Tài liệu Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HOÀNG THỊ BÍCH Nghiªn cøu sö dông kÕt hîp enzyme trong chiÕt t¸ch vµ lµm giµu mét sè s¶n phÈm nguån gèc thiªn nhiªn LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HOÀNG THỊ BÍCH Nghiªn cøu sö dông kÕt hîp enzyme trong chiÕt t¸ch vµ lµm giµu mét sè s¶n phÈm nguån gèc thiªn nhiªn Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất tự nhiên Mã số: 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Mai Hương 2. PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến HÀ NỘI - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được hình thành và phát triển từ những quan điểm của cá nhân tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Lê Mai Hương và PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận án này. Tác giả luận án Hoàng Thị Bích ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Lê Mai Hương và PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến, những người thầy bằng cả tâm huyết của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu và chia sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi nghiên cứu luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. TS. Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, cùng ban lãnh đạo Viện, bộ phận đào tạo của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện rất nhiều cho tôi hoàn thành luận án của mình Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các anh chị phụ trách của Học Viện Khoa học Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị em đồng nghiệp Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các SPTN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi cảm ơn đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tạo chế phẩm acid béo đa nối đôi (n3 - PUFA) từ nguyên liệu tự nhiên bổ sung vào thức ăn ương nuôi một số đối tượng cá biển chủ lực” và “Nghiên cứu thành phần hóa học, điều tra và đánh giá chất lượng tinh dầu trầm hiện đang được sản xuất ở Việt Nam”, mã số VAST 04; đã tài trợ kinh phí. Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên để tôi có động lực trong công việc và hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này. Xin chân thành cảm ơn! Tác giả Hoàng Thị Bích iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ............................................................................................................... i Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt .................................................................... vii Danh mục bảng ......................................................................................................... ix Danh mục hình vẽ .......................................................................................................x MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Tổng quan về ứng dụng công nghệ enzyme - giải pháp “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ... 3 1.1.1. “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ............................................................................... 3 1.1.2. Cơ sở ứng dụng enzyme hỗ trợ chiết xuất các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ............................................................................... 4 1.1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bởi enzyme ..... 7 1.1.4. Lợi ích và khó khăn khi ứng dụng công nghệ EAE ....................... 9 1.2. Các enzyme sử dụng trong công nghệ enzyme hỗ trợ chưng cất (EAD) và enzyme hỗ trợ chiết xuất (EAE)............................................................. 10 1.2.1. Các enzyme phân giải cấu trúc thành tế bào nguyên liệu lignocellulose ............................................................................... 10 1.2.2. Enzyme protease phân giải cấu trúc nguyên liệu giàu protein ..... 16 1.2.3. Enzyme lipase thủy phân lipid thành axit béo tự do .................... 19 1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất và làm giàu các hợp chất thiên nhiên trong và ngoài nước......................... 22 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 22 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước .......................................................... 26 1.4. Tổng quan về quế Cinnamomum cassia ................................................ 27 iv 1.4.1. Giới thiệu về Quế C.cassia........................................................... 27 1.4.2. Những nghiên cứu về thành phần hóa học C. cassia ................... 29 1.4.3. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học C. cassia ...................... 31 1.4.4. Các phương pháp chiết xuất tinh dầu quế .................................... 33 1.5. Tổng quan về cá ngừ .............................................................................. 35 1.5.1. Sản lượng và giá trị dinh dưỡng của phụ phẩm cá ngừ................ 35 1.5.2. Dầu cá và các axit béo không no đa nối đôi n-3 PUFA ............... 37 1.5.3. Các phương pháp chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo không no .................................................................................................. 39 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....41 2.1. Nguyên liệu ............................................................................................ 42 2.1.1. Mẫu nguyên liệu ........................................................................... 42 2.1.2. Enzyme sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 43 2.1.3. Bộ chủng vi sinh vật kiểm định .................................................... 44 2.1.4. Dòng tế bào .................................................................................. 45 2.2. Hóa chất, thiết bị .................................................................................... 45 2.2.1. Hóa chất ........................................................................................ 45 2.2.2. Thiết bị ......................................................................................... 46 2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 46 2.3.1. Các phương pháp phân tích hóa sinh ........................................... 46 2.3.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học ......................... 46 2.3.3. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme ................................ 47 2.3.4. Các phương pháp thủy phân ......................................................... 49 2.3.5. Các phương pháp xác định sản phẩm thủy phân .......................... 50 2.3.6. Phương pháp làm giàu các axit béo bằng kết tinh ure ................. 52 2.3.7. Các phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu .................................. 52 2.3.8. Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học ............................. 53 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .............................................................................54 3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia ................................ 54 v 3.1.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền và tinh dầu của mẫu cành lá và mẫu vỏ quế C. cassia ........................................................... 55 3.1.2. Nghiên cứu tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng cất tinh dầu ................................................................ 55 3.1.3. Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 ................................................................ 58 3.2. Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ...... 60 3.2.1. Nghiên cứu phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A. crassna........................................................................................... 60 3.2.2. Nghiên cứu thăm dò tác động của việc xử lý enzyme Laccase- Htec2 lên quá trình chưng cất tinh dầu từ bột gỗ gió bầu A. crassna ........ 60 3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares ... 61 3.3.1. Nghiên cứu thành phần chất nền và lipid tổng của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam .................................................................... 62 3.3.2. Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chiết xuất lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T. albarcares ..................................................... 62 3.3.3. Nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase kết hợp ure trong quá trình làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T. albacares ...................................................................................... 64 CHƯƠNG 4. KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................66 4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia................. 66 4.1.1. Kết quả phân tích các chất nền và tinh dầu của cành lá và vỏ quế C. cassia ............................................................................................ 66 4.1.2. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia ............................................ 71 4.1.3. Tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên quá trình chưng cất tinh dầu từ vỏ quế C. cassia ................................................... 85 vi 4.1.4. Kết quả tìm điều kiện tối ưu cho quá trình ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu từ cành lá và vỏ quế . 95 4.2. Kết quả thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ............. 106 4.2.1. Kết quả phân tích thành phần chất nền của bột gỗ gió bầu A. crassna ........................................................................................ 106 4.2.2. Kết quả thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên hàm lượng và thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu A. crassna ....................................................................................... 107 4.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares ............................................................................................. 111 4.3.1. Kết quả nghiên cứu các chất nền và thành phần axit béo của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam .................................................... 111 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T. albarcares ................................................... 115 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase CRL trong quá trình làm giàu các axit béo n-3 PUFA của dầu đầu cá ngừ vây vàng T. albacares bằng phương pháp ure ............................................... 118 4.3.4. Đề xuất qui trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T. albacares .................................................................................... 126 KẾT LUẬN ................................................................................................ 130 KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 132 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................ 133 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................. 134 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ALA : Alpha linolenic acid Axit Alpha linolenic CMC : Carboxymethylcellulose Carboxymethylcellulose DHA : Docosahexaenoic acid Axit Docosahexaenoic DMSO : Dimethyl Sulphoxide Dimethyl Sulphoxide DNS : 3,5-dinitrosalicylic acid 3,5-dinitrosalicylic acid DPA : Docosapentaenoic acid Axit Docosapentaenoic DPPH : Diphenylpicrylhydrazyl Diphenylpicrylhydrazyl EAD : Enzyme assisted distillation Chưng cất có enzyme hỗ trợ EAE : Enzyme assisted extraction Chiết xuất có enzyme hỗ trợ EAMD : Enzyme assisted microway extraction Chiết xuất có enzyme kết hợp vi sóng EDTA : Ethylene Diamine Triacetic Acid Ethylene Diamine Triacetic Acid EPA : Eicosapentaenoic acid Axit Eicosapentaenoic FAO : Food and Agriculture Organization of Tổ chức Lương nông Thế giới the United Nations FPH : Fish protein hydrolysate Protein thủy phân từ cá GC : Gas chromatography Sắc ký khí GC-MS : Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký kết hợp khối phổ HD : Hydrodistillation Chưng cất lôi cuốn hơi nước Hep-G2 : Human hepatocellular carcinoma Dòng tế bào ung thư gan HPLC : High Performanc/e liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography Htec2 : Cellic HTec2 Enzyme Enzym Cellic HTec2 IC50 : Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% KPH : Không phát hiện Laccase : Laccase enzyme Enzym laccase viii LD100 Liều lượng gây chết cho 100% số : Lethal Dose at 100% động vật thử nghiệm LU : Human lung adenocarcinoma Dòng tế bào ung thư phổi MCF-7 : Michigan Cancer Foundation 7 Dòng tế bào ung thư vú MIC : Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MTT :(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazolium Bromide Diphenyltetrazolium Bromide MUFA : Monounsaturated fatty acid Axit béo không no 1 nối đôi NO : Nitric oxid Nitơ mônôxit PUFA : Polyunsaturated fatty acid Axit béo không no đa nối đôi RD : Human rhabdomyosarcoma Dòng tế bào ung thư mô liên kết SCFE : Supercritical fluid extraction Chiết Siêu tới hạn SE : Solvent extraction Chiết xuất bằng dung môi SFA : Saturated fatty acid Axit béo no TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TLC : Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TT : Thứ tự TS : Transition state Trạng thái chuyển USD : United States dollar Đô la Mỹ USDA : United States Department of Bộ Nông nghiệp Hoa kỳ Agriculture VSV : Vi sinh vật ix DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong một số loại sinh khối.........................11 Bảng 1.2. Tỉ lệ các thành phần của cá ngừ ...................................................36 Bảng 3.1. Một số thông số thủy phân nguyên liệu cành lá quế và vỏ quế..............56 Bảng 3.2. Một số thông số của quá trình thủy phân bởi enzyme protease..............62 Bảng 4.1. Kết quả phân tích chất nền của nguyên liệu ...........................................66 Bảng 4.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu ...............................67 Bảng 4.3. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức độ thủy phân các chất nền và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế..............72 Bảng 4.4. Hàm lượng tinh dầu thu nhận theo thời gian chưng cất mẫu cành lá quế có và không có enzyme hỗ trợ.......................................................................................73 Bảng 4.5. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được từ cành lá quế có và không có xử lý với enzyme......................................................79 Bảng 4.6a. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.................................81 Bảng 4.6b. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên 03 dòng tế bào ung thư.........82 Bảng 4.6c. Kết quả thử khả năng ức chế sự sinh NO trên tế bào RAW 264.7.........83 Bảng 4.6d. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH...............................84 Bảng 4.7. Kết quả khảo sát tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên mức độ thủy phân thành tế bào và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ vỏ quế......................85 Bảng 4.8. Hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu vỏ quế có và không có enzyme hỗ trợ...........................................................................................................87 Bảng 4.9. Kết quả phân tích GC-MS các thành phần hóa học của tinh dầu thu được từ vỏ quế có và không có xử lý với enzyme.............................................................93 Bảng 4.10a. Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng.......................................100 Bảng 4.10b. Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm...................................101 Bảng 4.11a. Kết quả phân tích thành phần bột gỗ gió bầu A. crassna...................107 Bảng 4.11b. Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu trầm hương thu được từ gỗ cây gió bầu A. crassna bằng 2 phương pháp khác nhau.....................................107 Bảng 4.12. Thành phần các chất nền của một số loại đầu cá ngừ của Việt Nam...........111 x Bảng 4.13. Thành phần axit béo trong các mẫu lipid thu được từ đầu một số loài cá ngừ của Việt Nam..................................................................................................113 Bảng 4.14. Sản phẩm của quá trình chiết xuất lipid..............................................115 Bảng 4.15. Thành phần axit béo của các lipid chiết xuất từ đầu cá ngừ vây vàng T. albacare bằng các phương pháp khác nhau....................................................116 Bảng 4.16a. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự do của lipase CRL......................................................................................................119 Bảng 4.16b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố pH......120 Bảng 4.17a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự do của lipase CRL..................................................................................................120 Bảng 4.17b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ...........................................................................................................................121 Bảng 4.18a. Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự do của lipase CRL...............................................................................121 Bảng 4.18b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất ...............................................................................................................................122 Bảng 4.19a. Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến quá trình thủy phân lipid thành axit béo tự do của enzyme lipase..................................................................................122 Bảng 4.19b. So sánh giá trị thực nghiệm và tính toán ảnh hưởng của thời gian thủy phân ...............................................................................................................................122 Bảng 4.20. Thành phần axit béo trước và sau khi làm giàu n-3 PUFA.................124 Bảng 4.21a. Các chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm axit béo giàu n-3 PUFA................129 Bảng 4.21b. Các thành phần axit amin tự do của sản phẩm bột đạm hòa tan giàu axit amin........................................................................................................................129 xi DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1. So sánh năng lượng của phản ứng có và không có xúc tác nhờ enzyme ............................................................................................ 5 Hình 1.2. Chiết xuất các hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose 6 Hình 1.3. Công nghệ enzyme kết hợp dung môi sinh học chiết xuất các hợp chất thiên nhiên ............................................................................... 7 Hình 1.4a. Các đơn vị cơ bản của lignin ....................................................... 11 Hình 1.4b. Cấu trúc của lignin ...................................................................... 12 Hình 1.5a. Công thức hóa học của cellulose ................................................ 13 Hình 1.5b. Cơ chế phân giải cellulose của hệ enzyme cellulase ................. 14 Hình 1.6a. Cấu trúc polymer xylan .............................................................. 15 Hình 1.6b. Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan ..... 15 Hình 1.7. Phản ứng thủy phân protein của enzyme protease ........................ 17 Hình 1.8. Phân tử lipid và các vị trí thủy phân của enyme lipase ................. 20 Hình 1.9a. Cành lá và hoa C. cassia ............................................................. 27 Hình 1.9b. Cây C. cassia ............................................................................... 27 Hình 1.10a. Một số polyphenol trong quế Cinnamomum............................. 29 Hình 1.10b. Một số thành phần chính và phụ trong tinh dầu C. cassia ........ 30 Hình 1.11. Sơ đồ chưng cất tinh dầu quế có nồi hơi riêng............................ 34 Hình 1.12. Cấu trúc của một số acid béo nhóm n-3 PUFA .......................... 38 Hình 2.1. Mẫu cành lá quế Cinnamomum cassia .......................................... 42 Hình 2.2. Mẫu vỏ quế Cinnamomum cassia ................................................. 42 Hình 2.3. Mẫu bột gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna ................................... 42 Hình 2.4. Mẫu đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares .............................. 43 Hình 2.5. Đồ thị đường chuẩn Glucose theo phương pháp DNS.................. 51 Hình 2.6. Đồ thị đường chuẩn protein .......................................................... 51 Hình 3.1. Qui trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất tinh dầu 54 Hình 3.2. Quy trình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất lipid và làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ ................................................ 61 xii Hình 3.3. Ba pha sản phẩm sau ly tâm .......................................................... 63 Hình 4.1a. Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid ....................... 69 Hinh 4.1b. Một số thành phần thuộc nhóm sesquiterpenoid ......................... 70 Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân các chất nền và hiệu suất chưng cất tinh dầu từ cành lá quế ...................... 72 Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu cành lá quế có và không có enzyme hỗ trợ................................... 74 Hình 4.4a. Sắc ký đồ của tinh dầu cành lá quế chưng cất theo cách thông thường, nguyên liệu không qua xử lý enzyme ............................ 75 Hình 4.4b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme Laccase EAD .............................................................................. 76 Hình 4.4c. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với enzyme Htec2 EAD ................................................................................. 77 Hình 4.4d. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Laccase-Htec2 ............................................................... 78 Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mức độ thủy phân thành tế bào và tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế ............................................ 86 Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất mẫu vỏ quế có và không có enzyme hỗ trợ .......................................... 87 Hình 4.7a. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu không xử lý enzyme ..... 89 Hình 4.7b. Sắc ký đồ tinh dầu cành lá quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Laccase- EAD ............................................................... 90 Hình 4.7c. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Htec2-EAD ................................................................................. 91 Hình 4.7d. Sắc ký đồ tinh dầu vỏ quế, nguyên liệu qua xử lý với hệ enzyme Laccase - Htec2- EAD ................................................................ 92 Hình 4.8a. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của pH lên hàm lượng đường khử ................................................................................................ 96 Hình 4.8b. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của nhiệt độ lên hàm lượng đường khử ................................................................................... 97 xiii Hình 4.8c. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Laccase/cơ chất lên hàm lượng đường khử ......................................................................... 97 Hình 4.8d. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Htec2/cơ chất lên hàm lượng đường khử ......................................................................... 98 Hình 4.8e. Bảng và đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên hàm lượng đường khử ................................................................................... 99 Hình 4.9a. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x1x2 .......................... 104 Hình 4.9b. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x2x4 .......................... 104 Hình 4.9c. Mặt đáp ứng vùng tối ưu của cặp yếu tố x3x5 .......................... 104 Hình 4.10. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp LaccaseHtec trong chưng cất tinh dầu từ cành lá quế C. cassia ............ 105 Hình 4.11. Một số thành phần đặc trưng của tinh dầu trầm hương ............ 110 Hình 4.12. Tinh thể ure kết hợp với axit béo bão hòa................................. 123 Hình 4.13. Sắc ký đồ các axit béo sau khi làm giàu ................................... 124 Hình 4.14. Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng. 126 1 MỞ ĐẦU Ô nhiễm môi trường cũng như sức khỏe người tiêu dùng đã dẫn đến nhu cầu cấp thiết là tìm ra các phương pháp thu nhận các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên theo hướng “Xanh” nhằm tăng năng suất, giảm thời gian, tận dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu và giảm ô nhiễm môi trường. Rất nhiều các nỗ lực nghiên cứu để cải thiện năng suất cũng như chất lượng các hoạt chất, trong đó ứng dụng công nghệ enzyme hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên đang phát triển mạnh mẽ trong vài chục năm trở lại đây và bước đầu đưa ra tính khả thi trong công nghiệp. Đây được coi là một trong những giải pháp “Xanh” trong chiết xuất các HCTN do giảm lượng dung môi, sử dụng các dung môi thay thế, tạo ra các sản phẩm sạch “organic” và phế liệu của quá trình cũng ở dạng dễ phân hủy, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm cộng với đường bờ biển trải dài qua nhiều vĩ tuyến khác nhau nên nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt Nam vô cùng phong phú với hệ thực vật đặc trưng và nguồn sinh vật biển đa dạng. Trong đó phải kể đến cây Quế (nguồn dược liệu) và cá ngừ (nguồn lợi thủy sản) là những mặt hàng có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng và giá trị xuất khẩu đầy tiềm năng. Sản phẩm dầu từ quế và cá ngừ ngày càng được chú trọng bởi chúng có giá trị cao. Tinh dầu quế là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, dầu cá ngừ chứa hàm lượng lớn các acid béo không no đa nối đôi PUFAs (polyunsaturated fatty acids), đặc biệt là nhóm axit béo không no đa nối đôi thiết yếu omega 3 như DHA và EPA có vai trò quan trọng trong các lĩnh vực y, dược và công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên trong công nghiệp, quá trình sản xuất hai loại dầu này vẫn sử dụng các phương pháp truyền thống (cất cuốn hơi nước, ép nhiệt) chưa phát huy được hết hiệu quả chiết xuất, gây lãng phí nguồn nguyên liệu. Ngày nay, những tiến bộ trong công nghệ sinh học, công nghệ enzyme có khả năng sản xuất một lượng lớn enzyme có hoạt lực cao, phổ cơ chất rộng... thì công nghệ “XANH” ứng dụng enzyme hỗ trợ quá trình chiết xuất các hợp chất thiên nhiên (enzyme assisted extraction- EAE) nhằm tăng hiệu suất, thay thế dung môi hữu cơ là 2 vấn đề cấp thiết [134]. Nhằm mục đích tăng hiệu suất chiết tách, phát triển hướng nghiên cứu mới - chiết xuất và làm giàu các HCTN bằng enzyme hỗ trợ, chúng tôi lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên” với các đối tượng được lựa chọn là cành lá quế, vỏ quế C. cassia, gỗ gió bầu A. crassna và phụ phẩm đầu cá ngừ. Trong nghiên cứu này, quá trình chưng cất tinh dầu, quá trình chiết xuất lipid, làm giàu các n-3 PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ được thử nghiệm kết hợp với một số enzyme có sẵn nhằm đánh giá hiệu quả tác động của enzyme lên chất lượng sản phẩm tạo thành. Một số thông số tối ưu của quá trình xử lý bằng enzyme được khảo sát và tối ưu hóa bằng qui hoạch thực nghiệm. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme vào quá trình chiết xuất và làm giàu các sản phẩm tinh dầu (từ lá và cành quế, vỏ quế Cinnamomum cassia, trầm hương từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna) và các axit béo n-3PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ nhằm làm tăng hiệu quả và phát triển hướng nghiên cứu “XANH” trong khai thác các SPTN. Nội dung chính của luận án bao gồm: - Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chưng cất tinh dầu từ các bộ phận khác nhau của cây quế Cinnamomum cassia: tác động của việc xử lý nguyên liệu với enzyme được đánh giá qua hiệu suất, thời gian chưng cất, chất lượng sản phẩm tinh dầu (thành phần hóa học, hoạt tính sinh học). - Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 trong chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ cây gió bầu Aquilaria crassna. - Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp trong chiết xuất lipid và làm giàu các axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares: tác động của enzyme lên quá trình được đánh giá qua thành phần axit béo n-3 PUFA. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về ứng dụng công nghệ enzyme - giải pháp “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên 1.1.1. “Hóa học xanh” trong chiết xuất và làm giàu các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Mọi sinh vật, đặc biệt là thực vật trên cạn và sinh vật biển đều có chứa các hoạt chất sinh học có khả năng ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm... Những hợp chất này được gọi là những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi hữu cơ (solvent extraction- SE) vẫn đang được sử dụng rộng rãi trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên từ các nguyên liệu khác nhau như trầm tích, đất, polymer, vi khuẩn, nấm, tảo, vi tảo và phổ biến nhất là thực vật. Ưu điểm của phương pháp sử dụng dung môi là dễ thao tác, tuy nhiên, các dung môi lại độc cho người và nguy hại đến môi trường. Nhận thức này đã dẫn đến nhu cầu ngày càng tăng cho các sản phẩm được sản xuất thông qua quá trình thân thiện với môi trường còn được gọi “Hóa học xanh” [121]. Hóa học Xanh, còn gọi là hóa học bền vững là một phần của hóa học và công nghệ hóa học tập trung vào việc tạo ra những sản phẩm, qui trình giảm thiểu việc sử dụng hoặc phát sinh các chất độc hại. Hóa học xanh tập trung vào phương pháp tiếp cận công nghệ để ngăn ngừa ô nhiễm, giảm tiêu thụ nguồn tài nguyên không thể tái tạo. Trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên, quá trình chiết xuất “Xanh” liên quan đến việc sử dụng các dung môi thân thiện với môi trường sinh thái, nguyên liệu bền vững và tái tạo, giảm chất thải gây ô nhiễm môi trường [86]. Rất nhiều phương pháp để “Xanh hóa” những qui trình công nghệ hóa học. Những phương pháp này có thể thực hiện riêng lẻ hoặc phối hợp với các qui trình của công nghệ hóa học, nhằm mục tiêu làm tăng hiệu suất và giảm lượng thải độc hại. Trong báo cáo thường niên (xuất bản năm 2011) của cơ quan quản lý năng lượng và môi trường Pháp (French Environment and Energy Management Agency) với tựa đề: “Khó khăn khi thay thế hợp chất hữu cơ dễ bay hơi trong quá trình công nghiệp” đã trình bày các “giải pháp khắc phục kỹ thuật, hạn chế hoặc thay thế các dung môi 4 truyền thống” [86]. Hai trong số các giải pháp đặt ra đã hướng tới ứng dụng công nghệ enzyme với tự đề: + Giải pháp cơ học kết hợp tiền xử lý enzyme + Chiết nước kết hợp tiền xử lý enzyme Ngày nay, những tiến bộ trong xúc tác enzyme, sự đa dạng và sẵn có của các enzyme công nghiệp cộng với tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng thì các giải pháp công nghệ, trong đó có công nghệ chiết xuất có enzyme hỗ trợ (enzyme assisted extraction, viết tắt là EAE) nhằm thay thế dung môi hữu cơ là vấn đề cấp thiết [134]. 1.1.2. Cơ sở ứng dụng enzyme hỗ trợ chiết xuất các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu cơ chất lớn, xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học khác khó thể thực hiện [14]. Enzyme có tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học, có hoạt tính xúc tác lớn. Ở điều kiện thích hợp, hầu hết các enzyme xảy ra với tốc độ nhanh gấp 108 1011 lần so với phản ứng không có chất xúc tác. Bên cạnh đó, enzyme có tính đặc hiệu cao và tác dụng trong điều kiện êm dịu, nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động 30-50oC, pH trung tính và áp suất thường. Đặc biệt, hầu hết các enzyme có nguồn gốc tự nhiên không độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và y học [32]. Sinh vật thường được cấu tạo từ những đại phân tử tương đối trơ (polypeptid, polysaccharid) không có khả năng hòa tan trong dung môi hữu cơ [25]. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học thường tồn tại ở dạng không tan hoặc lưu giữ trong các bào quan dự trữ, hoặc tồn tại tại ở dạng keo kết hợp với các thành phần vách tế bào [108]. Muốn cắt đứt các liên kết và giải phóng chúng ra khỏi tế bào cần năng lượng hoạt hóa, tức là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứt các liên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới. Về lý thuyết, tốc độ phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa. Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì tốc độ phản ứng càng nhanh và ngược lại. 5 Bất kỳ enzyme nào cũng xúc tác theo trình tự sau: E + S  ES  EP E+ P Trong đó, E là enzyme, S là cơ chất, P là sản phẩm phản ứng. ES và EP là phức hợp enzyme với cơ chất và sản phẩm. Sơ đồ trên Hình 1.1 cho thấy đường cong của năng lượng phản ứng có và không có xúc tác enzyme Hình 1.1. So sánh năng lượng của phản ứng được và không được xúc tác nhờ enzyme [14] Ghi chú: TSc1, TSc2 và TSc3 là các trạng thái chuyển (transition state) [ES]: tổ hợp phức hệ enzyme-cơ chất [EP]: tổ hợp phức hệ enzyme- sản phẩm - Con đường không có xúc tác chỉ đi qua trạng thái chuyển tiếp TS* với năng lượng tự do Gkhông xúc tác cao, cần mức năng lượng hoạt hóa cao hơn. - Con đường đi qua phản ứng xúc tác enzyme đi qua các trạng thái chuyển tiếp TSc1, TSc2 và TSc3, với năng lượng tự do Gcó xúc tác thấp. Chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học, nó chỉ tham gia vào các giai đoạn trung gian mà không tham gia trực tiếp vào phản ứng. Năng lượng liên kết do các tương tác yếu tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng để làm căng hoặc uốn gấp khúc cơ chất, tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với cơ chất dễ dàng. Chính vì vậy, enzyme tạo được thế năng đặc biệt có lợi nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng, tạo ra vô số sản phẩm trong điều kiện nhiệt độ thấp, áp suất thường.