Tài liệu Nghiên cứu sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân DS. Trần Văn Thái Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công nghiệp Dƣợc. Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình. Trƣớc tiên, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.S. Đàm Thanh Xuân - ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS.Lê Ngọc Khánh và DS.Trần Văn Thái đã nhiệt tình giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi thực hiện đề tài. Đồng thời, xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dƣợc trong suốt quá trình làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu nhà trƣờng và toàn thể thầy cô giảng viên Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã hết sức quan tâm và hỗ trợ tôi trong cuộc sống và học tập. Do thời gian làm thực nghiệm cũng nhƣ kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận đƣợc sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Lệ Quyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................................... 2 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC ............................................................................. 2 1.1.1. Khái niệm về probiotic ................................................................................................. 2 1.1.2. Vai trò của probiotic .................................................................................................... 2 1.1.3. Các chủng probiotic phổ biến ...................................................................................... 3 1.1.4. Các thế hệ probiotic......................................................................................................... 3 1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus ......................................................... 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................................... 4 1.2.2. Tác dụng ....................................................................................................................... 4 1.3. PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ .............................................................................. 5 1.3.1. Khái niệm đông khô ..................................................................................................... 5 1.3.2. Ưu điểm của đông khô ................................................................................................. 5 1.3.3. Một số tá dược dùng bảo vệ trong đông khô................................................................ 6 1.4. VI NANG HOÁ ...................................................................................................... 6 1.4.1. Khái niệm ..................................................................................................................... 6 1.4.2. Đặc điểm ...................................................................................................................... 6 1.4.3. Phương pháp vi nang hoá bằng tách pha đông tụ ....................................................... 7 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................................... 12 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ................................................................................... 12 2.1.1. Chủng vi sinh vật ............................................................................................................ 12 2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................................... 12 2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ............................................................................ 12 2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ....................................................................... 12 2.1.5. Máy móc, dụng cụ ........................................................................................................... 13 2.2.Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 14 2.2.1. Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bộtvới alginat. ............................ 14 2.2.2. Khảo sát khả năng bảo vệ L. acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hoá. ................................................................................ 14 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 14 2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn .................................................................................................. 14 2.3.2. Phương pháp nhân giống................................................................................................ 14 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào .................................................................... 15 2.3.4. Phương pháp tạo hạt vi nang chứa L.acidophilus .......................................................... 15 2.3.5. Phương pháp đông khô ................................................................................................... 16 2.3.6. Phương pháp xác định hàm ẩm ...................................................................................... 16 2.3.7. Phương pháp xác định đường kính hạt vi nang .............................................................. 16 2.3.8. Phương pháp xác định độ trương nở của hạt vi nang .................................................... 17 2.3.9. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật trong hạt vi nang theo nguyên tắc pha loãng liên tục ........................................................................................................................... 18 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................... 20 3.1. Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bột vớialginat ....................... 20 3.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến thể chất hạt vi nang phối hợp tinh bột với alginat .................................................................................................................... 20 3.1.2. So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy ............ 22 3.2. Khảo sát khả năng bảo vệ L. acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng ...................................................... 28 3.2.1. Khảo sát khả năng bao gói và giải phóng vi sinh vật của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng.............................................. 28 3.2.2. So sánh tác dụng bảo vệ L. acidophilus của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng ................................................................................... 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ ACE : Acetylcholinesterase CFU (Colony-Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc Cps (Cycles per second) : Vòng/giây h : giờ LAB (Lactic acid bacterium) : Vi khuẩn lactic L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus L. gasseri : Lactobacillus gaseri L. rhamnosus : Lactobacillus rhamnosus B. longum : Bifidobacterium longum B. bifidum : Bifidobacterium bifidum MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lactic MT : Môi trƣờng VSV : Vi sinh vật WHO (World health organization) : Tổ chức y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 2.1. Các hoá chất dùng trong nghiên cứu 12 2 Bảng 2.2. Các máy móc dùng trong nghiên cứu 13 3 4 5 6 Bảng 3.1. So sánh 2 phƣơng pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm và Tyndall về một số chỉ tiêu Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của tinh bột và sữa gầy đến thể chất hạt vi nang tạo thành Bảng 3.3. Độ trƣơng nở của các loại hạt vi nang sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng Bảng 3.4. Thời gian rã của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch ruột mô phỏng 20 23 29 30 Bảng 3.5. Số lƣợng L. acidophilus sống sót trong các hạt vi nang 7 phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT 1 Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Trang 4 Hình 1.2. (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X và (b1-3) hình 2 ảnh kính hiển vi điện tử quét của hạt alginat đông khô ở các nồng 9 độ tá dƣợc độn khác nhau 3 4 5 Hình 3.1. Hình ảnh hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau đông khô Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện hàm ẩm và đƣờng kính của hạt vi nang phối hợp tinh bột và sữa gầy ngay sau đông khô Hình 3.3. Hình ảnh phân tử tinh bột và sữa gầy phân tán trong nƣớc dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần 24 25 25 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn số lƣợng L. acidophilus sống sót trong 6 các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng 33 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic là lợi khuẩn và là vấn đề đƣợc các nhà nghiên cứu quan tâm trong các thập kỉ gần đây.Ngày càng có thêm nhiều các bằng chứng khoa học về giá trị của probiotic trong việc hỗ trợ sức khỏe cho con ngƣời. Các tác dụng có lợi của chế phẩm probiotic đặc biệt liên quan đến sự kích thích hệ thống miễn dịch, chống vi khuẩn cũng nhƣ đặc tính chống đột biến và chống ung thƣ, cải thiện tiêu hóa lactose, chuyển hóa protein, cholesterol hoặc calci [36]. Tuy nhiên, trong quá trình đi vào đƣờng tiêu hóa, các lợi khuẩn phải chống chọi với các yếu tố bất lợi gặp phải trong dạ dày và đƣờng ruột, chẳng hạn, môi trƣờng acid của dịch vị, các enzym tiêu hóa và muối mật của ruột non làm suy giảm số lƣợng vi sinh vật. Để cải thiện khả năng sống sót của probiotic, nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng các dạng bào chế nhƣ bao pellet, cốm, nhũ tƣơng… và hoặc sử dụng các loại tá dƣợc bảo vệ. Một trong các hƣớng nghiên cứu đáng chú ý gần đây là sử dụng chất bảo vệ nhƣ sữa gầy, chitosan, tinh bột…để tạo vi nang. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài“Nghiên cứu sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus” với hai mục tiêu: 1.Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợptinh bột với alginat. 2. Khảo sát khả năng bảo vệ L. acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng. 2 Chƣơng 1.TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Khái niệm về probiotic Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, từ pro và biota, có nghĩa là “dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn sống có thể cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh và giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa [31]. Năm 2001 tổ chức y tế thế giới WHO định nghĩa: “Probiotic làvi sinh vật sống, khi đƣa vào cơ thể với một lƣợng đủ lớn, sẽ mang lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [40]. 1.1.2. Vai trò của probiotic Kể từ những năm 1990, các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng liệu pháp probiotic có thể giúp điều trị một số căn bệnh tiêu hóa, làm chậm sự phát triển của bệnh dị ứng ở trẻ em, điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng âm đạo và tiết niệu ở phụ nữ… Có thể kể ra một số tác dụng nhƣ sau:  Cải thiện chức năng miễn dịch:Probiotic là tác nhân quan trọng trong cải thiện chức năng miễn dịch của cơ thể. Probiotic có thể cải thiện chức năng miễn dịch bằng cách kích thích tăng số lƣợng tế bào sản xuất IgA, tăng tỷ lệ tế bào lympho T và tế bào Killer tự nhiên [34], [37].  Ngăn ngừa các vi khuẩn gây bệnh, lặp lại thế cân bằng vi khuẩn đƣờng ruột:Probiotic có thể bảo vệ cơ thể, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh chất dinh dƣỡng và năng lƣợng. Ngoài ra, trong quá trình trao đổi chất probiotic tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn nhƣ acid hữu cơ (acid lactic và acid acetic), hydroperoxid, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO2, reuterin, reutericyclin và bacteriocin…[34].  Cải thiện tình trạng không dung nạp lactose:Vi khuẩn lactic tích cực chuyển đổi lactose thành acid lactic. Vì vậy, khi sử dụng các chế phẩm probiotic sẽ cải thiện đƣợc tình trạng không dung nạp lactose [42].  Giảm cholesterol huyết thanh:Những nghiên cứu trên động vật đã chứng minh tính hiệu quả của một số probiotic trong việc giảm lƣợng cholesterol huyết thanh. 3 Một số thử nghiệm trên ngƣời cũng đã cho thấy sữa lên men với LAB làm giảm mức cholesterol [39].  Huyết áp: Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ sữa chua lên men với các chủng LAB khác nhau có thể dẫn đến giảm nhẹ huyết áp, điều này có thể giải thích do peptid tƣơng tự yếu tố ức chế ACE sinh ra trong quá trình lên men[39].  Tổng hợp vitamin nhóm B: Một số tác giả cho rằng thành phần vitamin B trong các chế phẩm sữa lên men đƣợc sinh ra bởi vi sinh vật sinh acid lactic. 1.1.3. Các chủng probiotic phổ biến Hiện nay, các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc chiLactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và Streptococcus cũng đƣợc sử dụng nhƣng ít hơn. Những vi khuẩn này thƣờng cƣ trú trong ruột. Một số chủng tiêu biểu bao gồm:L. acidophilus, L. gasseri, L. rhamnosus, B. longum, B. bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng đƣợc xem là probiotic. 1.1.4. Các thế hệ probiotic Sản phẩm lên men tự nhiên: sữa chua, dƣa chua, phô mai, kim chi… đƣợc dùng có lợi về mặt dinh dƣỡng, nhƣng chƣa có tính hỗ trợ trị liệu một cách rõ ràng. Thế hệ thứ 1, probiotic không bao (non-coated): vi khuẩn đƣợc phân lập và tăng số lƣợng để sử dụng, nhƣng vẫn là vi khuẩn không bao nên khả năng sống sót khi qua dạ dày thấp và hiệu quả không đƣợc nhƣ mong muốn. Các dòng sản phẩm nhƣ: Antibio, AbioGran, Biolac, Bio-Acimin, Bio-Baby…. Thế hệ thứ 2, dạng bao tan trong ruột (enteric – coated): vi khuẩn chứa trong nang có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột, hầu hết probiotic đƣợc xử lý với một polyme acrylic acid. Tác nhân bảo vệ này chỉ đƣợc cho phép sử dụng trong dƣợc phẩm, không thích hợp trong thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ [35]. Ví dụ: Primadophilus, Gr-8 Dophilus, … Thế hệ thứ 3, dạng bao vi nang (micro-encapsulated): giúp vi khuẩn ổn định trong quá trình bảo quản và chống chọi với môi trƣờng dạ dày tốt hơn, nhƣng lớp 4 bao không hòa tan hoàn toàn trong đƣờng ruột, đặc biệt với những ngƣời có hệ ruột ngắn (trẻ em) hoặc những ngƣời ăn nhiều chất béo dẫn đến vi nang có xu hƣớng đi qua ruột và thải ra ngoài theo phân mà không hoặc tạo ít tác dụng có lợi. Ví dụ: Lactomin. Thế hệ thứ 4, bao kép: probiotic đƣợc bao 2 lớp, hiệu quả cao và khắc phục đƣợc nhƣợc điểm phóng thích chậm ở ruột nhƣ cách bao của các thế hệ cũ. Lớp bao polysaccharid giúp bảo đảm cho vi sinh vật sống tốt trong quá trình sản xuất và bảo quản, lớp bao protein có đặc tính đông vón trong môi trƣờng acid giúp chống đƣợc tác động khi qua dịch dạ dày và muối mật để đến ruột. Tại ruột, nhờ lớp protein có khả năng phân tán tốt trong pH trung tính hoặc hơi kiềm ở ruột, probiotic sẽ phóng thích tốt nhờ đó sản sinh nhanh chóng để phát huy tối đa tác dụng [35]. Ví dụ: Kidlac, Lacclean Gold, Chewable 7.1, Yamyam. 1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus 1.2.1. Đặc điểm hình thái Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, thuộc nhóm vi khuẩn lactic. Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), kích thƣớc từ 0,6-0,9 × 1,5-6,0μm, đứng riêng rẽ hoặc bắt cặp tạo thành chuỗi ngắn không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính. Nhiệt độ phát triển tối ƣu37oC.Tên gọi của loài có nghĩa là “ƣa acid” cho thấy loài có thể phát triển trong môi trƣờng acid, pH khoảng 5-6, thời gian 24-36h [3]. Hình 1.1. Hình ảnhvi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2.2. Tác dụng  Có khả năng làm giảm số lƣợng các vi sinh vật có hại ở ruột non, có khả năng sinh lactase – một enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa sữa [21]. 5  Tổng hợp các vitamin, ngoài ra còn có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn nhƣ Lactocidin, Bacteriocin.  Tạo môi trƣờng acid là môi trƣờng thuận lợi cho hệ vi sinh vật lên men đƣờng ruột và đồng thời ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm [29].  Chủng L. acidophilus LA-5 có tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lƣợng cytokine tăng lên, tăng hoạt động thực bào và sản xuất kháng thể[26].  Giảm nguy cơ bị ung thƣ, khối u [4], [11]. 1.3. PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 1.3.1. Khái niệm đông khô Đông khô là quá trình làm khô vật liệu ở nhiệt độ thấp, dƣới các điều kiện cho phép, để loại trừ nƣớc bằng cách thăng hoa, thay đổi trạng thái nƣớc từ thể rắn sang thể hơi mà không qua thể lỏng [2], [23]. Quá trình đông khô thƣờng chia thành ba giai đoạn: giai đoạn lạnh đông, giai đoạn thăng hoa, giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại.  Giai đoạn lạnh đông: Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc đƣợc làm lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dƣới nhiệt độ điểm ba của ẩm.  Giai đoạn thăng hoa: Vật đã lạnh đông đƣợc đặt trong buồng sấy, đồng thời tiến hành hút chân không. Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa, áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng.  Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa. 1.3.2. Ưu điểm của đông khô Do quá trình đông khô đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp, nƣớc chuyển trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ƣu điểm so với các phƣơng pháp làm khô khác nhƣ: giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hƣơng vị; giữ đƣợc hoạt tính 6 sinh học; bảo vệ nguyên vẹn các vitamin nhƣ lúc còn tƣơi; không làm biến chất albumin…; giữ nguyên đƣợc thể tích ban đầu của vật [2], [23]. 1.3.3. Một số tá dược dùng bảo vệ trong đông khô Do quá trình đông khô có ảnh hƣởng đến khả năng sống sót của vi sinh vật nên ngƣời ta thƣờng thêm chất bảo vệ vào sinh khối vi sinh vật trƣớc khi đông khô. Tá dƣợc là yếu tố quan trọng nhất trong việc làm tăng khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình đông khô và làm giảm sự chết của vi sinh vật trong quá trình bảo quản. Tá dƣợc thƣờng đƣợc sử dụng là sữa gầy, trehalose, glycerol, betain, adonitol, sucrose, glucose, lactose, acid amin (arginine, acid glutamic), peptid, protein, dịch chiết sinh học tự nhiên và polymer nhƣ dextran, polyethylene glycol [12], [27], [32]. 1.4. VI NANG HOÁ Hiện nay, phần lớn các nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm probiotic trên thị trƣờng là dạng bột đông khô do khả năng duy trì số lƣợng VSV sống trong quá trình bảo quản dài. Tuy nhiên, việc duy trì khả năng sống sót của VSV trong hệ thống tiêu hoá lại là một vấn đề lớn. Một trong những hƣớng giải quyết đƣợc quan tâm hiện nay là cung cấp cho các VSV một hàng rào bảo vệ vật lý để chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng, trong đó phải kể đến kỹ thuậtvi nang hoá [41]. 1.4.1. Khái niệm Vi nang hoá là một trong những phƣơng pháp cố định tế bào đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay. Phƣơng pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polymer có nguồn gốc tự nhiên nhƣ gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo nhƣ polyamide, polystyrene, polyacrylat, polyacrylamide, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylene glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật trong các nang nhỏ[8], [10]. 1.4.2. Đặc điểm Vi nang hóa giúp ngăn cách nguyên liệu trong lõi với môi trƣờng cho tới khi chúng đƣợc giải phóng, vì thế cải thiện khả năng ổn định, kéo dài tuổi thọ của nguyên liệu trong lõi và giải phóng ổn định, có kiểm soát. Vi nang có thể có kích 7 thƣớc từ dƣới μm đến vài mm và có thể có các hình dạng khác nhau. Vi nang là màng chắn bán thấm, hình cầu và mỏng, giúp tế bào vi khuẩn đƣợc giữ lại trong vi nang, chất dinh dƣỡng và chất chuyển hóa có thể phân tán qua màng bán thấm dễ dàng. Màng vi nang cung cấp một rào chắn để bảo vệ tế bào và làm giảm thiểu sự nhiễm khuẩn. Lõi nguyên liệu bao gói đƣợc giải phóng theo nhiều cơ chế nhƣ: đứt gãy màng chắn, hòa tan màng chắn, tan chảy màng chắn và khuếch tán qua màng [41]. 1.4.3. Phương pháp vi nang hoá bằng tách pha đông tụ 1.4.3.1. Nguyên tắc Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang. Tác động vào dung dịch keo trong một dung môi thích hợpnhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lƣợng đáng kể keo đƣợc tách ra thành pha mới. Nhƣ vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo đƣợc tách ra dƣới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ. Sau đó, các giọt đông tụ dần kết dính lại với nhau hoặc hấp phụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao. 1.4.3.2. Nguyên liệu Alginat Cấu tạo, nguồn gốc: Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết 1-4glucosid. Alginat đƣợc sản xuất từ tảo nâu Phacophyta, trong tảo các acid chủ yếu ở dạng muối hỗn hợp (Na, K, Mg, Ca)[33]. Tính chất: Hai tính chất quan trọng của alginat là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel [33]. Độ nhớt: Natri alginat tan trong nƣớc tạo dung dịch có độ nhớt dao động trong khoảng từ 10 – 3500 cps. Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lƣợng nhánh của phân tử alginat. Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại[24]. 8 Khả năng tạo gel: Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II, III, sự tạo gel đƣợc giải thích theo mô hình vỉ trứng. Bình thƣờng trong dung dịch alginat tồn tại block M và block G tƣơng ứng là các dải hẹp và các dải gấp khúc. Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống nhƣ chỗ đặt trứng.Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lƣới không gian ba chiều. Với cấu trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò nhƣ một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trƣờng và cho phép giải phóng vi sinh vật đƣợc bao theo hƣớng có kiểm soát [33]. Ƣu điểm: Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn định cao. Vi khuẩn sống không bị ảnh hƣởng trong suốt quá trình vi nang hoá. Alginat có độ ổn định cao, độ xốp cao và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức. Nghiên cứu về hạt vi nang tạo bởi alginat: Vi nang alginat đã đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu để bảo vệ tế bào, protein, vi khuẩn, các loại thuốc kém bền với dịch vị [33]…Trong đó, nghiên cứu của Eng-Shen Chang và cộng sự (2011) cho thấy vi nang tạo bởi alginat đơn thuần có cấu trúc là các lớp đồng tâm, khi thêm tá dƣợc độn thì chúng lấp vào các khoảng trống, hỗ trợ cấu trúc mạng gel và ngăn cấu trúc bị co ngót khi đông khô. Ngoài ra, hình ảnh nhiễu xạ tia X còn cho thấy khi tá dƣợc thêm vào ở nồng độ thấp thì chúng phân bố không đồng đều. Tại nồng độ 200g/l, tá dƣợc độn chủ yếu tập trung trong lõi hơn là bề mặt vi nang, do sự hình thành gel diễn ra từ bề mặt vào trong nên không gian trống ở bề mặt ít hơn bên trong lõi vi nang. Khi nồng độ tá dƣợc độn lên đến 600g/l, chúng phân bố đồng đều khắp vi nang [22]. 9 Hình 1.2. (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X và (b1-3) hình ảnh kính hiển vi điện tử quét của hạt alginat đông khô ở các nồng độ tá dƣợc độn khác nhau 1.4.3.3. Một số tá dược  Tinh bột Trong tự nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào, chỉ đứng sau cellulose.Tinh bột có trong cây xanh, rễ, cành, hạt, củ và quả. Tinh bột cấu tạo từ Amylose (Am) và Amylopectin (Ap). Cả hai cấu tử này đều đƣợc cấu tạo từ α-D glucose. Các gốc glucose trong Am kết hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid tạo nên chuỗi dài khoảng 500-2000 đơn vị glucose. Ap có cấu trúc phân nhánh, ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6glucosid ở điểm phân nhánh [9]. Cấu trúc phân tử gồm một nhánh trung tâm, từ các nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose. Trong những loại tinh bột khác nhau thì hàm lƣợng Am và Ap cũng không giống nhau, nhƣng thƣờng tỉ lệ Am và Ap của các tinh bột bằng 1/4. Tính chất: Trong môi trƣờng acid, tinh bột bị thuỷ phân thành sản phẩm hoà tan. Ở môi trƣờng acid mạnh, sản phẩm thuỷ phân cuối cùng là glucose. Trong môi trƣờng kiềm, tinh bột bị ion hoá từng phần do sự hydrat hoá tốt hơn. Tinh bột ở dạng hạt hoặc tinh bột chƣa xử lý thì khó bị tấn công bởi những enzym thuỷ phân. 10 Khi hoà tan tinh bột vào nƣớc, do sự hấp thụ nƣớc làm hạt tinh bột trƣơng phồng lên, tăng thể tích. Hiện tƣợng này gọi là hiện tƣợng trƣơng nở của tinh bột. Trên 55-70oC, các loại tinh bột trƣơng lên do hấp thụ nƣớc vào các nhóm hydroxyl phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh. Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể gây nổ vỡ hạt tinh bột, thuỷ phân từng phần và hoà tan phần nào các phần tử cấu thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch [9]. Ƣu điểm: Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tƣơng thích sinh học, phân huỷ sinh học. Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [15]. Tinh bột là tá dƣợc độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hoá đƣợc [22]. Tinh bột thƣờng đƣợc sử dụng để ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tƣơng hợp sinh học và độc tính của nó với vi khuẩn đã đƣợc thử nghiệm rộng rãi [30]. Tình hình nghiên cứu: Năm 2000, nghiên cứu của Khalida Sultanavà cộng sự đã chỉ ra vi nang hoá Lactobacillus acidophilus và Bifidobacteriumspp. trong Ca-alginat-tinh bột giúp tăng gấp đôi số lƣợng tế bào sống sót so với dạng tế bào tự do khi bảo quản trong sữa chua sau 8 tuần, nhƣng không cải thiện khả năng sống sót trong dịch dạ dày mô phỏng [28]. Năm 2013, Martin và cộng sự báo cáo tinh bột giúp nâng cao khả năng sống sót củaLactobacillus fermentumtrong quá trình đông khô và bảo quản ở 4oC [30]. Năm 2014, Kabravi cùng cộng sự đã tiến hành so sánh khả năng sống sót của Lactobacillus casei ở dạng tế bào tự do, dạng vi nang hoá trong alginat-tinh bột không bao và có bao chitosan trong dịch dạ dày mô phỏng, kết quả cho thấy dạng vi nang hoá có tác dụng bảo vệ VSV rõ rệt (3,3 – 4,2 log), trong đó dạng bao chitosan cho tỉ lệ VSV sống sót cao gấp 10 lần dạng không bao [25]. Ở Việt Nam, tác giả Mai Hƣơng (2014) đã báo cáo tinh bột có hiệu quả bảo vệ L. acidophilus trong quá trình vi nang hoá, đông khô và bảo quản [6].  Sữa gầy Sữa gầy là các sản phẩm sữa mà trong thành phần có chứa không quá 0,5% chất béo. Thành phần dinh dƣỡng chính trong sữa gầy: 32% - 35,7% protein; 11 48,4%- 54,1% lactose. Tình hình nghiên cứu: Năm 2000, Charteris và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của sữa gầy lên khả năng chống chọi của Lactobacillus casei và Bifidobacterium infantis với điều kiện khắc nghiệt của dịch dạ dày và dịch muối mật, và báo cáo rằng sữa gầy có khả năng nâng cao sức chống chọi của VSV với dịch dạ dày nhƣng không có hiệu quả với dịch muối mật [17]. Arnaud Picot và cộng sự (2004) đã nghiên cứu vi nang hoá Bifidobaterium breve trong Ca-alginat phối hợp với sữa gầy, kết quả cho thấy, vi nang Ca-alginatsữa gầy đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của VSV trong dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng (+ 2,7 log) so với khi tế bào ở dạng tự do, nhƣng với chủng Bifidobacterium longum không thấy có hiệu quả bảo vệ [16]. Năm 2005, Ainsley Reid và cộng sự báo cáo rằng vi nang hoá Lactobacillus rhamnosustrong nang Ca-alginat-sữa gầy cải thiện khả năng sống sót của VSV trong dịch dạ dày sau 90 phút và trong muối mật sau 30, 60, 90 phút. Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy, trong muối mật, dịch sữa gầy có tác dụng bảo vệ VSV tốt tƣơng đƣơng với vi nang Ca-alginat-sữa gầy [13]. 12 Chƣơng 2.NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Chủng vi sinh vật Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ƣơng). 2.1.2. Hóa chất Bảng 2.1.Các hóa chất dùng trong nghiên cứu Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc Glucose Trung Quốc Triamoni citrat Trung Quốc Pepton Ấn Độ Natri acetat Trung Quốc Cao thịt Merck-Đức Natri citrat Trung Quốc Cao nấm men Merck-Đức Alginat Ấn Độ K2HPO4 Trung Quốc Calci clorid Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam MnSO4.4H2O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam Natri clorid Trung Quốc Sữa gầy Trung Quốc 2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu  MRS lỏng (MT1) Glucose 20,0g Natri acetat 5,0 g Pepton 10,0g K2HPO4 2,0g Cao thịt 10,0g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5,0g MnSO4.4H2O 0,05g Triamoni citrat 2,0g Nƣớc máy vừa đủ 1.000ml pH 6,8-7,0 Tween 0,1 g  Môi trƣờng MRS thạch (MT2) MT2=MT1 + thạch (25g thạch/1.000ml môi trƣờng) 2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu - Dung dịch sữa gầy 20%: cân chính xác 20,00g sữa gầy, phân tán đều trong