Tài liệu Nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) ở tỉnh trà vinh, bến tre và cần thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHÂU HUỲNH THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM VI KHUẨN Pseudomonas spp. TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Ở TỈNH TRÀ VINH, BẾN TRE VÀ CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Cần Thơ, 5/2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ cô Từ Thanh Dung đã hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài cũng như được tiếp xúc thực tế ở ao nuôi thủy sản. Xin gởi lời cảm ơn quí thầy cô khoa thủy sản đã truyền đạt kiến thức quý báu trong quá trình học cũng như trong thời gian thực hiện đề tài. Xin gởi đến cha mẹ, cậu, các chị và các em lời cám ơn chân thành, là nguồn động viên tinh thần trong suốt thời gian qua. Xin gởi đến chị Phạm Thanh Hương lời cám ơn sâu sắc về sự giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp nhiều ý kiến quí báu cho tôi hoàn thành đề tài. Xin chân thành cám ơn chị Châu Hồng Thúy và các anh chị làm việc trong phòng thí nghiệm trường Đại học Trà Vinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình thu và phân tích mẫu ở tỉnh Trà Vinh. Chân thành cám các anh chị cán bộ trong khoa cùng tập thể lớp bệnh học thủy sản 31 đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài. i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Mục tiêu của đề tài là đánh giá sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc hơn về thuốc kháng sinh, từ đó đưa ra biện pháp kiểm soát việc sử thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách triệt để hơn. Trước hết, tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn Pseudomonas spp. từ trong môi trường ao nuôi cá tra ở một số hộ ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. Sau đó tiến hành làm kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh và chọn ra 4 chủng để xác định MIC với 3 loại thuốc (oxytetracycline hydrochloride, chloramphenicol, streptomycin) bằng phương pháp pha loãng. Kết quả cho thấy đa số các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. kháng với các loại kháng sinh thử nghiệm, trong đó tất cả các chủng vi khuẩn kháng với cefazolin (CEZ/30 µg), ampicillin (AM/10 µg), kháng ít nhất với doxycycline (DO/30µg) (6,7%) (xem Bảng 4.1). Mặc khác, thấy có 13 chủng trong 30 chủng vi khuẩn thí nghiệm kháng với 2 loại kháng sinh trở lên. Giá tri MIC của các chủng vi khuẩn với chloramphenicol nằm trong khoảng từ 32 đến >256 µg/ml , với oxytetracycline là 8-128 µg/ml, với streptomycine là 4 đến >256 µg/ml. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC MỤC LỤC Phần I : ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu .......................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ............................................................................................ 2 1.3 Nội dung của đề tài ........................................................................................... 2 Phần II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1 Đặc điểm và bệnh do Pseudomonas spp. trong nuôi thủy sản ........................... 3 2.1 Vi khuẩn Pseudomonas .................................................................................... 3 2.2 Một số nghiên cứu về Pseudomonas spp. trong môi trường .............................. 4 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi thủy sản .............................................................. 5 2.3.1 Thuốc kháng sinh............................................................................................ 5 2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn ............................................................... 6 2.3.3 Sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas ........................................ 7 Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 10 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 10 3.2 Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................... 10 3.2.1 Dụng cụ......................................................................................................... 10 3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu ................................................ 10 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 11 3.3.1 Địa điểm thu mẫu ......................................................................................... 11 3.3.2 Mẫu vi khuẩn ................................................................................................ 11 3.3.3 Phương pháp thu mẫu ................................................................................... 11 3.3.4 Phương pháp đếm mật độ vi khuẩn .............................................................. 11 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn ................................................................. 12 3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ .................................................................. 12 3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ............................... 13 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 16 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn ..................................................................... 16 4.2 Kết quả lập kháng sinh đồ ................................................................................ 17 4.2.1 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh ............ 17 4.2.2 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh ............ 19 4.3 Kết quả làm MIC ................................................................................................ Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................................... 24 5.1 Kết luận............................................................................................................. 24 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 5.2 Đề xuất .............................................................................................................. 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 25 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 29 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình 2.1 Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott et al., 2000)................................................................. 7 Hình 4.1 Vi khuẩn trên môi trường GSP ................................................................ 16 Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram (100X) .................................................................. 16 Hình 4.3 Kết quả test O/F ....................................................................................... 16 Hình 4.4 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh .......... 18 Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ chủng PTV085 ................................................... 18 Hình 4.6 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh .......... 19 Bảng 4.1: Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh......... 17 Bảng 4.2: Kết quả giá trị MIC của 4 chủng Pseudomonas spp. 3 kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline, streptomycin ................................... 21 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phần 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Việt Nam có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi chính của cả nước, không chỉ đáp ứng cho nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, vì thế diện tích và sản lượng không ngừng gia tăng. Điển hình năm 2007, diện tích mặt nước nuôi cá tra và cá basa là 6.000 ha (tổng diện tích đất 9.000 ha) diện tích nuôi tăng gấp 6 lần so với năm 1997, sản lượng đạt 1 triệu tấn tăng gấp 45 lần so với năm 1997 (22.500 tấn) (Dzung, 2007). Để đáp ứng nhu cầu thị trường, nghề nuôi cá tra phát triển ở mức độ thâm canh ngày càng cao dẫn đến nhiều bệnh thường xuyên xảy ra và việc sử dụng thuốc kháng sinh phổ biến trong nuôi thủy sản đã làm cho hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng. Theo khảo sát của Mai Văn Tài và ctv. (2004) ở 6 mô hình nuôi và sản xuất giống thủy sản thì có đến 138 loại thuốc kháng sinh được sử dụng. Trong môi trường nuôi cá tra (ở vùng nước ngọt) có nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau, sự kháng thuốc của các nhóm vi khuẩn này cũng đã được xác định bởi một số nghiên cứu: Sarter et al. (2007) nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn Gram âm (Enterobacteriaceae (49,1%), Pseudomonads (35,2%) và Vibrionaceae (15,7%)) trong ao nuôi cá tra và cá ba sa ở vùng ĐBSCL. Nghiên cứu của Stock and Wiedemann (2001) về sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loại kháng sinh của 102 chủng Edwardsiella bao gồm E. tarda (42 chủng), E. ictaluri (41 chủng) và E. hoshine (19 chủng). Và tiêu biểu nhất là nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv. (2008) về hiện trạng kháng thuốc của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở ĐBSCL. Tỉnh Trà Vinh có 29.187 ha đất nuôi trồng thủy sản, trong đó nuôi trồng thủy sản nước lợ, mặn chiếm 96% đất nuôi trồng thủy sản. Năm 2007, tổng sản lượng thủy sản của Trà Vinh đạt 149.000 tấn, trong đó sản lượng do nuôi trồng đạt hơn 84.000 tấn chiếm đến 81% tổng giá trị sản phẩm do ngành thủy sản mang lại (Ðặng Văn Bường, 2008). Sau khi cá tra được nuôi thử nghiệm thành công ở vùng nước lợ thuộc ấp 5, xã Bình Thắng, huyện Bình Đại, tỉnh Bến Tre vào những ngày đầu năm 2008, có khả năng cá tra sẽ mở rộng diện tích nuôi ở vùng nước lợ. Nhưng tính đến thời điểm hiện nay chưa có tác giả nào công bố về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong ao nuôi cá tra ở vùng nước lợ. Vì thế đề tài “Nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Đánh giá sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc hơn về thuốc kháng sinh, từ đó đưa ra biện pháp kiểm soát việc sử thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách triệt để hơn. 1.3 Nội dung của đề tài − Phân lập, định danh vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường nuôi cá tra ở tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. − Xác định sự kháng thuốc của vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas spp. bằng phương pháp lập kháng sinh đồ theo Kirby Bauer. − Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- Minimum Inhibitory Concentration) của vi khuẩn Pseudomonas spp. với một số loại kháng sinh. 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm và bệnh do Pseudomonas spp. trong nuôi thủy sản Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc cong mãnh, không có khả năng sinh bào tử, kích thước 0,5-1,0 x 1,5-5,0 µm, thường di động với một hoặc nhiều roi, hiếu khí bắt buộc. Hầu hết Pseudomonas có oxidase dương tính, nhưng thỉnh thoảng có chủng oxidase âm tính xuất hiện. Vi khuẩn tạo sắc tố vàng - xanh, xanh và xanh nhạt. Nhiệt độ thích hợp cho Pseudomonas phát triển là 4-430C, phát triển tốt ở nhiệt độ thấp. Pseudomonas phân bố khắp nơi trong môi trường, trong đất và nước, là tác nhân cơ hội gây bệnh trên người, động vật và thực vật. Vi khuẩn phân lập được từ bên ngoài và trong nội tạng của cá, gây bệnh trên cá chủ yếu là P. fluorescens, P. chlororaphis và P. anguilliseptica, gây nhiễm trùng máu trong điều kiện nhiệt độ cao và quản lý không phù hợp (Inglis and Hendrie, 1993). Pseudomonas spp. là mầm bệnh trên nhiều đối tượng nuôi thủy sản kinh tế quan trọng, gây tỉ lệ tử vong khá cao (Từ Thanh Dung, 2008). Pseudomonas anguilliseptica được thông báo đầu tiên gây bệnh đốm đỏ (red spot disease – RSD hay Sekiten-byo) trên cá chình ở Nhật Bản bởi Wakabayashi & Egusa vào năm 1972. Theo Muroga et al. (1975), cá chình Nhật Bản (Anguilla japonica) nhạy cảm với P. anguilliseptica hơn cá chình châu Âu (Anguilla anguila). Vi khuẩn này có thể phân lập từ gan, tỳ tạng, tim và trong máu cá bệnh, khuẩn lạc nhỏ trên môi trường NA sau 72h ủ ở 25oC. Ngược lại, P. fluorescens phát triển tốt trên môi trường NA ở 22-25oC và tạo sắc tố màu vàng – xanh, tạo sắc tố huỳnh quang dưới đèn cực tím. (được trích dẫn bởi Inglis and Hendrie, 1993). Kobayashi et al. (2004) xác định tác nhân gây bệnh ở cá thu từ các ao nuôi ở Wakayama Prefecture là vi khuẩn Pseudomanas plecoglossicida bằng kỹ thuật ngưng kết trên lam với kháng thể P. plecoglossicida FPC941. Bằng phương pháp mô học đã phát hiện những tổn thương ở tỳ tạng, thận, gan, ruột, tim và mang, xuất hiện những vết hoại tử đi kèm với sự xuất huyết, đông máu và trương phòng ở phần tủy của tỳ tạng, biểu bì mô và trong thận. Ở gan cũng có hiện tượng hoại tử và sự hình thành vùng áp-xe. Tuy nhiên, ruột, tim và mang chỉ bị vi khuẩn P. plecoglossicida tấn công ở mức không đáng kể, không có sự tổn thương hoặc vi khuẩn không xuất hiện ở não. Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2005), bệnh đốm đỏ xuất hiện trên tất cả các loài cá nuôi và cá tự nhiên (cá trắm cỏ, cá tra, cá basa, ếch…), có 4 mức độ và trạng thái bệnh của cá: Bệnh ác tính- không biểu hiện triệu chứng đặc 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com trưng, từ khi xuất hiện đến khi cả đàn cá bị bệnh khoảng 10-30 ngày, thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và chất lượng nước; Bệnh cấp tính- có biểu hiện triệu chứng bệnh nhưng không đầy đủ, khoảng 40-50% đàn cá mắc bệnh, số lượng cá chết rất lớn trong vài ngày; Bệnh thứ cấp tính- biểu hiện xuất huyết từng đốm đỏ trên da, hai bên thân nhất là vùng bụng bị xuất huyết, ứ máu đỏ bầm, vảy dựng lên, bụng phình to…, 30-40% đàn cá bệnh thì đàn cá bơi lội uể oải, lờ đờ, chậm chạp, ở cá khỏi bệnh có nhiều vết sẹo và sinh trưởng chậm hơn bình thường 2-3 lần; Bệnh mãn tính- kéo dài trong suốt quá trình nuôi, tỉ lệ chết khoảng 10% đàn cá, cá khi thu hoạch có nhiều vết sẹo hoặc nhiều chỗ loét chưa lành. Phan Thị Vân và ctv. (2002) xác định tỉ lệ nhiễm Pseudomonas fluorescens phân lập được từ cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ và xuất huyết lần lượt là 23,6-45,2% và 0-7,8%, bệnh đốm đỏ xuất hiện chủ yếu ở cá trên một tháng tuổi, bệnh xảy ra quanh năm, cao điểm là từ tháng 4-5 và tháng 10-11. Bên cạnh những loài thuộc giống Pseudomonas gây bệnh, thì cũng có những loài có ích, cụ thể là P. stutzeri có khả năng khử nitrate cơ bản dựa trên hoàn toàn bộ gen mã hóa cho các enzyme dị hóa nitrate chứa bên trong chúng bao gồm: gen nar (nitrate reductase) , gen nir (nitrite reductase), gen nor (nitrite oxide reductase), gen nos (nitrous oxide reductase)(Lalucat et al., 2006) . Quá trình khử nitrate thành nitơ phân tử nhờ các vi khuẩn khử nitrate trong đó có vi khuẩn P. stutzeri, chúng khử NO3- qua các sản phẩm trung gian đến sản phẩm cuối cùng là N2 không khí (Lương Đức Phẩm, 2007). Khả năng khử nitrate là một đặc tính bền vững của vi khuẩn P. stutzeri, loài vi khuẩn này là một trong những loài vi khuẩn dị dưỡng khử nitrate hiệu quả nhất và được xem là một hệ thống chuẩn của quá trình khử nitrate bằng vi khuẩn (Zumft, 1997). Carlson et al. (1983) đã nghiên cứu về khả năng khử nitrate của vi khuẩn P. stutzeri, P. aeruginosa và Paracoccus denitrificans. Kết quả cho thấy rằng P. stutzeri chỉ tạo ra sản phẩm là khí nitơ trong khi P. aeruginosa tạo ra nhiều khí N2O hơn là N2. Thêm vào đó một bất lợi là vi khuẩn P. aeruginosa làm giảm lượng nitrate (NO3-), nitrite (NO2), nitrous oxide (N2O) chậm và không có khả năng sinh trưởng hiếm khí trong khi đó thì điều hoàn toàn có thể được thực hiện bởi vi khuẩn P. stutzeri. Vì thế P. stutzeri được ứng dụng xử lý đạm trong ao nuôi cá tra (được Đặng Thị Bé trích dẫn, 2008). 2.2 Một số nghiên cứu về Pseudomonas spp. trong môi trường Nghiên cứu của Kennedya et al. (2006) về phức hệ vi sinh vật (VSV) trong trại sản xuất giống tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), tổng số 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi khuẩn có trong nước giếng khoan, nước biển và nguồn nước cấp từ 101- 105 cfu/ml, số lượng vi khuẩn chiếm mật số cao hơn trong nước bể ương. Vi khuẩn Vibrio hiện diện trong môi trường nước của bể nuôi khoảng 101 – 103 cfu/ml trong khi mật độ vi khuẩn có ở mẫu ấu trùng 102 – 104 cfu/10 ấu trùng. Phần lớn loại vi khuẩn chiếm ưu thế là gram âm gồm các giống Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp., Baccillus spp. và vi khuẩn gram dương không hình thành bào tử. Với kết quả phức hệ VSV trong hệ thống nuôi tôm càng xanh này đang trong điều kiện bình thường. Số lượng và chất lượng hệ vi sinh vật trong hệ thống nuôi đã giúp định hướng được sự biến động của hệ VSV trong trại giống và có thể dự đoán sự bộc phát của bệnh dịch (Dương Thị Mỹ Hận trích dẫn, 2007). Theo kết quả nghiên cứu về số lượng và chất lượng hệ vi sinh vật trong ao đất nuôi cá rô phi lai ở Saudi Arabia, mật số vi khuẩn (colony forming units - cfu) ở trong phạm vi từ 5,6 ± 0,8 × 10 3 đến 2,4 ± 1,2 × 104 cfu /ml trong nước ao; 9,3 ± 1,1 × 10 6 đến 1,9 ± 1,5 × 108 cfu /g trong bùn. Phân lập được 15 giống vi khuẩn và 18 loài. Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn trong nước ao và bùn đáy sẽ phản ánh được vi khuẩn trên mang và nội tạng cá rô phi, vi khẩn trên mang đa dạng hơn vi khuẩn trong nội tạng. Trong đó, Pseudomonas spp. cũng chiếm ưu thế so với vi khuẩn khác (10,1%) trong mẫu nước, còn trong bùn ít hơn trong nước với Pseudomonas spp. 4,57% và có thêm P. fluorescens 1,37% (Al-Harbi and Uddin, 2003). Akinbowale et al. (2005) đã phân lập được nhiều giống vi khuẩn từ môi trường nuôi thủy sản (cá nước ngọt và lợ, giáp xác): Vibrio spp. chiếm 60%, Aeromonas spp. 21%, Photobacterium spp. 4%, Pseudomonas spp. 4%, Citrobacter spp. 2%, E. tarda 2%, Hafnia alvei 1%, Flavobacterium spp. 2%, Plesiomonas shigelloides 1% và vi khuẩn gram dương (Staphylococcus và Micrococcus spp.) chiếm 4% trong nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ các nguồn thủy sản ở Úc. Sazakli et al. (2005) phân lập được 160 chủng Pseudomonas từ nhiều nguồn nước khác nhau (nước biển, nước cất, nước đóng chai…) ở Greece, trong đó P. aeruginosa chiếm đa số 61 chủng (38%), tiếp theo là 30 chủng (19%) P. stutzeri, còn lại là P. alcaligenes, P. putida, P. fluorescens, P. mendocina. 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi thủy sản 2.3.1 Thuốc kháng sinh Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra), hay do con người tổng 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com hợp nên, có tác dụng một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu trong chu trình biến dưỡng của vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của nấm (tác nhân kháng nấm), của virus (tác nhân kháng virus) (được trích dẫn bởi Lê Thị Kim Liên và ctv., 2008). Người đầu tiên phát hiện chất kháng sinh là bác sĩ người Anh Alexander Fleming (1881-1955). Năm 1928 ông là người đầu tiên tách được chủng nấm Penicilium notatum sinh chất kháng sinh penicilin, mở ra một kỷ nguyên mới cho việc đẩy lùi nhanh chóng các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1944, Waksman (người Mỹ gốc Nga) phát hiện ra Streptomycine và nhận giải Nobel vào năm 1952. Tiếp theo, hàng loạt chất kháng sinh quan trọng khác đã được phát hiện và ứng dụng như: Bacitracin (1945), chloramphenicol (1947), polimixin (1947), chlortetracyclin (1948), cephalosporin (Brotzu, 1948), neomycin (1949), eritromicine (1952), validacine (1970)…(được trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002). 2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn Theo Bùi Thị Tho (2003), sự kháng thuốc của vi khuẩn được chia thành 2 loại: Một là kháng thuốc tự nhiên: Bản thân vi khuẩn bình thường đã có sẵn những men hay một chất x nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh. Hoặc có thể loại vi khuẩn đó không vị trí công kích, điểm tác động của chất kháng sinh. Ví dụ: Các vi khuẩn Gram âm không chịu tác dụng của Penicilin. Hai là kháng thuốc thu được: Vi khuẩn thu được những yếu tố kháng thuốc trong quá trình sống do sự đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc (Nicholas F. N, 1987). Khi có được các yếu tố kháng thuốc – plasmid, factor R, hay episome, nó có khả năng truyền ngang các yếu tố kháng này giữa các chủng cùng loài và giữa các loài với nhau. Theo Clowes (1973), Cohen (1965,1982), Johnson (1994)… có 3 phương thức mà vi khuẩn có thể truyền gen kháng thuốc theo chiều ngang là sự biến nạp, tải nạp và tiếp hợp (được Bùi Thị Tho trích dẫn, 2003). Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2005), nguyên nhân dẫn đến hiện tượng kháng thuốc bao gồm: Một là sự kháng thuốc kháng sinh do sử dụng không đúng loại, liều lượng sẽ dẫn đến việc tạo các dòng vi khuẩn kháng thuốc, đây cũng là nguyên nhân chính gây ra sự thất bại về sản lượng thu hoạch tôm Đài Loan năm 1989; Hai là việc sử dụng thuốc kháng sinh ban đầu có thể sẽ mang lại tỉ lệ sống cao hơn nhưng lại sẽ tạo ra những dòng vi khuẩn kháng thuốc khó trị. Sự quay vòng trong việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng góp phần tạo ra những dòng vi khuẩn kháng nhiều loại thuốc (đa kháng). Sự kháng thuốc có thể là do sự phát sinh ra cơ chế miễn dịch trong hệ di truyền của vi 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com khuẩn. Do đó, sự kháng thuốc có thể được chuyển từ loại vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Để hạn chế khắc phục những nguyên nhân trên cần phải: Chuẩn đoán đúng bệnh để cho đúng thuốc và sử dụng đúng liều lượng thuốc, đúng thời gian qui định. Hạn chế sử dụng thuốc bừa bãi, tùy tiện khi chưa xác định được tác nhân gây bệnh. Không sử dụng đồng thời hai loại thuốc có tác dụng đối kháng nhau. Để kìm hãm sự phát sinh của các dòng vi khuẩn kháng thuốc, nên diệt khuẩn với liều lượng hữu hiệu. Nếu dùng thuốc với nồng độ thấp hơn qui định chúng có thể bình phục và sản sinh ra những dòng kháng thuốc cao hơn. Mặc khác, sự trao đổi của vi khuẩn gây bệnh giữa con người và động vật với nuôi thủy sản bằng nhiều con đường khác nhau (Hình 2.1), do đó sự kháng thuốc của vi khuẩn trên động vật thủy sản sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe và việc điều trị bệnh của con người. MÔI TRƯỜNG NUÔI THUỶ SẢN (cá và giáp xác) Biển Nước uống UỐNG Sông, suối Bơi lội Nước uống Nước Nguồn nước, chất thải của nông trại Chế biến Thức ăn gia súc HỆ THỰC VẬT Rau Cây ăn quả Phế phẩm ĐỘNG VẬT TRÊN CẠN Cừu, Ngựa, Heo, Gia Cầm, Bò Vật nuôi trong nhà Lò mổ Thịt Chuẩn bị, nấu, nướng.. CON NGƯỜI Bệnh viện, thành phố, nông thôn Tiếp xúc trực tiếp Hình 2.1 Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott et al., 2000) 2.3.3 Sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas Theo Aoki (1988), các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá như: Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Edwardsiella tarda, Pasteurella piscicida, 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Pseudomonas fluorescens và Vibrio anguillarum có chứa plasmid kháng thuốc kháng sinh. Cụ thể là: A. salmonicida có chứa plasmid R kháng chloramphenicol, sulfonamide, streptomycin (ở Nhật Bản) và với sulfonamide, streptomycin, spectinomycin, trimethoprim và tetracycline (ở Ireland) (Aoki, 1997) (được trích dẫn bởi Alderman, 2000). Theo nghiên cứu của Akinbowale et al. (2005) về sự kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ các nguồn thủy sản ở Úc (100 giống vi khuẩn gram âm và 4 gram dương) với 19 loại kháng sinh (amoxycillin, ampicillin, cefazolin, cefotaxime, cefoperazone, ceftiofur, nalidixic acid, oxolinic acid, ciprofloxacin, chloramphenicol, florfenicol, gentamicin, kanamycin, erythromycin, tetracycline, oxytetracycline, sulfamethoxazole, trimethoprim and potentiated sulfonamide). Tác giả cho rằng: − Tần số xuất hiện sự kháng thuốc khác nhau ở các giống vi khuẩn. Hầu hết đều kháng với penicillins và một vài loài kháng với cephalosporins cũng như erythromycin. − Trong tổng số chủng vi khuẩn có 54,8% kháng với ampicillin and amoxicillin, 41,4% kháng với cefotaxime, 23,1% kháng cefazolin, 5,8% kháng ceftiofur và 1,9% kháng cefoperazone. Trong khi đó 47,1% kháng erythromycin, 16,4% kháng tetracycline và với oxytetracycline là 19,2%. − Kháng với gentamicin và kanamycin lần lượt 2,9% và 5,8%; 13,5% kháng acid nalidixic và 8,7% với acid oxolinic, kháng chloramphenicol và florfenicol là 6,7% và 8,7%. − Phân lập được 4,8% các loài kháng trimethoprim và 15,4% kháng sulfamethoxazol. Tìm thấy 3,9% kháng trimethoprim + sulfamethoxazole. Đặc biệt là tất cả các loài đều nhạy cảm ciprofloxacin. − Cả 4 chủng Pseudomonas spp. đều nhạy với ciprofloxacin, gentamicin and kanamycin. Trong đó: Một chủng nhạy với tất cả kháng sinh (19 loại). Ba chủng còn lại kháng cefotaxime, 2 chủng kháng với ampicillin và amoxycillin, 2 chủng kháng cefazolin. Kháng với ceftiofur ở 3 chủng và 2 chủng kháng với cefoperazone, chloramphenicol, florfenicol, trimethoprim, sulfamethoxazole và trimethoprim-sulfamethoxazole. Kháng với acid nalidixic and erythromycin ở 3 chủng. Tuy nhiên, chỉ có 1 chủng kháng acid oxolinic, 1 chủng kháng tetracycline và oxytetracycline. Le et al. (2005) nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong mô hình nuôi tôm- đước ở Việt Nam, tác giả thấy tác hại việc sử dụng thuốc kháng sinh phổ biến trong nuôi thủy sản làm cho tồn lưu kháng sinh trong 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com nước, trong bùn và tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn trong môi trường. Kiểm tra sự kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ 4 địa điểm nuôi tôm – đước khác nhau ở Việt Nam với norfloxacin (NOR), oxolinic acid (OXLA), trimethoprim (TMP) và sulfamethoxazole (SMX). Trong đó, vi khuẩn kháng với TMP và SMX. Trong mẫu bùn phân lập được chủ yếu vi khuẩn Baccillus và Vibrio kháng với với thuốc kháng sinh. Theo nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn trong ao nuôi cá da trơn. Chọn ngẫu nhiên 3 trại nuôi cá da trơn khác nhau, phân lập được 92 chủng vi khuẩn từ môi trường ao nuôi. Trong đó, tổng số chủng vi khuẩn thuộc họ: Enterobacteriaceae chiếm 49,1%, Pseudomonads chiếm 35,2%, Vibrionaceae chiếm 15,7%. Kiểm tra sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn phân lập được với 6 loại thuốc kháng sinh: oxytetracyline (OTC), chloramphenicol (CHL), trimethoprim - sulphamethoxazol (SXT), nitrofurantoin (NF), nalidixic acid (NA) và ampicillin (AM). Thấy phần lớn các chủng vi khuẩn đa kháng với AM-OTC-SXT-NA chiếm 17,8%, với OTCSXT-NA chiếm 15,1%, với AM-C-FT-SXT-NA chiếm 13,7%, với AM-FTOTC chiếm 9,6% và kháng với AM-C-FT-OTC-SXT-NA chiếm 8,2%, tiêu biểu là có 6 chủng P. pseudomallei và 1 chủng P. cepacia kháng với AMOTC-SXT-NA, 10 chủng P. cepacia kháng với AM-C-FT-SXT-NA. Từ kết quả cho thấy, sự kháng thuốc trong thuỷ sản đang ở mức cao. Những kết quả này cho thấy khả năng kháng thuốc kháng sinh trong các loài vi khuẩn cá bản địa là một mối quan tâm lớn trong nghề nuôi cá da trơn ở vùng ĐBSCL (Sarter et al., 2007). 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ 1/2009 − 5/2009. Địa điểm thực hiện: − Thu mẫu nước và mẫu bùn tại tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. − Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản − Khoa Thuỷ Sản − Trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ Phiếu ghi nhận thông tin khi thu mẫu (Phụ lục 1), que cấy, giấy vệ sinh, bao tay, giấy nhôm, giấy làm dấu, bọc nylon, dây thun, thùng trữ lạnh, hộp quẹt,… Chai nút mài 100 ml, ống nghiệm 10ml, đĩa petri, đèn cồn, que trãi thuỷ tinh, bình xịt cồn, cốc thủy tinh 250 ml, hộp đầu col pipet 0,5ml và 1ml, pipet 100-1000ml, lame, lamelle. Cân điện tử, máy trộn mẫu nước (vortex), máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất, tủ sấy khô, tủ ấm, tủ lạnh, tủ vô trùng. 3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu Hoá chất: NaCl, cồn 96o, cồn 70o, glycerol, nước cất, các loại hoá chất nhuộm Gram,… Thuốc kháng sinh (12 loại): trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT/ 1,25 µg - 23,75 µg), tetracyline (TE/30 µg), cefazolin (CEZ/30 µg), norfloxacin (NOR/5µg), nitrofurantoin (NF/300 µg), rifampicin (RA/30 µg), ampicillin (AM/10 µg), streptomycin (SM/10 µg), chloramphenicol (CHL/30 µg), neomycin (NM/30 µg), flumequin (FM/30 µg), doxycycline (DO/30µg). Hầu hết, những thuốc kháng sinh này của Bio-Rad, riêng cefazolin và norfloxacin của Oxoid. Thuốc kháng sinh tinh dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu: Oxytetracycline hydrochloride, chloramphenicol, streptomycin. Môi trường chung: Trypton soy agar (TSA), nutrient broth (NB), brain heard in broth (BHIB), mueller hinton agar (MHA). Môi trường chọn lọc: Glutamate starch phenol red agar (GSP Agar), Pseudomonas isolation agar. 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Nguồn vi khuẩn: 30 chủng Pseudomonas spp. phân lập được từ môi trường ao nuôi cá tra ở 3 tỉnh Trà Vinh, Cần Thơ và Bến Tre. Hai chủng vi khuẩn tham khảo Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Địa điểm thu mẫu Chọn số ao nuôi cá thâm canh ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. 3.3.2 Mẫu vi khuẩn Tổng số ao được thu là: 30 ao (30 mẫu nước + 30 mẫu bùn). Mỗi tỉnh tiến hành thu 10 ao. 3.3.3 Phương pháp thu mẫu Thu hai đợt trong chu kỳ nuôi: Một đợt trong tháng đầu và một đợt vào tháng cuối của vụ nuôi và thu mẫu khi có bệnh xảy ra đột xuất. Mẫu nước và bùn được thu ở ba điểm khác nhau ở trong ao: điểm cấp nước vào, giữa ao và điểm thoát nước. Phương pháp thu mẫu nước và bùn theo tài liệu của Le et al. (2005). Đối với mẫu nước: tại mỗi điểm thu 100 ml bằng chai nút mài tiệt trùng và thu cách mặt nước 0-20 cm. Đối với mẫu bùn: tại mỗi điểm thu 10 ml bằng dụng cụ chuyên biệt (drivers) và thu ở lớp mặt 1 cm, sau đó cho mẫu vào chai đã tiệt trùng. Tất cả mẫu thu được trữ lạnh ở 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trong vòng 24 giờ. 3.3.4 Phương pháp phân tích vi khuẩn trong mẫu nước và bùn a. Mẫu nước Các chai nước được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng. Sau đó rút bỏ một ít nước trong mỗi chai sao cho có thể đảo đều mẫu nước trong chai. Ở mỗi chai hút 30ml cho vào một chai rỗng đã được khử trùng. Trộn đều mẫu nước và tiến hành phân tích theo phương pháp của (Le et al., 2005). Pha loãng 1 ml mẫu nước ban đầu thành 10ml trong nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10-4. Rút 0,1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường GSP Agar sau đó đem ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28oC và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. b. Mẫu bùn 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Các chai bùn được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng. Sau đó, cho tất cả bùn từ 3 chai được thu tại 3 điểm trong ao vào cùng một chai đã tiệt trùng và đảo đều mẫu sau đó tiến hành phân tích theo phương pháp của Le et al. (2005). Pha loãng 1g mẫu bùn với 10ml trong nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10-4. Lấy 0.1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường GSP Agar sau đó đem ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28oC và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. c. Chọn vi khuẩn Theo như chỉ dẫn của nhà sản xuất, chọn khuẩn lạc rời, tạo sắc tố đỏ trên đĩa môi trường GSP ở mẫu nước và mẫu bùn. Sau đó tiến hành tách ròng sang đĩa mới đến khi thuần thì trữ lại. 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn Xác định các đặc điểm về hình thái, sinh-hóa: kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (primary test). Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993) và sử dụng dòng vi khuẩn tham khảo là: P.aeruginosa. 3.3.5.1 Xác định các chỉ tiêu cơ bản (Theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993)) Quan sát tính di động. Nhuộm Gram. Phản ứng oxidase. Phản ứng catalase. Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (Fermentation/oxidation: O/F). 3.3.5.2 Phương pháp sử dụng bộ kit API 20E (Biomerieus® SA I’Etoile France) 3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ (Theo phương pháp của Kirby Bauer) Phương pháp xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ. Vi khuẩn sau khi được phục hồi, kiểm tra tính thuần thì tiến hành làm kháng sinh đồ. 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều và tiến hành xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh để xác định mật số vi khuẩn đạt 108 cfu/ml (OD = 0,1 ± 0.02). Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành trãi dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch. Dùng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều trên môi trường thạch MHA. Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri 10-15mm. Mỗi đĩa petri (đường kính 100 mm) môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh. Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm ở điều kiện 280C. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả. Ghi chú: − Phải lắc đều vi khuẩn và được lặp lại 3 lần. − Sử dụng chủng tham khảo E. coli. Đọc kết quả Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng của nhà sản xuất để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng. Kết quả đường kính vòng vô trùng của 2 trong 3 lần lặp lại sai khác không đáng kể thì ghi nhận kết quả của 2 lần lặp lại đó hoặc kết quả trung bình của 3 lần lặp lại đó. 3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Qua việc sàn lọc kết quả kháng sinh đồ, chọn 4 chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. (PTV083, PCT0914, PTV0923, PBT0925) để xác định giá trị MIC đối với 3 loại thuốc kháng sinh (oxytetracycline, streptomycin, chloramphenicol), thực hiện cùng 2 chủng tham khảo P. aeruginosa và E. coli. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006b). v Các bước tiến hành: Ø Chuẩn bị hóa chất - môi trường 13 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Vi khuẩn được lấy từ tủ đong -80oC sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường TSA, ủ trong tủ ấm từ 28oC sau 24 giờ. Riêng với vi khuẩn đối chứng E. coli, ủ ở 37oC. Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần. Nếu vi khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần. Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 5 ml BHIB, ủ ở 28oC, trong 18-20 giờ. Ø Chuẩn bị dung dịch thuốc Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị 2 chai (50 ml) dung dịch thuốc gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp. Pha loãng 2 lần các nồng độ: 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 µg/ml. Pha loãng bằng nước muối sinh lý (Bảng phụ lục 3). Chú ý: Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml. Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64; 32;…; 0,5 µg/ml được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml. Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc tiếp theo. Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào. Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Ø Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB (không dùng nước cất) ở điểm OD = 0,1±0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml), pha loãng để đạt được mật số vi khuẩn 105 cfu/ml. Sau đó, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng vi khuẩn và được ủ trong điều kiện với các ống MIC. Cho 3 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 3 ml dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,5; 1; 2;…; 512 µg/ml (cần lắc đều). Thí nghiệm có 2 đối chứng: Đối chứng âm: (3 ml BHIB + 3 ml nước muối sinh lý). Đối chứng dương: (3 ml dung dịch vi khuẩn + 3 ml nước muối sinh lý). Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 24 giờ (đến khi thấy vi khuẩn trong đối chứng dương phát triển). Ø Đọc kết quả 14 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com