Tài liệu Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi (ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ KIỀU LAN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VỚI BỆNH NẤM MỐC XANH GÂY BỆNH TRÊN NẤM LINH CHI (GANODERMA SP.) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào. Em xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kiều Lan i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ vi sinh, được sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực học tập của bản thân, em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng bổ ích và quý báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Cảnh – giảng viên khoa Công nghệ sinh học đã định hướng đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh, toàn thể các anh, chị, bạn bè và các em đang thực tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp. Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kiều Lan ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục bảng ................................................................................................................. v Danh mục hình ................................................................................................................. vi Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vii Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii Thesis abstract................................................................................................................... x Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục đích của đề tài ............................................................................................. 1 1.3. Yêu cầu của đề tài ............................................................................................... 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3 2.1. Nấm Linh Chi ..................................................................................................... 3 2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố ................................................................................... 3 2.1.2. Tình hình trồng nấm Linh chi ............................................................................. 4 2.1.3. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học ................................................................. 5 2.1.4. Các bệnh thường gặp trong trồng Linh chi ......................................................... 8 2.1.5. Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật .................................... 14 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 17 3.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 17 3.1.1. Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 17 3.1.2. Thiết bị và hóa chất .......................................................................................... 17 3.1.2. Môi trường ........................................................................................................ 18 3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 20 3.2.1. Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu ........................................................... 20 3.2.2. Phương pháp nuôi cấy, làm thuần .................................................................... 20 3.2.3. Phương pháp giữ giống..................................................................................... 20 3.2.4. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo ..................................................................... 21 3.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học .................................................... 21 iii 3.2.6. Phương pháp định loại nấm sợi ( Nguyễn Lân Dũng, 2006) ............................ 22 3.2.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số .............................................................. 24 3.2.8. Vi sinh vật ......................................................................................................... 26 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 29 4.1. Kết quả phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi .............................................................................................................. 29 4.1.1. Kết quả phân lập ............................................................................................... 29 4.1.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên nấm linh chi .................................................. 30 4.1.3. Định danh chủng nấm LC1 ............................................................................... 32 4.1.4. Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng LC1 ................ 34 4.1.5. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng các yếu tố đến sinh trưởng của nấm LC1 ...... 35 4.2. Kết quả tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm lc1 gây bệnh trên nấm linh chi trong điều kiện in vitro ..................................................................................... 38 4.2.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm LC1 ......... 38 4.2.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn .................. 41 4.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa.............................................................................. 44 4.3. Đánh giá khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn trên trực tiếp cây linh chi đã bị nhiễm bệnh ........................ 52 4.4. Thảo luận .......................................................................................................... 54 4.4.1. Phân lập và nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi ............... 54 4.4.2. Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi ............................................................................................................. 55 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 57 5.1. Kết luận............................................................................................................. 57 5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 57 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 58 Phụ lục .......................................................................................................................... 61 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Kết quả phân lập nấm nấm mốc gây bệnh ............................................... 29 Bảng 4.2. Kết quả quan sát nấm LC1 gây bệnh bằng kính hiển vi ........................... 32 Bảng 4.3. Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ........... 40 Bảng 4.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ........... 41 Bảng 4.5. Một số đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 116 sau 5 ngày nuôi ở 30oC ....... 44 Bảng 4.6. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau của chủng xạ khuẩn 116 ..... 46 Bảng 4.7. Khả năng sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau của chủng xạ khuẩn 116 .................................................................................................. 49 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi ..................................................... 7 Hình 2.2. Cấu tạo thành tế bào của nấm ........................................................................ 8 Hình 4.1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo ......................................................................... 31 Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR .................................................................... 33 Hình 4.3. Kết quả xây dựng cây phân loại cho chủng LC1......................................... 34 Hình 4.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm mốc LC1....................... 35 Hình 4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên nấm mốc xanh....................................... 36 Hình 4.6. Ảnh hưởng của pH tới nấm mốc xanh......................................................... 37 Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên nấm mốc xanh ................................................ 38 Hình 4.8. Kết quả thử hoạt tính kháng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi của một số chủng xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch .............. 39 Hình 4.9. Vi khuẩn đối kháng với nấm LC1 ............................................................... 41 Hình 4.10. Hình thái, màu sắc khuẩn lạc chủng xạ khuẩn 116 trên môi trường ISP2 sau 5 ngày nuôi cấy ở 30°C ................................................................ 42 Hình 4.11. Hình thái chuỗi bào tử và hệ sợi khuẩn ty của chủng xạ khuẩn 116 .......... 42 Hình 4.12. Hình thái, màu sắc chủng xạ khuẩn 116 nuôi cấy trên một số môi trường ....... 44 Hình 4.13. Hình thái, màu sắc khuẩn lạc của Vi khuẩn trên môi trường LB sau 3 ngày nuôi cấy ở 30°C .................................................................................. 45 Hình 4.14. Hình thái bào tử của các chủng vi khuẩn ................................................... 45 Hình 4.15. Khả năng sử dụng một số nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 116 ............. 48 Hình 4.16. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 ..................................................................................... 50 Hình 4.17. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 .................................................................................................... 51 Hình 4.18. Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 ở các nhiệt độ,20,30,37, 40 và 50°C .............................................................................. 53 Hình 4.19. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn ....................................... 53 Hình 4.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của vi khuẩn ............................... 54 Hình 4.21. Thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116 trên trực tiếp cây Linh chi bị nhiễm nấm mốc xanh .............................................................................. 55 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CKS Chất kháng sinh MT Môi trường VSV Vi sinh vật KH& KT Khoa học và kĩ thuật PDA Potato Dextro Agar vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Kiều Lan Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02.01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Phân lập và nghiên cứu về nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) . Từ đó tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh với nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro. Sau đó tiến hành thử khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn được trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh. Phương pháp nghiên cứu: Tất cả thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện in vitro với đầy đủ thiết bị, máy móc, hóa chất cần thiết và phòng cách li, từ tháng 2-9/2017. Phương pháp phân lập, nuôi cấy, tái lây nhiễm nhân tạo, nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh trưởng của các yếu tố môi trường, pH, nhiệt độ, khả năng sử dụng nguồn cacbon của nấm mốc gây bệnh. Phương pháp tách chiết DNA và định danh chủng nấm gây bệnh. Phương pháp hoạt hóa, nuôi cấy, thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn và vi khuẩn với nấm mốc gây bệnh bằng khuếch tán đĩa thạch. Nghiên cứu ảnh hưởng tới sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn qua các yếu tố: môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ, khả năng sử dụng nguồn nitrogen, khả năng chịu muối. Bố trí thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng đối kháng của vi sinh vật đã tuyển chọn được trong điều kiện in vitro với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây Linh chi. Kết quả chính và kết luận: 1. Từ những mẫu nấm Linh chi Ganoderma lucidum bị nhiễm bệnh, đã phân lập được chủng nấm mốc xanh kí hiệu LC1. Tiến hành lây nhiễm nhân tạo thành công để khẳng tính gây bệnh của nấm mốc xanh LC1. 2. Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng LC1 cho thấy khuẩn lạc chủng LC1 có màu xanh, hệ sợi khí sinh, dễ phán tán bào tử. Sinh trưởng rất tốt trên các môi trường có nguồn đường đa (lactose, saccarose, mantose), tốt nhất trên môi trường chứa D-glucose. Phát triển trong phổ nhiệt độ và pH rộng, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 25-30oC và pH tối ưu là 5,5-6,5. viii 3. Qua phân tích các đặc điểm sinh học kết hợp với kết quả định danh cho thấy chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Penicillium citrinum và chúng tôi đặt tên cho chủng này là Penicillium citrinum LC1. 4. Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn 116 và 2 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 đối kháng mạnh với nấm LC1 trong điều kiện in vitro. 5. Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn 116 có hệ sợi khí sinh phân nhánh, dạng thẳng, không có vách ngăn, chuỗi bào tử ngắn, bào tử hình bầu dục chúng tôi dự đoán chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces. 6. Qua thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn 116 với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh cho thấy chủng 116 có thể năng giảm thiểu sự lây lan của vết bệnh nhưng không thể diệt hoàn toàn được bệnh nấm mốc xanh trên cây Linh chi bị bệnh. ix THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Thi Kieu Lan Thesis title: Research on using resistant microorganisms againts Green Mold Disease of Ganoderma sp. (Ganoderma sp.) in vitro. Major: Biotechnology Code: 60 42 02 01 Educational organnization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Research and isolate the green mold diseases of Ganoderma sp. (Ganoderma sp.), to select the strain of microorganisms that strongly resist to the green molds in vitro. Experiment to test the resistance of selected strains of microorganisms against the green mold disease directly in infected Ganoderma mushrooms. Material and methods: All experiments were conducted in in vitro conditions with adequate equipment, machinery, chemicals and isolation rooms, from 2-9 / 2017. Methods of isolation, culture, artificial re-infection, research on the influence of environmental factors, pH, temperature on the growth, the ability to use carbon sources of pathogenic molds, DNA extraction and identification of pathogenic fungi. Methods of activation, culture, resistance test of actinobacteria and bacteria against pathogenic molds by disk diffusion method. Research on the influence of culture medium, pH, temperature, ability to use nitrogen source, salt tolerance on the growth of actinobacteria, bacteria. Experiment designed to test the resistance of selected microorganisms against the green mold disease in infected Ganoderma mushrooms under in vitro conditions. Main findings and conclusions: 1. From the specimens of infected Ganoderma lucidum. We isolated the strain of pathogenic mold and signed LC1. Artificial reinfection successful conducted to confirm the pathogenicity of the LC1 strain. 2. Research on morphological characteristics and biological characteristics of LC1 showed that LC1’s colony has green color, it is aerial mycelium, spore easily disperse. LC1 grow well in lactose, saccharose, and mantose environments, especially on mediums containing D-glucose. Develop in wide temperature and pH range, optimum temperature is between 25-30oC and optimum pH is 5.5-6.5. x 3. By analyzing the biological characteristics associated with the identification results, the LC1 strain closely relate to Penicillium citrinum and we named it Penicillium citrinum LC1 . 4. An actinobacterial strain: 116 and two bacterial strains: GL01, KCO3 are selected have strongly resistance agianst to LC1 in in vitro condition. 5. By researching on the morphological and biological characteristics, an actinobacteria strain: 116 is branched aerial mycelium , straight filaments, aseptate hyphae, short chains of oval spores. We estimate that the actinobacterium strain: 116 belong to the Streptomyces genus. 6. From the experiment to to test the resistance of selected microorganisms against the green mold disease in infected Ganoderma mushrooms under in vitro conditions. The result show that the actinobacteria strain: 116 can reduce the spread of lesions but isn’t able to completely eradicate the green molds disease on the infected Ganoderma mushrooms. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm Linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae). Nấm Linh chi còn có những tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung. Nấm Linh chi là một dược liệu mà con người từ xa xưa đã biết dùng làm thuốc. Trong "Thần nông bản thảo" xếp Linh chi vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm. Trong "Bản thảo cương mục" coi Linh chi là loại thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày); gần đây các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật phát hiện nấm linh chi còn có tác dụng phòng và chống ung thư, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ. Ở các nước Đông Nam Á, nhất là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan...việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô rộng lớn, cả về phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý...Tuy nhiên, hiện nay có rất nhiều bệnh làm giảm chất lượng và sản lượng gây thiệt hại đến năng suất nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng, đáng chú ý là bệnh nấm mốc xanh. Do đó chúng ta cần phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm mốc gây bệnh trên nấm Linh chi đồng thời tìm kiếm và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm mốc xanh làm cơ sở để đưa ra giải pháp phòng chống bệnh. Trong nền nông nghiệp hiện đại người ta sử dụng nhiều chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật để thay thế dần các hóa chất vốn đã rất độc hại với con người và môi trường. Vì thế việc thay thế thuốc trừ sâu hóa học bằng các chế phẩm sinh học là giải pháp an toàn và hiệu quả, khắc phục được nhược điểm từ nông dược trong bảo vệ thực vật và sức khỏe cộng đồng. Xuất phát từ những lý do trên và được sự cho phép của bộ môn cũng như thầy hướng dẫn, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro”. 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI  Phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi. 1  Tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm mốc xanh. gây bệnh trên nấm Linh chi và nghiên đặc điểm sinh học của các chủng tuyển chọn được.  Đánh giá được khả năng đối kháng của vi sinh vật trên trực tiếp cây Linh chị bị nhiễm nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro. 1.3. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI  Phân lập được chủng nấm mốc xanh từ các mẫu nấm Linh chi bị nhiễm bệnh.  Lây nhiễm nhân tạo để xác định chính xác khả năng gây bệnh.  Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm mốc xanh gây bệnh đã phân lập.  Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm mốc xanh.  Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh.  Xác định được khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của chủng vi sinh vật trên trực tiếp cây Linh chi trong điều kiện in vitro. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. NẤM LINH CHI 2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một loài nấm thường được tìm thấy ở các nước Á Đông. Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người. Những loại nấm Linh chi được sử dụng rộng rãi trong y học gồm: G. lucidum, G. luteum Steyaert, G. atrum Zhao, Xu and Zhang, G. tsugae Murrill, G. applanatum (Pers.: Wallr.) Pat., G. australe (Fr.) Pat., G. capense (Lloyd) Teng, G. tropicum (Jungh.)Bres., G. tenue Zhao, Xu and Zhang, and G. sinense Zhao, Xu and Zhang. Ở mỗi nơi nấm linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo hai cuốc sách rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán) và “Ben Cao Gang Mil” của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập. Tuy nhiên, trong các văn bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ. Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm Linh chi. Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất nhiều loại khác nhau dựa vào quả thể cũng như hình dáng bên ngoài của nấm. Ở phương Tây, theo bảng phân loại của Alexopolus năm 1979, Lingzhi thuộc giống nấm Linh chi và là thành viên của họ Myceteae, lớp Basidiomycetes chi Aphyllophorales và thuộc họ Polyporaceae. Đầu năm 1881, Karsten, nhà thực vật học người Phần Lan, đã đưa ra đặc điểm phân loại của nấm Linh chi dựa vào 3 lớp biểu bì bên ngoài của nấm. Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho chủng loại nấm này. Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, … Sau khi họ đã tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ. Cũng từ đó, nấm Linh chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa. 2.1.2. Tình hình trồng nấm Linh chi Theo Wuang. X. J. (Chang, 1993) thì từ đầu thế kỷ 17 (1621) các loại Nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính bởi giá tri dược liệu của chúng. Gần nay người lại tìm thấy trên núi Maiji tỉnh Gansu, một tấm bia đá khắc năm 1124 ghi chép về nuôi trồng 38 loại nấm Linh chi. Ngày nay, thế giới hàng năm sản xuất được khoảng 4.300 tấn, riêng Trung Hoa trồng khoảng 3000 tấn còn lại là các nước khác như Hàn Quốc, Nhật Bản, Ðài Loan, Hoa Kỳ, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Sri Lanka và Indonesia. Nhật bản có nghề trồng nấm truyền thống mỗi năm thu đạt gần 1 triệu tấn nấm. Nhật Bản là nước có sản lượng nấm cao nhất thế giới. Nấm Linh chi vẫn được coi là “thượng dược” được xếp vào hàng siêu dược liệu, trên cả nhân sâm (Panax ginseng). Giá bán tính ra tại thị trường Nhật Bản lên tới trên 200 USD/kg thể quả khô đóng gói. Hàn Quốc nổi tiếng với nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) mỗi năm suất khẩu thu về hàng trăm triệu USD. Ở Trung Quốc từ những năm 1960 bắt đầu trồng nấm có áp dụng các biện pháp cải tiến kỹ thuật nên năng suất tăng gấp 4-5 lần và sản lượng tăng vài chục lần. Hàng năm Trung Quốc xuất khẩu hàng triệu tấn nấm sang các nước phát triển thu về nguồn ngoại tệ hàng tỷ đô la. Hiện nay Trung Quốc đã dùng kỹ thuật (Khuẩn thảo học) để trồng nấm nghĩa là dùng các loại cỏ, cây thân thảo để trồng thay cho gỗ rừng và nguồn nguyên liệu tự nhiên ngày càng cạn kiệt. Ở Đài Loan, Peng (1990), Hseu (1992) báo cáo đã sưu tầm, nuôi trồng tới hơn 10 loài Ganoderma khác nhau. Song Trung Quốc vẫn được thừa nhận là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng, sản xuất nấm Linh chi (Zhao et Zhang, 1994). Hàn Quốc cũng chiếm một thị phần đáng kể. Đài Loan áp dụng các kỹ thuật tiên tiến và công nghiệp hóa trong nghề nấm đã có mức tăng trưởng tăng hàng trăm lần. 4 Các nước vùng Đông Nam Á gần nay cũng bắt đầu công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi. Malaysia chú trọng cải tiến các quy trình nuôi trồng nấm Linh chi ngắn ngày trên các phế thải giàu chất xơ, thậm chí cho thu hoạch thể quả chỉ sau 40 ngày (Teow et al., 1994). Ở Thái Lan đã có một số trạng trại cỡ vừa nuôi trồng Ganoderma lucidum. Linh chi cũng được nuôi trồng từ 1929 ở Ấn Độ (Bose,1929) và phát triển ở qui mô nhỏ. Ngày nay nhiều nước trên thế giới như Thái Lan, Malaysia, Mỹ,... nuôi trồng và đã sản xuất nấm cùng các chế phẩm Linh chi làm thuốc và dược phẩm dưỡng sinh. Hằng năm doanh thu của các chế phẩm chống ung thư điều chế từ linh chi ở Đài Loan đạt trên 350 triệu USD. Ở Việt Nam viện Dược liệu - Hà Nội đã trồng nấm Linh chi (giống Trung Quốc) thành công vào năm 1987. Chín năm sau, các nhà khoa học thuộc Đại học khoa học tự nhiên đã chọn được giống nấm Linh chi mọc hoang ở rừng núi Lâm Đồng để nhân giống và đưa vào sản xuất tại trại trồng nấm Linh chi của Xí nghiệp Dược Phẩm Trung ương 24, đạt kết quả tốt vào năm 1988. Tại Việt Nam, Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác đã nói về Linh chi từ lâu và Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “Nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam”. Song gần nay, loài chuẩn Ganoderma lucidum mới được nuôi trồng thành công trong phòng thí nghiệm (1978) và vào thập niên 90, Linh chi mới thật sự bùng nổ tại TP. Hồ Chí Minh (Đỗ Tất Lợi et al., 1994), sản lượng hàng năm mới đạt khảng 10 tấn/năm (Cổ Đức Trọng, 1991, 1993). Nghề trồng nấm ở Việt Nam đang phát triển những quy mô nhỏ lẻ hộ gia đình, trang trại mỗi năm sử dụng vài tấn nguyên liệu có sẵn tới vài trăm tấn /1 cơ sở để sản xuất nấm. Nhìn chung nghề trồng nấm linh chi phát triển mạnh và rộng khắp, đem lại hiệu quả kinh tế rất lớn, nhất là trong 20 năm gần đây. Trong sinh học nhờ sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong nghề nấm về chọn tạo giống nấm, về kỹ thuật nuôi trồng và sự bùng nổ thông tin, nghề trồng nấm đã và đang phát triển trên toàn thế giới, được coi là nghề xóa đói giảm nghèo và làm giàu thích hợp với các vùng nông thôn, miền núi. 2.1.3. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học Linh chi (Ganoderma) có chu trình sống giống các loại nấm đảm khác, vị trí phân loại như sau:  Ngành: Eumycote 5  Lớp: Basidiomycetes  Bộ: Polyporales  Họ: Ganodermataceae  Chi: Ganoderma  Loài: Ganoderma lucidum  Đặc điểm sinh học *) Cấu tạo Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành một chi riêng, là Ganoderma Karst. (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 thứ.  Quả thể nấm linh chi cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối điện với mũ nấm).  Cuống nấm dài hoặc ngắn hay không cuống, đính bên có hình trụ đường kính 0,5-3cm. Cuống nấm cứng, ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm.  Mũ nấm (tai nấm) hoá gỗ, xoè tròn, khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt, hình bầu dục hoặc thận. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím, nhẵn, được phủ bởi lớp sắc tố bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2-15cm, dày 0,81,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li ti, là nơi hình thành và phóng thích bào tử nấm. Bào tử nấm dạng trứng cụt với hai lớp vỏ, giữa hai lớp vỏ có nhiều gai nhọn nối từ trong ra ngoài.  Phần thịt nấm dày từ 0,4 - 2,2 cm, màu vàng kem - nâu nhợt - trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới. Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên. Trên lát cất trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợì phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vầo nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 - 0,5 mm). Tầng sinh sản (bào tầng - thụ tầng - hyménium) là một lớp ống dày từ 0,2 - 1,8 cm màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3 -35 ống/mm. Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng hình chùy, không màu dài 16 - 22 |nm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores). 6 Hình 2.1. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi - Phần thịt nấm dày từ 0,4 - 2,2 cm, màu vàng kem - nâu nhợt - trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới. Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên. Trên lát cất trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợì phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vầo nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 - 0,5 mm). - Tầng sinh sản (bào tầng - thụ tầng - hyménium) là một lớp ống dày từ 0,2 - 1,8 cm màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3 -35 ống/mm. Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng hình chùy, không màu dài 16 - 22 |nm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores). *) Thành phần hóa học và của nấm Linh chi Theo Wachtel-Galor et al. (2011), loại nấm này có thành phần hoạt chất sinh học khá đa dạng, chứa vitamin, khoáng chất, có tất cả acid amin thiết yếu (đặc biệt giàu leucine và lysine). Hàm lượng chất béo thấp và tỉ lệ acid béo không no cao là một trong những tính chất quan trọng tạo nên giá trị cho nấm Linh chi. Không như nhiều loài nấm khác có hàm lượng nước đến 90%, nấm Linh chi tươi chỉ chứa khoảng 75% nước. Thành phần chủ yếu của G. lucidum là chất xơ, carbohydrate, chất béo và protein, trong đó tỉ lệ xơ thô là trên 50% khối lượng khô (Mau et al., 2001; Wasser, 2010). Các nghiên cứu cho thấy thể quả, khuẩn ty và bào tử của nấm có chứa khoảng 400 hoạt chất sinh học khác nhau, chủ yếu là các polysaccharide, triterpenoid, nucleotide, acid béo, sterol, steroid, protein/peptide, các nguyên tố vi lượng. 7 Trong nghiên cứu của Mizuno (1995), chiết xuất G. lucidum chứa các kim loại như kali, magnesi, calci, natri, sắt, kẽm, mangan, đồng, selenium và germanium; trong đó kali, magnesi, calci là những thành phần kim loại chính, và germanium đứng thứ 5 trong số các kim loại có hàm lượng cao nhất (489 µg/g). Polysaccharide và triterpenoid được xem là những hoạt chất quan trọng nhất trong Linh chi (Skalicka-Woźniak et al., 2012; Wasser, 2010). Dựa vào nhiều kết quả nghiên cứu, Wachtel-Galor et al. (2011) nhận định rằng trong G. lucidum còn có các hợp chất khác được xem là có tác dụng dược lý như một số protein và lectin. Các protein có hoạt tính sinh học đã được phát hiện bao gồm: Ling Zhi-8; G. lucidum peptide có hoạt tính bảo vệ gan và chống oxy hóa; ganodermin có tác dụng kháng nấm từ thể quả G. lucidum. Một số lectin được tách chiết từ thể quả và khuẩn ty của Linh chi có khả năng làm đông tụ hồng cầu hoặc tăng cường chức năng miễn dịch. Các thành phần khác gồm enzyme như metalloprotease làm chậm quá trình đông máu; tác nhân ức chế αglucosidase rất đặc hiệu từ thể quả của Linh chi,... *) Cấu tạo thành tế bào của nấm Thành tế bào nấm được câu tạo từ β-(1,3)-glucan , Mannoprotein và chitin Hình 2.2. Cấu tạo thành tế bào của nấm Nguồn: Carmen Sánchez (2016) 8