Tài liệu Nghiên cứu sinh trưởng, năng suất và chất lượng dược liệu của một số chủng đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris) nhập nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LUYỆN NGHIÊN CỨU SINH TRƯỞNG, NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU CỦA MỘT SỐ CHỦNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) NHẬP NỘI Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 60 62 01 10 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Ninh Thị Phíp 2. TS. Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 29 tháng 09 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Luyện i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Ninh Thị Phíp và TS. Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Cây Công nghiệp và Cây thuốc, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập Ban chủ Nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, qúy thầy cô Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tới qúy thầy cô trung tâm Đào Tạo, Nghiên cứu và Phát triển Nấm ăn, Nấm dược liệu, Khoa Công nghệ Sinh Học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./. Hà Nội, ngày 29 tháng 09 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Luyện ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ................................................................................................................. ix Trích yếu luận văn ............................................................................................................ x Thesis abstract.................................................................................................................. xi Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 3 1.5. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Nguồn gốc, phân loại nấm Cordyceps militari. .................................................. 4 2.2. Đặc điểm sinh học của nấm Cordyceps militaris ............................................... 4 2.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm đông trùng hạ thảo ................................................ 4 2.2.2. Chu trình sống của nấm Cordyceps militaris trong tự nhiên .............................. 6 2.2.3. Ký chủ của Cordyceps militaris ......................................................................... 6 2.3. Giá trị dược liệu và thành phần dinh dưỡng của nấm Cordyceps militaris ........ 6 2.3.1. Gía trị dược liệu .................................................................................................. 6 2.3.2. Các thành phần dinh dưỡng của nấm Cordyceps militaris ................................. 9 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ................................................................................... 10 2.4.1. Giống ................................................................................................................ 10 2.4.2. Dinh dưỡng ....................................................................................................... 11 2.4.3. pH môi trường .................................................................................................. 12 2.4.4. Nhiệt độ ............................................................................................................ 12 2.4.5. Độ ẩm và sự trao đổi không khí........................................................................ 12 2.4.6. Ánh sáng ........................................................................................................... 13 iii 2.5. Tình hình nghiên cứu nấm Cordyceps militaris trên thế giới và Việt Nam ..... 13 2.5.1. Nghiên cứu về nấm Cordyceps militaris trên thế giới ...................................... 13 2.5.2. Nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống và quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Cordyceps militaris tại Việt Nam ............................................................. 21 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ........................................................... 25 3.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 25 3.2. Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 25 3.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 25 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 25 3.3.2. Vật tư tiêu hao, hóa chất, nguyên liệu dùng trong thí nghiệm.......................... 25 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 26 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 26 3.5.1. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... 26 3.5.2. Quy trình kỹ thuật ............................................................................................. 28 3.5.3. Chỉ tiêu theo dõi................................................................................................ 30 3.6. Phương phát xử lý số liệu ................................................................................. 33 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 34 4.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên môi trường nhân giống cấp 1 ..................................................... 34 4.1.1. Sinh trưởng, phát triển hệ sợi của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trên môi trường nhân giống cấp 1 trong giai đoạn ươm tối ..................................... 34 4.1.2. Giai đoạn chiếu sáng hệ sợi của 5 chủng nấm C. minitaris trên môi trường nhân cấy giống cấp 1............................................................................. 36 4.1.3. Đặc điểm hình thái hệ sợi của 5 chủng nấm C.militaris trong môi trường nhân giống cấp 1 ............................................................................................... 38 4.2. Nghiên cứu sinh trưởng phát triển của 5 chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militasris trong môi trường nhân giống dạng dịch thể ................... 42 4.2.1. Đặc điểm phát triển hệ sợi của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nhân giống dạng dịch thể .................................................................................. 43 4.2.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh .............................................................................................. 48 4.2.3. Đặc điểm hình thái dung dịch giống của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nhân giống dạng dịch thể ............................................................... 49 iv 4.3. Sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu của 5 chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong nuôi trồng nhân tạo .......... 50 4.3.1. Đặc điểm hệ sợi của 5 chủng nấm C. militaris trong giai đoạn tạo hệ sợi ...... 51 4.3.2. Đặc điểm hệ sợi 5 chủng nấm C. militaris trong giai đoạn tạo sắc tố. ............. 54 4.3.3. Đặc điểm hình thành, phát triển mầm quả thể của 5 chủng nấm C. militaris trong giai tạo mầm quả thể ............................................................ 54 4.3.4. Sinh trưởng, phát triển quả thể của 5 chủng nấm C. militaris trong giai đoạn phát triển quả thể...................................................................................... 59 4.3.5. Hiệu suất sinh học và hàm lượng hoạt chất dược liệu của 5 chủng nấm C. militaris ........................................................................................................ 66 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 69 5.1. Kết luận............................................................................................................. 69 5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 69 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 70 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CRD Completely randommized design CV Coeffcient of variation ĐK Đường kính HS Hệ sợi HPLC High performance liquid chromatography KLC Khuẩn lạc cầu KL Khối lượng KLTB Khối lượng trung bình LED Light Emitting Diode LSD Least significant difference SDAY Sabouraud dextrose agar plus yeast extract TGST Thời gian sinh trưởng UV Ultra violet vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần axit béo của Cordyceps militaris ............................................. 10 Bảng 4.1. Thời gian sinh trưởng, phát triển hệ sợi của 5 chủng C.militaris trên môi trường nuôi cấy giống cấp 1 ................................................................. 34 Bảng 4.2. Động thái tăng đường kính hệ sợi của 5 chủng C.militaris qua các giai đoạn ...... 38 Bảng 4.3. Mật độ sợi của 5 chủng nấm C.militaris trên môi trường nhân giống cấp 1 qua các giai đoạn ................................................................................ 39 Bảng 4.4. Mầu sắc hệ sợi của 5 chủng nấm C.militaris trên môi trường nhân giống cấp 1 qua các giai đoạn ...................................................................... 40 Bảng 4.5. Tỷ lệ nhiễm bệnh của 5 chủng C. militaris trong môi trường nhân giống cấp 1 ................................................................................................... 41 Bảng 4.6. Sinh khối sợi của 5 chủng C. militaris trong môi trường dịch thể qua các giai đoạn ................................................................................................ 44 Bảng 4.7. Kích thước khuẩn lạc cầu của 5 chủng C. militaris trong môi trường dịch thể qua các giai đoạn. ........................................................................... 46 Bảng 4.8. Mật độ khuẩn lạc cầu của 5 chủng C. militaris trong môi trường dịch thể qua các giai đoạn .................................................................................... 47 Bảng 4.9. Tỷ lệ nhiễm bệnh của 5 chủng C. militaris trong môi trường nhân giống dạnh dịch thể ...................................................................................... 48 Bảng 4.10. Màu sắc và độ đặc dung dịch giống của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nhân giống dịch thể qua các giai đoạn............................. 49 Bảng 4.11. Thời gian phát triển hệ sợi nấm của 5 chủng C. militaris trên môi trường nuôi trồng qua các giai đoạn ............................................................ 51 Bảng 4.12. Mật độ hệ sợi 5 chủng nấm C. militaris trên môi trường nuôi trồng qua các giai đoạn.......................................................................................... 52 Bảng 4.13. Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng hệ sợi của 5 chủng C. militaris trong thời kỳ ươm sợi ................................................................................... 54 Bảng 4.14. Thời gian sinh trưởng của 5 chủng C. militaris trong nghiên cứu. .............. 57 Bảng 4.15. Đặc điểm hình thái mầm quả thể của 5 chủng C. militaris khi mới hình thành .................................................................................................... 58 Bảng 4.16. Chiều dài quả thể 5 chủng nấm C. militaris qua các giai đoạn. ................... 59 Bảng 4.17. Đường kính quả thể của 5 chủng nấm C. militaris qua các giai đoạn. ....... 60 vii Bảng 4.18. Đường kính đỉnh quả thể của 5 chủng nấm C. militaris qua các giai đoạn ...... 62 Bảng 4.19. Màu sắc quả thể của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nuôi trồng qua các giai đoạn ................................................................................ 64 Bảng 4.20. Một số chỉ tiêu ảnh hưởng đến hiệu suất sinh học của 5 chủng nấm C. militaris ................................................................................................... 64 Bảng 4.21. Hiệu suất sinh học và hàm lượng hoạt chất cordycepin và adenosin của 5 chủng nấm C. militaris ....................................................................... 67 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Thể quả và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử nấm Cordyceps militaris .......................................................................................................... 5 Hình 2.2. Các dạng bào tử của nấm Cordyceps militaris .............................................. 5 Hình 2.3. Cấu trúc của các hợp chất chính trong Cordyceps militaris .......................... 7 Hình 4.1. Thời gian sinh trưởng hệ sợi của 5 chủng C. militaris trên môi trường nhân giống cấp 1 .......................................................................................... 36 Hình 4.2. Thời gian chuyển màu hệ sợi của 5 chủng C. militaris trên môi trường nhân giống cấp 1 trong giai đoạn chiếu sáng ............................................... 37 Hình 4.3. Tốc độ tăng trưởng đường kính hệ sợi của 5 chủng nấm C. militaris qua các giai đoạn. ......................................................................................... 39 Hình 4.4. Động thái tăng sinh khối sợi của 5 chủng C. militaris trong nhân giống dạng dịch thể ...................................................................................... 44 Hình 4.5. Kích thước KLC của 5 chủng C. militaris qua các giai đoạn. ..................... 46 Hình 4.6. Tỷ lệ nhiễm bệnh của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nhân giống cấp trung gian dạng dịch thể .............................................................. 48 Hình 4.7. Thời gian xuất hiện mầm quả thể và thời gian sinh trưởng của 5 chủng C. militaris ................................................................................................... 57 Hình 4.8. Động thái tăng chiều dài quả thể C. militaris qua các giai đoạn. ................ 59 Hình 4.9. Động thái tăng đường kính quả thể C. militaris qua các giai đoạn .............. 61 Hình 4.10. Động thái tăng trưởng đường kính đỉnh quả thể nấm C. militaris ............... 62 Hình 4.11. Khối lượng quả thể tươi của 5 chủng nấm C. militaris trong 1 hộp nuôi trồng ..................................................................................................... 65 Hình 4.12. Hiệu suất sinh học của 5 chủng nấm C. militaris ........................................ 67 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Luyện Tên luận văn: “Nghiên cứu sinh trưởng, năng suất và chất lượng dược liệu của một số chủng đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) nhập nội”. Ngành: Khoa học Cây trồng Mã số: 60 62 01 10 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn ra được một số chủng Cordyceps militaris sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường nhân giống và môi trường nuôi trồng nhân tạo. Năng suất và chất lượng dược liệu của các chủng đó phù hợp với điều kiện sản xuất và thị trường Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu Vật liệu dùng nghiên cứu là 5 chủng nấm C. militaris có nguồn gốc từ trung tâm Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn, nấm dược liệu Châu Á Thái Bình Dương, Phúc Kiến, Trung Quốc. Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển hệ sợi 5 chủng nấm C. militaris trên môi trường nhân giống cấp 1 SDAY theo phương pháp của Sung et al. (2010). Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển hệ sợi 5 chủng nấm C. militaris trên môi trường nhân giống dạng dịch thể theo phương pháp của Zhang et al. (2016). Nghiên cứu sự hình thành quả thể, năng suất và chất lượng dược liệu của 5 chủng nấm C. militaris trên môi trường nuôi trồng nhân tạo theo phương pháp của Shrestha et al. (2012). Kết quả chính và kết luận Cả 5 chủng C. militaris đều sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường nhân giống cấp 1 SDAY. Trong đó 2 chủng có thời gian sinh trưởng ngắn nhất là ĐT3 hệ sợi phát triển kín cơ chất sau 25 ngày cấy giống và chủng ĐT4 có hệ sợi phát triển kín cơ chất sau 26 ngày cấy giống. Hệ sợi của 5 chủng C. militaris sinh trưởng, phát triển tốt trong môi trường nhân giống cấp 1. Kích thước khuẩn lạc cầu phù hợp cho việc cấy giống vào môi trường nuôi trồng nhân tạo. Cả 5 chủng nấm C. militaris đều hình thành quả thể trong môi trường nuôi trồng nhân tạo. Trong đó hai chủng có hiệu suất sinh học và hàm lượng các hoạt chất dược liệu cao để phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất đó là: Chủng ĐT3 cho hiệu suất sinh học cao nhất 8,9% hàm lượng cordycepin 800 mg/100g, chủng ĐT5 có hiệu suất sinh học đạt 6,1% hàm lượng cordycepin 510 mg/100g. x THESIS ABSTRACT Master candidate: Luyen Thi Nguyen Thesis title: Research on growth, yield and quality of medicinal of some Winter insect summer grass (Cordyceps militaris) imported. Major: Crop Science Code: 60 62 01 10 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Selection of some strains of Cordyceps militaris has been growth and developed in the breeding media. The productivity and quality of medicinal of these strains are suitable for condition cultivation and market of Vietnam. Materials and Methods The study materials were five strains of C. militaris from the Center for Research and development, Asia Pacific Mushroom, Fujian, China. Study on growth and development of five strains of C. militaris on the first media SDAY following the method of Sung et al. (2010). Sudy on growth and development of the five strains of C. militaris on the liquid medium following the method of Zhang et al. (2016). Study on fruit formation, yield and quality of five strains of C. militaris on condition cultivation following the method of Shrestha et al. (2012). Main findings and conclusions All five strains of C. militaris all grow well on SDAY media. Of which, the two strains have the shortest growth period, the mycelium strain ĐT3 after 25 days inoculation and the mycelium of strain ĐT4 growth after 26 days of inoculation. The mycelium of the five strains of C. militaris grow well in the fermentation. The size of bellets is suitable for condition cultivation in the culture medium. All five strains of C. militaris are fruiting body formation in the condition cultivation. Two strains with high biological efficiency and high of active pharmacal ingredients for research and production are: The ĐT3 strain, the highest biological efficiency of 8.9% and cordycepin 800 mg / 100g. The ĐT5 strain has biological efficiency 6.1% and cordycepin 510 mg / 100g. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis (còn có tên gọi khác Ophiocordyceps sinensis) là một loại nấm dược liệu tự nhiên phân bố trên độ cao từ 3000 – 5000 m so với mực nước biển có tác dụng phòng chống và hỗ trợ điều trị ung thư, các bệnh về tim mạch, tăng cường hệ thống miễn dịch, duy trì chức năng thận, phổi, điều hòa giấc ngủ, viêm phế quản mãn tính, làm chậm quá trình lão hóa…. (Das et al., 2010). Tuy nhiên, loại nấm này có sự phân bố rất hạn chế và chỉ được khai thác trong tự nhiên vẫn chưa thể nuôi trồng nhân tạo được. Một loại nấm ký sinh gây bệnh khác cùng chi khác loài đó chính là Cordyceps militaris (thường được gọi là nấm cam sâu bướm), có tính chất hóa học và tính dược liệu tương tự như của C. sinensis. Nhưng khác với C. sinensis, C. militaris có thể nuôi trồng để thu quả thể (stroma) trong điều kiện nhân tạo (Shrestha et al., 2012). Do đó, C. militaris đang được nghiên cứu và sử dụng như là một sự thay thế cho C. sinensis, sản xuất quả thể nấm quy mô lớn đang nhận được sự quan tâm đáng kể trong nghành sản xuất nấm dược liệu. Hiện nay, có nhiều nghiên cứu quan trọng về gen, nhu cầu dinh dưỡng, môi trường nuôi cấy, đặc điểm sinh hóa và dược lý của C. militaris. Gần đây, bộ gen hoàn chỉnh của C. militaris cũng đã được giải trình tự làm cơ sở cho nhiều nghiên cứu chuyên sâu hơn về loài nấm này (Zheng et al., 2011). Sau gần 30 năm nghiên cứu và phát triển Trung Quốc trở thành nước đầu tiên xây dựng thành công kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng nhân tạo thành công các chủng nấm của loài Cordyceps militaris. Cho đến nay quy mô nuôi trồng đông trùng hạ thảo ở Trung Quốc luôn không ngừng được mở rộng, sản xuất theo hướng công nghiệp hóa, nâng cao sản lượng và đa dạng hóa các loại sản phẩm (Trần Thu Hà, 2014). Hiện nay, thoái hóa giống là vấn đề quan trọng trong quá trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris ở điều kiện nhân tạo. Sự thoái hóa giống thể hiện ở việc giảm tốc độ sinh trưởng hệ sợi, thay đổi hình dạng và kích thước của quả thể (Nguyễn Thị Liên Thương và cs., 2016). Việc giảm sắc tố cũng được ghi nhận khi nuôi trồng nấm sau vài lần nhân giống (Sung et al., 2006). Hoạt tính của 1 enzyme dehydrogenase và giảm các hàm lượng các hợp chất mang tính dược liệu cũng thay đổi (Li et al.,2010). Các nghiên cứu trên gen cũng chỉ ra rằng có sự liên hệ giữa các biến đổi ở mức độ gen và sự thoái hóa giống của nấm C. militaris (Li et al., 2003), tuy nhiên thì các gen chính xác liên quan đến quá trình này vẫn chưa được xác định. Ở Việt Nam hiện nay, nghiên cứu về nấm đông trùng thảo cũng nhận được nhiều sự quan tâm của nhiều nhà khoa học thuộc các cơ quan, Viện nghiên cứu lớn, các doanh nghiệp sản xuất cũng đã tạo ra nhiều sản phẩm đông trùng hạ thảo mang thương hiệu Việt Nam: Nấm khô, tươi, trà, viên nang, rượu... được thị trường tiêu thụ với số lượng lớn. Để nuôi trồng nấm Cordyceps militaris đạt hiệu quả, đòi hỏi phải đáp ứng được yêu cầu về giống nấm phải đảm bảo chất lượng, có khả năng duy trì năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin và adenosin trong quả thể cao. (Trịnh Thị Lan và Lê Tuấn Anh, 2016). Mặc dù, đã có nhiều mẫu nấm đông trùng hạ thảo được thu thập tại Việt Nam được xác định là Cordyceps militaris nhưng các chủng nấm đông trùng hạ thảo đang nuôi trồng nhân tạo tại Việt Nam hiện nay vẫn chủ yếu phải nhập nội từ các nước như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản,...(Lê Văn Vẻ và cs., 2014). Tuy nhiên các chủng nhập nội khi mới đưa về cần được đánh giá về khả năng sinh trưởng, phát triển, thích nghi, tạo năng suất và chất lượng dược liệu trong điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam trước khi đưa vào xây dựng quy trình sản xuất. Với mục tiêu cung cấp các dẫn liệu khoa học cho các nghiên cứu chuyên sâu, cũng như mong muốn có được nguồn giống nấm dược liệu tốt đáp ứng cho nhu cầu sản xuất nấm đông trùng hạ thảo trong nước tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sinh trưởng, năng suất và chất lượng dược liệu của một số chủng đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) nhập nội”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tuyển chọn ra được một số chủng Cordyceps militaris sinh trưởng, phát triển tốt trong điều kiện nuôi trồng nhân tạo. Năng suất và chất lượng dược liệu của các chủng đó phù hợp với sản xuất và thị trường tiêu dùng để đưa vào nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nghiên cứu đánh giá sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược 2 liệu của 5 chủng nấm C. militaris nhập nội trong điều kiện nuôi trồng nhân tạo tại Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu và Phát triển Nấm ăn, nấm dược liệu. Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học dùng làm cơ sở để nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống và hoàn thiện quy trình công nghệ nuôi trồng, chăm sóc, xác định điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm đông trùng hạ thảo. 1.5. Ý NGHĨA THỰC TIỄN Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp cho ngành nấm dược liệu thêm một số chủng nấm Cordyceps militaris có năng suất và chất lượng dược liệu tốt thích hợp với điều kiện sản xuất nấm ở nước ta hiện nay. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI NẤM CORDYCEPS MILITARI. Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae. Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi là Clavaria militaris (Kobayasi, 1982). Chi Cordyceps Fr là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lượng loài và phổ ký chủ. Ước tính có trên 450 loài khác nhau phân bố trên toàn thế giới, đặc biệt ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như: Đông Nam Á và Đông Á, ngoại trừ Nam cực. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được về hai loài Cordyceps Sinesis và Cordycep militaris. Cả hai loài này đều chứa các hoạt chất có giá trị dược liệu như Codycepin, adenosine, ergosterol....(Tsai et al., 2010). Trong hệ thống phân loại: Nấm Cordyceps militaris thuộc Giới Nấm Fungi, ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps, loài Cordyceps militaris. Tên khoa học Cordyceps militaris(L.) Fr. (1818); (Kobayasi, 1982). Không giống như C. sinensis, C. militaris có sự phấn bố trên toàn thế giới từ 0 đến > 2000 m so với mặt nước biển. 2.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM CORDYCEPS MILITARIS 2.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm đông trùng hạ thảo Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C. militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng. Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ. Vào mùa đông, bào tử nấm theo gió dính vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử hình thành các ống nảy mầm có các thể bám. Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể. Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng, phát triển xấm chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ. Đến mùa hè hoặc sang mùa thu quả thể nấm nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí (Kobayasi, 1982; Kamble et al., 2012). Các quả thể nấm C. militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam, chiều dài 5-10 cm. Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng, hoăc tơ bông trắng đó chính là thời điểm nấm phát tán bào tử. Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa (Hình 2.1). Các nang bào tử dài từ 300 - 510 micro mét, bề 4 rộng 4 micro mét. Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thước 3,5 - 6 × 1 – 1,5 micro mét. Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp (Zheng et al., 2011). Hình 2.1. Thể quả và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử nấm Cordyceps militaris Nguồn: Christian et al. (1837) Nấm Cordyceps militaris có các dạng bào tử khác nhau trong chu trình sống của nấm (Hình 2.2). Ở các điều kiện môi trường khác nhau, sự hình thành các dạng bào tử cũng cho thấy sự khác biệt, như việc tạo bào tử tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn hoặc các chồi bào tử tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng. Hình 2.2. Các dạng bào tử của nấm Cordyceps militaris Nguồn: Zheng et a. (2011) Ghi chú: Conidia: bào tử tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn. Blastospores: chồi bào tử tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng. Fruiting-body: quả thể. Perithecia: thể quả hình chai. Asci: nang. Fragmented ascospores: các mảnh nang bào tử. Microcycle conidiation: vi chu kỳ tạo bào tử. 5 2.2.2. Chu trình sống của nấm Cordyceps militaris trong tự nhiên Nấm ký sinh côn trùng nói chung và nấm C. militaris nói riêng có nhiều đặc tính sinh học riêng do khả năng ký sinh, gây bệnh cho côn trùng và hình thành quả thể. Chu trình sống của chúng vô cùng phức tạp, có sự đan xen giữa thể vô tính và hữu tính. Trong tự nhiên vào mùa đông loài nấm này bắt đầu ký sinh vào vật chủ, hệ sợi (mycelia) của chúng phát triển mạnh, xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng hết các chất dinh dưỡng và làm chết vật chủ. Đến giai đoạn nhất định, thường là vào mùa hè, quả thể (stroma) mọc ra khỏi vật chủ, phát triển có hình dạng giống thực vật. Sau đó quả thể sẽ hình thành thể chén (petrithecia) chứa những tế bào đặc biệt gọi thể túi (asci) và sinh các bào tử túi (ascospores) phát tán, lây nhiễm lên ấu trùng của loài Hepialus armoricanus Oberthur (Zheng et al., 2011). Nấm Cordyceps militarisis là loài được nghiên cứu kỹ nhất trong tất cả các loài của giống Cordyceps (Kobayasi, 1941). Sự đa dạng về hình thái và khả năng thích nghi của loài này ở nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là nguyên do khiến chúng có mặt ở nhiều vùng địa lý và sinh thái trên trái đất (Kobayasi, 1941; Sung and Spatafora, 2004). Ký chủ phổ biến của loài C. militaris trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của các loài bướm. Ngoài ra còn có các ký chủ khác như các loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng (Hymenoptera), và bộ hai cánh (Diptera). 2.2.3. Ký chủ của Cordyceps militaris Nấm Cordyceps militaris là loài được biết đến nhiều nhất của chi Cordyceps s.l. (Kobsyasi, 1941). Tính đa dạng về hình thái và sự thích nghi với một loạt các loài côn trùng ký chủ có thể góp phần vào sự xuất hiện đa dạng của chúng ở các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. trong tụ nhiên các ký chủ phổ biến nhất bao gồm ấu trùng và nhộng của loài Lepidopteteran (loài bướm); một số ký chủ khác như: Coleopteran (cánh cứng), hymenopteran (cánh màng), và ấu trùng của dipteran (hai cánh). Các loài ký chủ Lepidopteran của C. militaris thuộc 12 họ khác nhau. 2.3. GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU VÀ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CỦA NẤM CORDYCEPS MILITARIS 2.3.1. Gía trị dược liệu Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong 6 điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá trị kinh tế cao. Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Do đó, việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề cần thiết. Các hợp chất chính có giá trị dược liệu cao là: Cordycepin (3’deoxyadenosin, C10H13N5O3), adenosin (C10H13N5O4), ergosterol (C28H44O), nucleosides và nucleobasees (Tsai et al., 2010). Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm Cordyceps militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) (Hur et al., 2008). Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Yan et al. (2008), cộng sự cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm. Hình 2.3. Cấu trúc của các hợp chất chính trong Cordyceps militaris Nguồn: Chiu et al (2016) Hợp chất Cordycepin (3′-deoxyadenosine) là một Alkaloid được tìm thấy trong nhiều loài của chi Cordyceps: C. sinensis, C. militaris,.... Cordycepin được 7 chiết xuất từ nấm C. militaris có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch (Shonkor et al., 2010). + Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C. militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao et al., 2011). + Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu cho thấy khi dùng chế phẩm từ Cordyceps militaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hình dạng bình thường tăng. Hiệu quả này được duy trì thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dụng chế phẩm. Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn (Lin et al., 2007). + Hạn chế vius cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A. Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Yuko et al., 2007). + Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: Trong nấm C. militaris có loại protein (CMP), khi tách chiết loại protein này từ nấm có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính hóa học trong khoảng pH = 7 - 9. Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quan (Byung-Tae et al., 2009). Ngoài ra hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được nghiên cứu ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột (Young et al., 2000). Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch (Seulmee et al., 2009). + Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn sợi huyết, và do đó xúc tiến việc phân hủy sợi huyết. Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ các nguồn khác. Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho 8