens type a gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố nha trang

i LỜI CẢM ƠN Được sự phân công của ban giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và được sự đồng ý của Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cho phép tôi thực tập tại Bộ môn nghiên cứu Vi trùng từ 2/2012 đến 5/2012. Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, toàn thể quý thầy cô giáo đã tạo điều kiện và truyền đạt rất nhiều kiến thức cho tôi cũng như các thành viên trong lớp 50CNSH trong suốt 4 năm học. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Lập, TS. Vũ Ngọc Bội cùng BS. Lê Đình Hải đã tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Phân viện Thú y miền Trung, các anh chị trong Bộ môn Vi trùng học đã rất nhiệt tình, tạo một môi trường thuận lợi, học hỏi cao trong suốt thời gian tôi thực tập tại Viện. Xin gửi lời cảm ơn đến nhóm bạn “Tùng – Tiến - Linh - Chi” đã luôn đồng hành chia sẽ khó khăn, niềm vui và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Để hoàn thành đề tài này, ngoài một phần nỗ lực của bản thân thì sự động viên của gia đình và bạn bè là nguồn lực to lớn không thể thiếu với tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn! Do trình độ kiến thức còn hạn chế, lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học. Kính mong nhận được sự thông cảm, góp ý nhiệt tình của Quý thầy cô giáo, các cô chú, anh chị và toàn thể các bạn để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Xin được chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 11 tháng 5 năm 2012 Sinh viên thực hiện Lại Nhật Linh GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh ii MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH .............................................................. v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... vii LỜI NÓI ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà............... 4 1.1.1 Trên thế giới ............................................................................................................... 4 1.1.2 Ở Việt Nam................................................................................................................. 7 1.2. Vi khuẩn C. perfringens [29].............................................................................................. 7 1.2.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................................... 8 1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học ................................................................................................... 8 1.2.3. Đặc tính di truyền ........................................................................................................ 9 1.3. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens .................................................................................. 10 1.4. Các loại độc tố của C. perfringens [15] ............................................................................. 11 1.4.1 Alpha toxin ................................................................................................................ 11 1.4.2. Beta toxin .................................................................................................................. 12 1.4.3. Epsilon toxin.............................................................................................................. 12 1.4.4. Iota toxin ................................................................................................................... 13 1.4.5. Enterotoxin (CPE)...................................................................................................... 13 1.4.6. Delta toxin ................................................................................................................. 14 1.4.7. Theta toxin................................................................................................................. 14 1.5. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens và khả năng gây bệnh ................................... 14 1.6. Phản ứng PCR [3] [5] ...................................................................................................... 18 1.6.1. Nguyên tắc phản ứng ............................................................................................... 18 1.6.2. Các điều kiện của phản ứng PCR ............................................................................ 21 1.6.3. Các hạn chế của phản ứng PCR .............................................................................. 22 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh iii 1.6.4. 1.7. Phản ứng Multiplex PCR ......................................................................................... 24 Điện di [3] [5] ................................................................................................................... 24 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................. 26 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................. 26 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................................... 26 2.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................................ 26 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ............................................................................................ 26 2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử ................................................................................... 26 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ...................................................................................................... 26 2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học 27 2.4.3. Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi [4] [7] .......................................... 28 2.4.4. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn [4] [7] ........................................................ 28 2.4.5. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học ............................................................................ 28 2.4.6. Phương pháp giữ giống vi khuẩn C. perfringens............................................................... 29 2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR [11] [25].. 30 2.4.8. Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR [8] .......................................... 32 2.4.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................................. 33 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 34 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang ................... 34 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang ........................ 34 3.1.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens phân lập được.............................................................................................................................................. 35 3.1.2.1. Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn C. perfringens ............................................................ 35 3.1.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di đông của vi khuẩn C. perfringens bằng phương pháp soi tươi ............................................................................................................................................... 36 3.1.2.3. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn C. perfringens phân lập được trên một số môi trường ................................................................................................................................ 36 3.1.2.4. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens ......................................... 37 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh iv 3.2. Kết quả xác định type độc tố vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR ................ 40 3.3. Kết quả xác định gene độc tố netB bằng kỹ thuật PCR ............................................................ 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 44 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh v DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG 1.1. Vị trí gene mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 1.2. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 1.3. Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.1. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.2. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.3. Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C. perfringens BẢNG 2.4. Trình tự cặp mồi của gene netB BẢNG 2.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định gene netB BẢNG 2.6. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR xác định gene netB BẢNG 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens từ mẫu phân thu được BẢNG 3.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens BẢNG 3.3. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh vi DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH 1.1. Vi khuẩn C. perfringens gây bệnh NE trên gà HÌNH 1.2. Các điểm tổn thương ruột gà do vi khuẩn C. perfringens HÌNH 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi PCR HÌNH 1.4. Các chu kỳ của phản ứng PCR HÌNH 3.1. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn C. perfringens HÌNH 3.2. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC agar HÌNH 3.3. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường thạch máu HÌNH 3.4. Kết quả kiểm tra lên men đường HÌNH 3.5 Kết quả nuôi cấy trên môi trường Litmus milk HÌNH 3.6. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường Egg yolk HÌNH 3.7. Kết quả CAMP - test HÌNH 3.8. Kết quả điện di định type vi khuẩn C. perfringens HÌNH 3.9. Kết quả điện di xác định gene netB của vi khuẩn C. perfrienges type A GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C. perfringens Clostridium perfringens E. coli Escherichia coli Taq Thermus aquaticus SPS agar Perfringens Selective Agar TSC agar Tryptose – Sulfit – Cycloserin Agar PCR Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxynucleotide Triphosphate TBE Tris Boric EDTA DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid M Maker – Thang chuẩn DNA Cpa Gene mã hóa C. perfringens alpha toxin Cpb Gene mã hóa C. perfringens beta toxin Ext Gene mã hóa C. perfringens Epsilon toxin Itx Gene mã hóa C. perfringens iota toxin Cpe Gene mã hóa C. perfringens enterotoxi GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 1 LỜI NÓI ĐẦU Ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm có vai trò quan trọng trong hệ thống nông nghiệp, góp phần mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người chăn nuôi. Sản phẩm của ngành chăn nuôi không những là nguồn cung cấp thực phẩm, nguyên liệu cho công nghiệp chế biến mà phế phẩm của nó còn được tận dụng cho các ngành khác… Tại Hội nghị triển khai chiến lược phát triển chăn nuôi tại các tỉnh phía Nam đã đề ra chỉ tiêu tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42%. Trong đó, năm 2010 đạt khoảng 32% và năm 2015 đạt 38%. Muốn đạt được kế hoạch đó thì phải đầu tư hơn nữa cho ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt chăn nuôi gà mang một ý nghĩa to lớn. Những người chăn nuôi, đặc biệt là ở nông hộ, khi mà có quá nhiều khó khăn đến từ vốn, con giống, thức ăn... thì họ còn phải đối mặt thêm một vấn đề nữa liên quan đến công tác thú y, đó là dịch bệnh. Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis - NE) do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm xảy ra ở gia cầm nói chung và loài gà nói riêng, đặc biệt là ở các nước có ngành chăn nuôi gia cầm phát triển như Việt Nam. Bệnh rất khó phát hiện các biểu hiện lâm sàng và khi đã phát hiện được thì không có khả năng cứu chữa. Vi khuẩn C. perfringens là loại trực khuẩn yếm khí Gram dương, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi đứng song song. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta chia vi khuẩn này thành 5 type là A, B, C, D, E. Mỗi type sản sinh ra một độc tố khác nhau và gây ra các bệnh khác nhau trên các đối tượng động vật khác nhau. Type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta và epsilon; type C sản sinh độc tố alpha và beta; type D sản sinh độc tố alpha và epsilon; type E sản sinh độc tố alpha và iota. Ngoài ra C. perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,….. Khi cơ thể gà gặp các điều kiện bất lợi như thức ăn kém phẩm chất, thay đổi khẩu phần ăn đột ngột,... vi khuẩn C. perfringens có mặt ở đường tiêu hóa của gia cầm sẽ tăng sinh về số lượng và sản sinh độc tố gây bệnh. Gà mắc bệnh viêm ruột GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 2 hoại tử thường xuất hiện các triệu chứng như ủ rũ, biếng ăn, xù lông và xả cánh. Bệnh thường xảy ra ở hai thể cấp tính và mãn tính. Thể cấp tính chủ yếu xuất hiện trên gà từ 2- 4 tuần tuổi; con vật mắc bệnh bị mất nuớc, tiêu chảy, phân có màu sẫm và có mùi thối khắm. Bệnh tích bao gồm các điểm hoại tử xuất huyết ở ruột non, đặc biệt là ở ruột chay (jejunum) và ruột hồi (ileum). Thể mãn tính với các bệnh tích hoại tử điểm hoặc hoại tử dạng sợi ở ruột non, nếu con vật còn sống thì tạo thành các đám loét. Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ chăn nuôi và các trang trại chăn nuôi có thể lên đến 50%. Những nghiên cứu trước đây cho rằng độc tố alpha do vi khuẩn C. perfringens type A sản sinh là nguyên nhân chính gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Những năm gần đây, bằng thực nghiệm gây đột biến gene mã hóa độc tố anpha, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng alpha toxin không phải là độc tố quyết định khả năng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử, các tác giả đã phát hiện một loại độc tố mới, độc tố netB, là tác nhân chính gây ra các bệnh tích điển hình của bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là vai trò gây bệnh viêm ruột hoại tử của các loại độc tố do vi khuẩn C. perfringens sản sinh ở mức phân tử. Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Ban Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, đã cho tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự lƣu hành của gene netB ở các chủng Clostridium perfringens type A gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang”. Nội dung của đề tài: - Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ mẫu phân của gà khỏe và gà mắc bệnh viêm ruột hoại tử. - Xác định các type độc tố của Clostridium perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR. - Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR. Mục tiêu của đề tài GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 3 Để tìm hiểu về bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang và sự lưu hành của gene netB trong các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà mắc bệnh. Phát hiện sự lưu hành của gene mã hóa độc tố netB trong các chủng Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà từ đó có thể đề xuất các biện pháp điều trị bệnh có hiệu quả và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C. perfringens gây ra. GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 1.1.1 Trên thế giới Kể từ khi lệnh cấm sử dụng chất kháng sinh để thúc đẩy tăng trưởng trong thức ăn chăn nuôi của Liên minh Châu Âu EU được ban hành, bệnh viêm ruột hoại tử đã trở thành nguyên nhân chính gây tử vong ở gà. Viêm ruột hoại tử là một trong những bệnh phổ biến nhất và gây thiệt hại tài chính đáng kể, trung bình thiệt hại 0,05USD cho mỗi con gia cầm, và có thể lên đến 2 tỷ USD hàng năm. Bệnh có thể gây ra tỷ lệ chết lên đến 50% hoặc làm giảm đáng kể hiệu suất tăng trưởng. [8] Bệnh NE là một bệnh đa yếu tố phức tạp với nhiều yếu tố không rõ ràng ảnh hưởng đến sự xuất hiện của nó và mức độ nghiêm trọng của dịch bệnh. Đặc biệt các dịch lẻ tẻ của NE có thể xảy ra thường xuyên trong các trang trại trong đó thuốc kháng sinh không được sử dụng như kích thích tăng trưởng, thực hành chăn nuôi không nghiêm ngặt và chế độ ăn uống dựa trên các loại ngũ cốc nhớt với các nguồn protein động vật là phổ biến.[9] Hình 1.1 Vi khuẩn C. perfringens gây bệnh NE trên gà Theo báo cáo của Long J.R. (1973) bệnh NE được biết đến lần đầu tiên vào năm 1961, bệnh xảy ra trên gà trống non từ 6 – 7 tuần tuổi tại Anh, sau đó xuất hiện tại Australia, Canada, Mỹ và Thụy Điển. [25] Viêm ruột hoại tử đã được đề cập trong các báo cáo ở châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Trung Đông, châu Á và New Zealand. Bệnh xảy ra trên gà thịt và gà tây từ 3 – 7 tuần tuổi. Bệnh do vi khuẩn C. perfringens gây ra, một loại vi khuẩn khá phổ biến được tìm thấy trong đất, bụi, rác và một lượng nhỏ trong đường tiêu hóa của gà khỏe mạnh. Vi khuẩn C. perfringens chỉ gây bệnh khi số lượng của nó tăng GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 5 lên đột ngột và điều kiện sức khỏe vật nuôi không tốt, khi đó lượng độc tố ngoại bào được sinh ra vượt quá mức cho phép sẽ tấn công và gây ra các tổn thương bệnh lý ở đường tiêu hóa. Phần lớn các nghiên cứu về NE đã tập trung vai trò của độc tố mang tính quyết định đối với khả năng gây bệnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh NE chủ yếu được gây ra bởi C. perfringens type A và một số lượng nhỏ gia cầm bị bệnh là do type C [17]. Độc tố alpha được coi là nguyên nhân gây bệnh chính. Tại các trang trại gà ở Cario – Ai Cập bị bệnh NE, Effat và cộng sự (2007) đã phân lập C. perfringens từ các mẫu gà bị bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả những vi khuẩn phân lập được đều là C. perfringens, có khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu cừu với hai vòng dung huyết. Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota. Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh NE ở các trang trại này. [14] Theo nghiên cứu của George Tice về “Sự tồn tại của Clotridia và sự bất ổn định của đường ruột” đã cung cấp thêm nhiều thông tin có giá trị liên quan đến nguyên nhân gây bệnh. Trong đó ngoài việc chỉ ra rằng sự tồn tại của chủng C. perfringens type A sản sinh độc tố alpha có liên quan đến bệnh NE và chế độ ăn uống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của bệnh. Gà được sinh ra với một đường ruột vô trùng và hai tuần đầu tiên sau khi sinh hệ đường ruột có một lượng lớn oxy đã ức chế sự sinh sản của các vi khuẩn yếm khí Clotridia. Sau hai tuần, lượng oxy trong ruột bắt đầu giảm, đồng thời Clotridia sinh sôi nảy nở và dẫn đến tình trạng bệnh lâm sàng. Trong nghiên cứu cũng đề cập đến bệnh lâm sàng không dẫn đến tử vong và được đặc trưng bởi viêm loét đầu mối ở tá tràng và ruột chay.[24] GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 6 Hình 1.2 Các điểm tổn thƣơng ruột gà do vi khuẩn C. perfringens Một nghiên cứu của các nhà khoa học Australia đã thử nghiệm vai trò gây bệnh của độc tố alpha sau khi gene này bị gây đột biến. Nghiên cứu được tiến hành ở 3 nhóm gà: nhóm 1 gây bệnh bằng vi khuẩn C. perfringens mang gene cpa hoang dại, nhóm 2 gây bệnh bằng C. perfringens mang gene cpa đã gây đột biến không có khả năng biểu hiện gene này nên không thể sản sinh độc tố alpha và nhóm 3 dùng làm đối chứng. Kết quả đã chỉ ra rằng biểu hiện bệnh NE ở gà không phụ thuộc vào vi khuẩn C. perfringens sản sinh độc tố alpha. Như vậy chắc chắn rằng độc tố alpha không phải là một tác nhân gây bệnh chủ yếu của bệnh NE. [18] Năm 2008, Anthony Keyburn và cộng sự đã có một phát hiện đột phá rằng độc tố alpha không phải là yếu tố chính gây bệnh NE trên gà mà do một loại độc tố mới, được đặt tên là netB gây ra. [13] Kể từ lần đầu tiên phát hiện ra gene netB năm 2008, sự hiện diện của gene netB đã được sàng lọc trong số nhiều chủng C. perfringens phân lập từ Australia, Canada, Mỹ và một số nước châu Âu. Nghiên cứu của A.Tolooe và cộng sự (2011) đã lần đầu tiên báo cáo sự hiện diện của gene netB giữa chủng C. perfringens phân lập từ châu Á. Theo A.Tolooe và cộng sự thì tỷ lệ các chủng mang gene mã hóa độc tố netB là 52,80%, trong số đó chủ yếu là các chủng phân lập từ gà có triệu chứng của bệnh NE. Trong một cuộc khảo sát ở Bắc Mỹ đã chỉ ra rằng phần lớn các chủng C. perfringens phân lập từ gà có biểu hiệu lâm sàng của bệnh NE mang gene netB (58,30%) trong khi chỉ có một tỷ lệ nhỏ (8,60%) chủng C. perfringens phân lập từ gà khỏe mạnh mang gene này. Tỷ lệ cao nhất (>90%) cho kết quả dương tính GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 7 với gene netB được tìm thấy từ chủng C. perfringens phân lập từ một đàn gà thịt bị bệnh ở Thụy Điển. Tuy nhiên trong cùng một đàn gà, khoảng 25% cũng cho kết quả dương tính với gene netB ở gà khỏe mạnh.[8] 1.1.2 Ở Việt Nam Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do vi khuẩn C. perferingens vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi và quy mô ở nước ta. Hiện nay mới chỉ có một vài nghiên cứu về C. perfringens gây bệnh trên bò, dê, cừu và lợn. Các nghiên cứu chủ yếu xác định sự có mặt và định type độc tố trên các chủng C. perfringens được phân lập. Theo TS. Lê Lập và cộng sự (2007) khi phân lập và định type độc tố của vi khuẩn C. perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Tác giả cho biết những chủng vi khuẩn phân lập từ phân đều thuộc type A mang gene cpa mã hóa độc tố alpha, những chủng phân lập từ nội tạng của dê, cừu bị bệnh lại thuộc type D mang gene cpa và etx. [2] Theo tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009) hội chứng tiêu chảy ở lợn đã được nhiều tác giả trong nước nghiên cứu. Tuy nhiên các nghiên cứu đầy đủ về vai trò gây tiêu chẩy ở lợn của vi khuẩn C. perfringens so với E.coli và Salmonella chưa có nhiều, tác giả đã kết luận C. perfringens đóng vai trò quan trọng trong hội chứng tiêu chảy ở lợn. Tần suất phân lập được C. perfringens ở lợn bị bệnh là 55,60%. Khi lợn chết vì tiêu chảy với triệu chứng và bệnh tích đặc trưng thì tỷ lệ phân lập được vi khuẩn C. perfringens ở ruột là 88,91%.[1] Đặc biệt là các nghiên cứu về gene netB chưa được nghiên cứu ở Việt Nam, có thể do C. perfringens là vi sinh vật kỵ khí nên quá trình nghiên cứu, phân lập gặp nhiều khó khăn hơn so với các vi sinh vật hiếu khí khác. Đồng thời sự hạn chế về các phương tiện nghiên cứu hiện đại cũng khiến cho việc nghiên cứu về nó trở nên khó khăn hơn. 1.2. Vi khuẩn C. perfringens [29] C. perfringens lần đầu tiên được phát hiện bởi Feser vào năm 1865, sau đó nhiều nghiên cứu của các tác giả khác về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra. C. perfringens phân bố rộng khắp trong môi trường đất, nước, không khí và thường được tìm thấy trong ruột động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì vi khuẩn phát triển và sản sinh độc tố gây bệnh trong cơ thể vật chủ. C. perfringens đã được phân GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 8 lập bởi Welch và Nuttall (năm 1892) từ vết thương bị hoại tử và được đặt tên là Baccillus aerogenes capsulatus. Sau đó đổi thành Bacillus perfringens, tiếp theo là Clostridium welchii và hiện nay là Clostridium perfringens. Hệ thống phân loại khoa học của C. perfringens: Giới (Regnum): Bacteria Ngành (Phylum): Firmicutes Lớp (Class): Clostridia Bộ (Order): Clostridiales Họ (Familia): Clostridiaceae Chi (Genus): Clostridium Loài (Species): C. perfringens 1.2.1. Đặc điểm hình thái C. perfringens là trực khuẩn Gram dương, hình que, yếm khí và có khả năng tạo nha bào. C. perfringens có kích thước lớn (0,6 – 0,24 x 1,3 – 19 µm), không di động. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường thạch máu có dạng tròn, nhẵn, bóng, được bao bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài không dung huyết hoàn toàn (do độc tố alpha). Người ta gọi hiện tượng này là hiện tượng dung huyết beta trên môi trường có bổ sung máu động vật. Vi khuẩn C. perfringens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 12 - 50oC, phát triển chậm ở 20oC và ở 43 - 47oC vi khuẩn phát triển nhanh cực độ, có thể tạo ra một thế hệ trong 8 - 10 phút. Vi khuẩn phát triển ở pH 5 - 8 và hoạt tính nền của nước là 0,93 – 0,97. C. perfringens có thể sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt nhờ sự biến đổi thích nghi của hệ thống biến dưỡng tế bào với khả năng chịu đựng cao và sản sinh nha bào. Nha bào có thể sống sót trong những môi trường khắc nghiệt như nóng, khô, acid, chất tẩy rửa. 1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nhưng điều kiện nuôi cấy yếm khí không đòi hỏi khắt khe như các vi khuẩn khác. GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 9 - Điều kiện nuôi cấy: C. perfringens phát triển tốt ở môi trường yếm khí, thông thường từ 2 - 10% CO2. - Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp là 37 - 42oC. - Vi khuẩn này có thể phát triển trên các môi trường: Môi trường Fluid Thioglycollate: Sau 6 - 8 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường. Môi trường SPS agar hoặc TSC agar: Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn, màu đen do vi khuẩn sinh H2S kết hợp với Fe có sẵn trong môi trường tạo thành kết tủa FeS có màu đen. Môi trường Blood agar: Sau 24 – 48 giờ nuôi cấy ở 37oC, thu được khuẩn lạc C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng dung huyết kép (vòng bên trong dung huyết hoàn toàn - do độc tố theta và một vòng bên ngoài dung huyết không hoàn toàn – do độc tố alpha). Đây là hiện tượng dung huyết beta trên môi trường thạch máu. Môi trường Litmus milk: Vi khuẩn phát triển tạo thành dạng vẩn mây điển hình do đường lactose trong môi trường kiềm bị lên men, tạo ra acid, làm đông vón casein dẫn đến đổi màu môi trường từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH Litmus. Sau đó, các đám vẩn acid bị vỡ nứt ra do sự hình thành hơi. Môi trường Egg yolk: Vi khuẩn phát triển sản sinh men lecithinase phân giải lecithine tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc. Phản ứng CAMP test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C. perfringens và S. agalactiae trên môi trường thạch máu thành một đường vuông góc thì các khuẩn lạc của S. agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng dung huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố alpha của C. perfringens. Môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm đục môi trường. 1.2.3. Đặc tính di truyền Trong các loài có khả năng gây độc của chi Clostridium, C. perfringens là loài điển hình cho các nghiên cứu di truyền vì tốc độ tăng trưởng nhanh và khả năng thao tác di truyền dễ dàng. Năm 2002, cấu trúc genome hoàn chỉnh của chủng C. perfringens đã được công bố bởi Shimizu và cộng sự. Bộ nhiễm sắc thể của chủng GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 10 này gồm 3031430 bp, với 2660 vùng mã hóa cho các protein và 10 loại rRNA, tổng hàm lượng G + C là 28,6%. Khi cấu trúc genome của C. perfringens được so sánh với genome của những vi khuẩn không gây bệnh như C. acerabutylicum, sự khác biệt rõ ràng nhất có liên quan đến các gene sinh độc tố của C. perfringens. Ngoài các gene độc tố đã biết, Shimizu cũng tìm thấy nhiều gene gây độc khác kết hợp trong hệ gene của C. perfringens. Năm gene dung huyết đã được xác định dựa trên sự tương đồng về khả năng dung huyết đã được mô tả trong các loài vi khuẩn đã phân loại trước đây. Hai type có gene quy định protein liên kết với fibronectin là tương đồng với gene của vi khuẩn Listeria monocytogenes và Bacillus subtilis đã cho thấy có sự liên quan đến các yếu tố gây độc. Trình tự genome của C. perfringens cho thấy các gene độc lực không có tác động cộng gộp với nhau. Chỉ có một vài yếu tố di truyền di động có thể được phát hiện và những dấu hiệu của gene theo chiều ngang là khó phát hiện trong genome của C. perfringens. Do đó, có thể thấy rằng các type độc tố khác nhau của C. perfringens được tiến hóa từ type A bằng cách nhiễm vào các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể nhẹ plasmid và gene nhảy. Gene mã hóa độc tố alpha và theta nằm trên nhiễm sắc thể, nhiều gene mã hóa các loại độc tố khác cũng nằm trên plasmid. Gene mã hóa độc tố enterotoxin có thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Biểu hiện của alpha toxin và theta toxin được quy định bởi một hệ thống dẫn truyền tín hiệu hai thành phần (VirR/ VirS), một bộ cảm biến histidine kinase, VirS và các yếu tố cần thiết cho một phản ứng, VirR. Cơ chế điều hòa xảy ra ở cấp độ phiên mã các các đột biến có thể thay đổi việc sản sinh cả độc tố alpha và theta. 1.3. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens Vi khuẩn C. perfringens có ở khắp nơi trong thiên nhiên và là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của người và động vật. Thường có hai dạng cơ bản hình thành nên bệnh là vi khuẩn có sẵn trong ruột hoặc thức ăn bị nhiễm vi khuẩn này. Ngoài ra, những thay đổi về thành phần môi trường, khẩu phần thức ăn thay đổi đột ngột như cho ăn quá nhiều, thức ăn chứa quá nhiều protein và năng lượng cũng là những nguyên nhân gây bệnh. Hoặc do vận động quá mức đã làm GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 11 chậm nhu động ruột, giữ lại lâu các vi khuẩn trong ruột làm tăng sự hấp thụ của độc tố. Carbonhydrate không tiêu hóa được là môi trường thuận lợi cho C. perfringens phát triển nhanh chóng. Một số tác giả khác lại cho rằng C. perfringens thường xuyên sống cộng sinh ở dạ dày. Bình thường vi khuẩn này cũng có nhiều ở ruột già, nhưng trong những điều kiện thuận lợi thì nó phát triển quá mức, có thể xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc tố ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân chính gây bệnh. 1.4. Các loại độc tố của C. perfringens [15] Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau như alpha, beta, epsilon, iota, beta 2… Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta phân chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố khác nhau là A, B, C, D và E. Trong đó type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha, beta; type D sản sinh độc tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha, iota. Gene mã hóa các loại độc tố có thể nằm ở nhiễm sắc thể, ở plasmid hoặc ở cả nhiễm sắc thể/ Plasmid. Bảng 1.1. Vị trí gene mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. Perfringens Độc tố Gene Vị trí của gene Alpha Cpa Nhiễm sắc thể Beta Cpb Plasmid Espilon Etx Plasmid Iota iA Plasmid Beta 2 Cpb2 Plasmid Enterotoxin Cpe Nhiễm sắc thể/ Plasmid 1.4.1 Alpha toxin Đây là loại độc tố gây chết chính, có hoạt tính enzyme phospholipase C. Nó có khả năng thủy phân màng phospholipid của các loại tế bào khác nhau, làm tan màng hoặc tạo ra dạng cytotoxicity. Vai trò của độc tố này là gây xuất huyết, hoại tử với hoạt tính kết dính tiểu cầu và gây ảnh hưởng đến tính thấm của mao mạch. GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 12 Alpha toxin tinh chế có khối lượng phân tử là 43kDa và pH ở điểm đẳng điện là 5,4. Năm 1989 ba phòng thí nghiệm ở Anh, Mỹ và Nhật Bản đã đồng thời có báo cáo về việc nhân dòng gene alpha toxin từ C. perfringens. Titball và cộng sự ở Anh đã chèn đoạn gene mã hóa độc tố alpha của vi khuẩn này vào plasmid của E. coli và phát hiện vi khuẩn E. coli mang plasmid tái tổ hợp có phản ứng phân giải lecithinase trên môi trường Egg yolk. Các gene mã hóa cho một loại protein có khối lượng 44,5 kDa và dường như giống với alpha toxin cũng được mô tả. TSO và Seibel tại Mỹ cũng với phương pháp tương tự đã phát hiện độc tố alpha được sản xuất từ plasmid của các sinh vật có phản ứng dung huyết trên môi trường thạch máu. Họ đã tìm thấy một đoạn gene dài 2 kb chèn vào plasmid của C. perfringens có chứa một chuỗi dài 1197 nucleotide mã hóa cho 399 amino acid với khối lượng phân tử là 43 kDa. Okabe và cộng sự ở Nhật Bản đã thành công trong việc nhân dòng gene vô tính alpha toxin của C. perfringens và cũng cho biết chiều dài của gene cpa và trình tự acid amin trùng với hai gene nói trên. 1.4.2. Beta toxin Đây là loại độc tố gây chết người lớn, được sản xuất bởi cả type B và type C. Beta toxin là một protein mẫn cảm cao với trypsin gây hoại tử tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột. Ngoài ra độc tố Beta còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi Ca2+ của màng gây ra rối loạn chức năng thần kinh bình thường. Loại độc tố này có thể được thu hồi từ môi trường lỏng và tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng một cột có chứa kẽm nhiệt phân, cột thứ hai bằng nhựa vinyl ưa nước. Độc tố Beta tinh chế có trọng lượng phân tử 40 kDa và pH đẳng điện là 5,6. Gene mã hóa Cpb gồm 1113 nucleotide mã hóa cho 371 amino acid. Nó có tính chất tương tự alpha toxin, do đó rất khó để tách riêng hai loại độc tố này. Beta toxin có độc tính rất mạnh: Khi tiêm vào chuột gây tăng huyết áp và nhịp tim, liều gây chết LD 50 cho chuột trưởng thành là 310 và 4500 ng/kg và chỉ cần 2 ng độc tố này có thể gây bệnh trên lợn con. 1.4.3. Epsilon toxin Epsilon toxin được sản sinh ra dưới dạng một tiền độc tố và được hoạt hóa bằng men proteolytic ở lượng thấp. Đích của nhóm độc tố này là nhóm lipid: GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh 13 Cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của động vật Eukaryote vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận. Độc tố gây hoại tử và gây chết. Epsilon toxin được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type D. Nó là một protein gồm 311 acid amin với trọng lượng phân tử là 34,25 kDa. Loại độc tố này chủ yếu làm ảnh hưởng đến ruột bằng việc tăng tính thấm của thành mạch. Do đó, tăng cường sự hấp thu độc tố và đóng vai trò như là một chất độc gây chết người. Sau khi lưu thông vào các cơ quan bên trong cơ thể, nó gây sưng thận, phù nề ở phổi, màng ngoài tím và làm cho lượng chất lỏng dư thừa. Ảnh hưởng của việc tăng tính thấm thành mạch có thể được chứng minh bằng cách tiêm loại độc tố này vào một vị trí sau đó nó sẽ đi vào hệ tuần hoàn. Buxton đã đề xuất một cơ chế hoạt động của độc tố Epsilon trực tiếp hoặc gián tiếp liên quan đến hệ thống adenylcyclase ( hệ thống xúc tác tổng hợp AMP mạch vòng từ ATP) trong các tế bào bị ảnh hưởng. Kỹ thuật ELISA đã phát hiện được độc tố Epsilon và được đề xuất này thay thế việc gây chết chuột và thử nghiệm cho việc sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu. 1.4.4. Iota toxin Có 2 vị trí là vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa enzyme (Ia). Sau khi độc tố được gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào. Độc tố làm tăng tính thấm của mao mạch và tác động lên màng tế bào. Độc tố này được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type E. Ia và Ib được phân cách bởi điểm đẳng điện. Ia có pH đẳng điện là 5,2 và khối lượng phân tử 47,5 kDa. Ib có pH đẳng điện là 4,2 và khối lượng phân tử là 71,5 kDa. Một hỗn hợp gồm cả hai thành phần Ia và Ib cần thiết cho hoạt động sinh học quan trọng được đo bằng việc gây chết. Chuỗi nhẹ Ia là một enzyme làm nhiệm vụ tổng hợp ADP, cơ vân và protein actin không co rút. 1.4.5. Enterotoxin (CPE) Là một độc tố đường ruột được sản xuất bởi chủng vi khuẩn C. perfringens type A. Nhiều nghiên cứu cho thấy CPE còn là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy, viêm ruột và viêm ruột hoại tử ở động vật. Gene mã hóa cho CPE là cpe nằm trên cả nhiễm sắc thể và plasmid của vi khuẩn C. perfringens. CPR là một đoạn GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Lại Nhật Linh