Tài liệu Nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------------***------------ NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, năm 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------***------------ Nguyễn Cẩm Hà NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số : 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Đặng Diễm Hồng Hà Nội, năm 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Diễm Hồng – Trưởng phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi đều kiện, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi mong muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ nhiệt tình và các ý kiến đóng góp quý báu của tất cả các Anh/Chị và các Bạn đồng nghiệp của Phòng Công nghệ Tảo. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn mọi sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến người Mẹ của tôi, đến gia đình người thân cũng như Bạn bè đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên cao học Nguyễn Cẩm Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nguyễn Cẩm Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... i DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. iii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Giới thiệu chung về squalene............................................................................3 1.1.1. Nguồn gốc squalene ...................................................................................3 1.1.2. Cấu trúc squalene .......................................................................................3 1.1.3. Tính chất hóa học của squalene ..................................................................4 1.1.4. Con đường sinh tổng hợp cholesterol ........................................................5 1.2. Vai trò của squalene..........................................................................................6 1.2.1. Squalene là một tác nhân chống lão hóa ....................................................6 1.2.2. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con người ......................................9 1.2.2.1. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư ...........................................9 1.2.2.2. Vai trò của squalene trong giải độc....................................................11 1.2.2.3. Đối với các bệnh khác ........................................................................11 1.2.3. Vai trò của squalene trong công nghiệp mỹ phẩm ...................................12 1.2.4. Vai trò của squalene đối với các ngành công nghiệp khác ......................14 1.3. Các nguồn khai thác squalene.........................................................................14 1.4. Nghiên cứu khai thác squalene từ vi tảo trên thế giới ....................................18 1.5. Một số hướng nghiên cứu về squalene trên thế giới ......................................20 1.6. Nghiên cứu trong nước về squalene ...............................................................21 1.7. Một số giới thiệu về chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium của Việt Nam 22 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................25 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ...........................................................................25 2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy ..............................................................25 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................26 2.2. Phương pháp ...................................................................................................27 2.2.1. Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào ..................................................27 2.2.2. Xác định hình thái và kích thước tế bào bằng kính hiển vi quang học ....27 2.2.3. Xác định sinh trưởng qua sinh khối khô ..................................................28 2.2.4. Phương pháp nhuộn lipid bằng Nile red ..................................................28 2.2.5. Tách chiết lipit ..........................................................................................29 2.2.6. Định lượng squalene bằng phương pháp so màu ....................................29 2.2.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô .......................................................30 2.2.7.1. Tách chiết squalene thô ......................................................................30 2.2.7.2. Tinh sạch squalene thô .......................................................................31 2.2.8. Xác định squalene bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng ...........................31 2.2.9. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột ....................................32 2.2.10. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp ...........................................32 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................33 3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng làm nguyên liệu cho tách chiết squalene ...................................................................................33 3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao ...........36 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red................................36 3.2.2. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu ...38 3.2.3. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối tảo bằng phương pháp so màu ................................................................................................................38 3.2.4. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối bình lên men 30 lít bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp ..............................................................43 3.2.4. 1. Tách chiết lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số ........................43 3.2.4.2. Xác định squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp ......43 3.2.4.3. Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - bản nhỏ để sàng lọc nhanh chóng các chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao ................47 3.3. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột...........................................48 3.3.1. Xác định squalene bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ..........................48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.2. Phân tách và tinh sạch squalene bằng sắc ký cột silicagel .......................49 3.4. Quy trình tách chiết squalene từ sinh khối tảo dị dưỡng S. mangrovei PQ6 ..50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................55 KẾT LUẬN ..............................................................................................................55 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt Viết đầy đủ 1 Cs Cộng sự 2 DHA Docosahexaenoic Acid (C22: 6n-3) 3 EPA Eicosapentaenoic Acid (C20:5n-3) 4 GC Gas chromatography (sắc ký khí) 5 GC-MS Gas chromatography mass spectrometry 6 GOT Glutamatoxaloacetat transaminase 7 GPT Glutamate pyruvate transaminase 8 HCB Hexan chloro benzene 9 HPLC High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng cao áp) 10 HMG-C Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A 11 LDL-C Low Density Lipoprotein –Cholesterol (lipoprotein tỷ trọng thấp gắn với cholesterol) 12 MJA Methyl jasmonate 13 PFAD Palm fatty acid distillate 14 Ras Rat sarcoma 15 Rf Retention factor 16 SKK Sinh khối khô 17 SKT Sinh khối tươi 18 TLC Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) 19 TBFN Terbinafine 20 VTB Vi tảo biển i Nguyễn Cẩm Hà - K16 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene ...............................................................5 Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở người ....................................................................13 Bảng 1.3. Hàm lượng squalene trong các loại dầu ...................................................16 Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng, 2 loài dị dưỡng và điều kiện nuôi cấy chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm ..................................34 Bảng 3.2. Hàm lượng lipit của một số loài VTB đã được sử dụng trong nghiên cứu .....38 Bảng 3.3. Hàm lượng squalene của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu ............................41 Bảng 3.4. Hàm lượng squalene của chủng PQ6 được phân tích bằng TLC và HPLC ....46 ii Nguyễn Cẩm Hà - K16 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C30H50) ....................................................4 Hình 1.2. Squalene synthase trong con đường sinh tổng hợp cholesterol ..................7 Hình 1.3. Mặt cắt các tuyến bã nhờn ở da người ......................................................13 Hình 1.4. Hình thái của tế bào Schizochytrium ........................................................23 Hình 3.1. Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp dưới kính hiển vi quang học ..........................................................................................34 Hình 3.2. Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 (A) và Thraustochytrium striatum (B) ..........................................................35 Hình 3.3. Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mô bình từ 250 mL đến bình 10 lít.....................................................................35 Hình 3.4. Hình ảnh minh họa nuôi trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 và ......36 Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) của 5 chủng vi tảo quang tự dưỡng và 2 chủng vi tảo dị dưỡng với độ phóng đại 1500 lần. .......................................37 Hình 3.6. Ảnh minh họa cho các giai đoạn khác nhau của phản ứng tạo màu đối với squalene chuẩn (1, 2, 3, 4, 5, 6 tương ứng với các nồng độ 0,01; 0,04; 0,05; 0,06; 0,08; 0,10 mg) trong phương pháp xác định squalene bằng so màu. ..39 Hình 3.7. Ảnh minh họa quá trình xác định hàm lượng squalene ở các loài tảo quang tự dưỡng và dị dưỡng bằng phương pháp so màu .................................................40 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn và OD400 .............................................................................................................40 Hình 3.9. Ảnh minh họa cho quá trình phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số ...........................................................................................................43 Hình 3.10. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 ....................................................................................................44 Hình 3.11. Đường chuẩn về mối tương quan giữa hàm lượng squalene và diện tích peak 45 Hình 3.12. Sắc ký đồ của squalene chuẩn xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC và HPLC .............................................................................................................45 iii Nguyễn Cẩm Hà - K16 Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu PQ6 squalene được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng và xác định bằng HPLC ................................................................................46 Hình 3.14. Áp dụng phương pháp TLC (bản nhôm, bản nhỏ) để sàng lọc nhanh các chủng vi tảo biển có hàm lượng squalene cao. Đường 0- saqualene chuẩn .47 Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng xác định squalene từ mẫu chuẩn và mẫu lipit không xà phòng hóa của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau.. ....................49 Hình 3.16. Ảnh minh họa cho quá trình tinh sạch squalene từ lipit không xà phòng hóa 49 Hình 3.17. Sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký đồ (B) của mẫu squalene từ chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua cột silicagel.. ...............................................................50 Hình 3.18. Tách lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6..............................................51 Hình 3.19 Tách squalene thô từ lipit tổng số của chủng PQ6 ...................................52 Hình 3.20. Tinh sạch squalene thô từ lipit tổng số ...................................................53 iv Nguyễn Cẩm Hà - K16 MỞ ĐẦU Squalene là tiền chất steroit của động, thực vật, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở động vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể bởi nó là một chất chống oxy hoá tự nhiên có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) đã được chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm đáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy chúng cũng được dùng phổ biến trong dược phẩm. Cho đến nay, các nguồn sản xuất squalene được biết đến nhiều nhất là các loại dầu động, thực vật. Dầu o liu chứa hàm lượng squalene cao nhất trong khi một số loại dầu khác như dầu cọ, dầu ngô, dầu vừng lại có hàm lượng squalene không cao. Dầu gan cá mập là một nguồn nguyên liệu truyền thống cho tách chiết squalene có hàm lượng và chất lượng cao. Tuy nhiên, việc duy trì nguồn cung cấp squalene liên tục và lâu dài ngày càng gặp khó khăn do sự suy giảm nguồn cá trong tự nhiên cũng như các vấn đề về thổ nhưỡng và mùa vụ của các loại cây trồng. Trong khi đó, hiện nay, trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm đang ngày càng tăng. Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống để tách chiết squalene là rất cần thiết và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong đó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên qui mô lớn. Tảo lục Botrycoccus braunii có khả năng tổng hợp squalene cao nhưng tốc độ sinh trưởng rất thấp và là cơ thể quang tự dưỡng bắt buộc nên gây khó khăn cho việc thương mại hóa sản phẩm này. Trong khi đó, một số các loài vi tảo biển dị dưỡng như thraustochytrids được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản Nguyễn Cẩm Hà - K16 1 xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene. Chi tảo thraustochytrid có hàm lượng squalene cao, có tốc độ sinh trưởng cao trong điều kiện nuôi cấy dị dưỡng có bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và không cần có ánh sáng bởi vì cơ thể chúng có bộ máy quang hợp đã bị thoái hóa. Do vậy, việc nâng cấp quy mô nuôi trồng chúng bằng các hệ thống bình lên men khác nhau để bảo đảm cung cấp đủ nguồn nguyên liệu cho sản xuất squalene hứa hẹn sẽ có thành công. Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hiện đang có một tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng của Việt Nam. Nhiều loài vi tảo trong tập đoàn giống có thể là nguồn cung cấp cho việc tách chiết squalene trên quy mô lớn. Chính vì vậy, chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam” nhằm cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene ở vi tảo biển Việt Nam, có được các phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm về tách chiết, xác định squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng cho việc nghiên cứu sâu hơn theo định hướng sử dụng squalene làm thực phẩm chức năng và dược phẩm trong tương lai ở Việt Nam Luận văn nghiên cứu có một số nội dung như sau: 1. Sàng lọc một số chủng vi tảo biển của Việt Nam có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn và có hàm lượng squalene cao. 2. Xây dựng các phương pháp xác định nhanh chóng hàm lượng squalene phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam để sử dụng cho việc sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng cho sản xuất squalene. 3. Bước đầu tách chiết và làm sạch squalene từ chủng tiềm năng lựa chọn được. Công việc nghiên cứu được thực hiện tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyễn Cẩm Hà - K16 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về squalene 1.1.1. Nguồn gốc squalene Mặc dù ở độ sâu từ 500m -1000m dưới lòng biển, nơi hầu như không có ánh sáng mặt trời, không có thực vật, do đó hàm lượng oxy rất thấp, nhiệt độ trung bình quanh năm khoảng 2°C, áp suất nước là 50-100kgf/cm2 nhưng cá mập biển sâu vẫn sống và tồn tại được. Một vấn đề được nêu ra là làm sao loài cá mập đại dương lại có thể sinh tồn trong một môi trường sống khắc nghiệt như vậy được. Các nhà sinh vật học đã nghiên cứu và nhận thấy ở loài cá mập đại dương này có bộ phận gan lớn hơn rất nhiều so với gan của các loài cá khác. Trong đó, 80% gan cá này là dầu có chứa một chất được xem là “thần bí”. Sau này, chất này được xác định là squalene. Khả năng tồn tại được trong điều kiện sống bất lợi nêu trên đối với cá mập đại dương liên quan nhiều đến sự có mặt squalene với hàm lượng cao ở gan của nó. Squalene có khả năng nâng cao sức sống cho tế bào và tăng sức đề kháng của cơ thể cá mập và chính những điều này đã giúp cho loài cá này có thể tự do sinh tồn trong môi trường biển với độ sâu 500m – 1000m. Dầu gan cá mập chứa khoảng 60-85% chất hữu cơ nêu trên trong khi ở dầu oliu chất này có hàm lượng chỉ khoảng 0,4- 0,8 %. Cư dân của bán đảo Izu của Nhật Bản đã uống một loại dầu được đặt tên địa phương là “Samedawa” có nghĩa là “chữa được tất cả” các bệnh. Theo các dẫn chứng khoa học thì từ xa xưa, người Nhật Bản chủ yếu đã sử dụng nhiều hải sản trong chế độ ăn uống của họ. Vì vậy, không quá ngạc nhiên vào năm 1916, một nhà hóa học người Nhật Bản là Tiến sĩ Tsujimoto đã chứng minh được rằng “Samedawa” chứa một lượng rất lớn các hydrocacbon không bão hòa. Ông gọi nó là squalene do sự xuất hiện của nó trong dầu gan cá mập, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [90]. 1.1.2. Cấu trúc squalene Mười năm sau phát hiện của Tiến sĩ Tsujimoto, cấu trúc của squalene đã được xác định như một dihydrotriterpene và là một chất trung gian trong quá trình Nguyễn Cẩm Hà - K16 3 sinh tổng hợp của steroit [39]. Năm 1934, Robinson đã công bố cấu trúc vòng của squalene với phân tử steroit [78]. Tuy nhiên, đến năm 1936 công thức hóa học của squalene mới được công bố đầy đủ do Karrer, (1943) – người cũng đã khám phá ra cấu trúc hóa học của vitamin A và E. Squalene từ dầu gan cá mập được đặt tên theo tiếng Latin là “squalene oxogene oleum”. Trong y học nó được gọi là Spinacene hay Supraene. Theo công bố của Kohno và cộng sự (1995) [52] thì squalene có cấu tạo: (2,6,10,15,19,23–hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexane) - là một hydrocacbon hợp chất béo không bão hòa (C30H50), với 6 liên kết đôi, chứa 6 đơn vị isoprene để cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol axit mật và steroit, là một chất trao đổi trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và triterpenes ở động vật và thực vật (Hình 1.1). Do cấu trúc của liên kết đôi trong sáu nhóm CH 3, các isoprenoit có tác dụng chống oxy hóa tự nhiên một cách mạnh mẽ. Squalene có cấu trúc tương tự như các isoprenoit khác như β-carotene, lycopene, vitamin A, vitamin E, và coenzyme Q10 [24]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C30H50) [48] Trên thực tế, squalene là một chất trao đổi trung gian và là tiền chất của quá trình tổng hợp cholesterol. Trong cơ thể của con người, squalene được biến đổi thành cholesterol chứa lipoprotein tỷ trọng cao nhờ đó mà cholesterol tốt tăng lên và cholesterol xấu giảm đi. 1.1.3. Tính chất hóa học của squalene Squalene không tan trong nước, tan ít trong rượu, axit axetic lạnh, tan vô hạn trong ete, ete dầu hỏa, aceton và các dung môi hòa tan chất béo khác. Ở dạng tinh Nguyễn Cẩm Hà - K16 4 khiết, nó gần như không màu, không mùi, không vị. Ngoài ra, squalene hấp thụ oxy và trở nên sền sền trông gần giống như dầu hạt lanh (Bảng 1.1) Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene (http://en.wikipedia.org/wiki/Squalene) Trạng thái Chất lỏng Nhiệt độ nóng chảy (độ C) -5 Điểm sôi (độ C) 429 Điểm chớp cháy (độ C) 254 Trọng lượng phân tử 410,73 Độ tan trong nước (g/l) Không tan trong nước Tỷ trọng tương đối (không khí =1) >1 Nhiệt độ bay hơi (kJ/mol) 65,8 Tỷ trọng hơi (không khí =1) 14,2 1.1.4. Con đƣờng sinh tổng hợp cholesterol Kể từ khi được phát hiện vào đầu thế kỉ XX, squalene đã được công nhận là mắt xích quan trọng trong con đường trao đổi chất, là một bước trung gian trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol và tất cả các hormone steroit. Cholesterol gắn với lipoprotein có trọng lượng phân tử thấp (LDL-C, Low Density Lipoprotein Cholesterol) có hàm lượng cao là một nguy cơ đối với những người mắc bệnh tim. Statins là một trong những loại thuốc làm hạ cholesterol máu, có tác dụng ngăn chặn bệnh tim ở người bởi nó ức chế enzyme hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase) có vai trò xúc tác tạo ra cholesterol. Tuy nhiên, statins có thể gây ra tác dụng phụ ở một số bệnh nhân và đối với một phạm vi người nào đó thì nó lại không có hiệu quả. Thay thế cho statins, hiện nay, một số tác nhân làm giảm cholesterol bằng cách ức chế trực tiếp quá trình sinh tổng hợp squalene được cho là đầy hứa hẹn. Squalene được chứng minh là một chất ức chế hoạt tính Nguyễn Cẩm Hà - K16 5 của nhóm HMG-CoA reductase và làm tăng hoạt động của Acyl CoA cholesterol acyltransferase [53]. Trong thực tế, tổng hợp nội sinh của squalene bắt đầu bằng việc sản xuất HMG-CoA. Giảm hàm lượng HMG-CoA sẽ kéo theo hình thành mevalonate [7]. Cholesterol được tổng hợp theo con đường mevalonate. Sau các phản ứng sinh hóa, các nhóm prenyl được bổ sung, các phân tử của nhóm trung gian farnesyldiphosphate được tập hợp và giảm đi, kết quả là hình thành squalene. Sau quá trình sinh tổng hợp, squalene có thể được vận chuyển tới các khu vực khác của cơ thể trong các mô hoặc được chuyển hóa để cuối cùng cholesterol và các chất chuyển hóa steroit của nó được tổng hợp [65]. Sự xuất hiện squalene trong các tế bào ảnh hướng đến tốc độ tổng hợp enzyme HMG-CoA reductase do đó ảnh hưởng đến toàn bộ quá trình tổng hợp của isoprenoit và cholesterol. Các nghiên cứu lâm sàng đã cho thấy ức chế sinh tổng hợp squalene có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol cũng như LDL-C. Squalene synthase đóng một vai trò quan trọng trong con đường sinh tổng hợp cholesterol vì nó chịu trách nhiệm phân bố các chất trung gian của cả nhóm sterol và không sterol (Hình 1.2.). Tuy nhiên, tổng hợp squalene nhiều có thể là một trong các nguyên nhân gây ra bệnh tăng cholesterol trong máu. 1.2. Vai trò của squalene 1.2.1. Squalene là một tác nhân chống lão hóa Theo Tổ chức Y tế thế giới, “lão hóa” hoặc “quá trình lão hóa” là sự thay đổi một loạt hình thái và sinh lý xuất hiện như một hệ quả tất yếu qua thời gian, giảm khả năng thích ứng của các cơ quan và hệ thống cũng như khả năng đáp ứng với những tác nhân có hại. Lão hóa là một quá trình phức tạp được thể hiện trong một cơ thể sinh vật ở nhiều mức cấp độ: di truyền, phân tử, tế bào, trong các cơ quan và hệ thống. Mặc dù các cơ chế phân tử của quá trình lão hóa vẫn chưa được biết rõ nhưng ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra vai trò của oxy và nito là một trong những nhân tố quyết định chính trong quá trình lão hóa. Tình trạng stress oxy hóa xảy ra ở con người có thể do chế độ ăn uống và hoạt động thể chất gây ra. Tình trạng stress oxy hóa này cũng có thể giảm xuống mức độ bình thường thông qua Nguyễn Cẩm Hà - K16 6 việc bổ sung các chất chống oxy hóa tự nhiên có vai trò ngăn chặn và bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh về tuổi tác [21]. Hình 1.2. Squalene synthase trong con đƣờng sinh tổng hợp cholesterol [28]. Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy chế độ ăn kiểu Địa Trung Hải trong những năm 90s là rất tốt cho sức khỏe con người, giảm tỷ lệ mắc bệnh mạch vành [47] và một số loại bệnh ung thư [94]. Đó là do trong thành phần thức ăn rất giàu vitamin, chất chống oxy hóa và các chất béo không bão hòa đa nối đôi [58], [68]. Nghiên cứu được tiến hành trên người tình nguyện đã cho thấy một số thành phần trong dầu ô liu (polyphenol, squalene) được con người sử dụng rất có lợi đối với sức khỏe. Ăn nhiều thức ăn chứa nhiều chất béo thì tình trạng stress oxy hóa sẽ gây ra viêm, rối loạn chức năng nội mô, tăng đông máu, xơ vữa động mạch nhưng với một chế độ ăn có bổ sung chất chống oxy hóa có thể giảm thiểu tình trạng nêu trên [67]. Nguyễn Cẩm Hà - K16 7 Squalene bảo vệ tế bào và màng sinh học của các cơ quan bào tương khỏi sự oxy hóa cũng như góp phần duy trì ổn định quá trình chuyển hóa cholesterol và giữ LDL-cholesterol ở mức tối thiểu [35]. Màng sinh học dễ bị tổn thương bởi các gốc tự do, đặc biệt là ở nhóm kị nước giữa hai lớp lipidic. Squalene được quan tâm chú ý bởi khả năng tuyệt vời của nó trong việc nhận và cho điện tử mà không gây ra bất kỳ một sự thay đổi phân tử nào. Khả năng và hiệu quả chống oxy hóa ổn định là do sáu đơn vị isoprenoit trong cấu trúc của squalene quyết định. Squalene có hai dạng là dạng vòng và dạng không tạo vòng. Dạng không tạo vòng có tính kỵ nước hoàn toàn và không tham gia vào màng sinh học. Nó bị thu hút do các nhóm giữa hai lớp lipit, tích tụ ở đó và thực hiện nhiệm vụ chống oxy hóa, bắt giữ các gốc tự do [24]. Một số mô hình thí nghiệm đã chỉ ra rằng loại hydrocacbon như squalene khi nằm ở giữa lớp màng lipit kép sẽ ức chế sự vận chuyển proton và việc này có thể dẫn đến sự tiêu thụ không hiệu quả năng lượng tế bào [38]. Đặc biệt, các axit béo không bão hòa đa nối đôi (bao gồm cả các thực phẩm có chứa lipit) dễ dàng bị oxy hóa và quá trình trên có một vai trò quan trọng liên quan đến tính toàn vẹn của màng sinh học. Thật tuyệt vời khi squalene có khả năng bảo vệ các axit linoleic, linolenic, docosahexaenoic (DHA) và eicosapentaenoic (EPA) chống lại sự o xy hóa phụ thuộc vào nhiệt độ [27]. Từ những năm 50s nhiều công bố đã cho thấy sự tạo vòng của squalene với lanosterol để tạo thành oxydosqualene liên quan tới sự tổng hợp cholesterol và hoạt động chống oxy hóa [95]. Ở một số điều kiện nhất định, squalene dạng không vòng bị mất đi sự ổn định của nó và trở thành dạng vòng cùng với việc khi đó khả năng chống oxy hóa bị giảm đi. Để ổn định, squalene cũng liên kết với các ion hydro từ nước và axit trong cơ thể đi kèm với việc giải phóng oxy trong cơ thể theo phản ứng sau: C30H50 (squalene) + 6H2O (nước) -> C30H62 (squalane) + 3O2 (oxy) [88] Như vậy, squalene đã giúp cho việc bảo đảm oxy ở nồng độ nhất định trong tế bào, và tình trạng này giúp cải thiện hơn nữa các chức năng của cơ quan thông qua quá trình trao đổi chất hiếu khí, ngăn ngừa hội chứng bị axit hóa (acidotic) trong tế bào - nơi các tế bào có tính axit có thể trở nên xấu đi và chết do thiếu oxy Nguyễn Cẩm Hà - K16 8 [25]. Hai tác giả Alvaro và Eduardo cũng đã công bố squalene có tính chất hóa học như isoprenoit, có cấu trúc tương tự với carotenoit như lycopene, với vitamins A và E cũng như các chất chống oxy hóa nội sinh khác như glutathione, superoxide dismutase và ubiquinone (coenzyme Q10) [7]. Tất cả các chất nêu trên đều có khả năng chống oxy hóa cao. Ở trong cơ thể người, squalene được vận chuyển trong máu bởi các lipoprotein tỷ trọng thấp, nó phân bố chủ yếu trên da. Squalene dễ dàng xâm nhập vào màng tế bào do tính chất kị nước và có thể được vận chuyển trong tế bào nhờ các protein chuyên chở squalene tổng hợp trong gan. Chính vì vậy, squalene đóng vai trò quan trọng như một chất chống oxy hóa trong màng tế bào cũng như ở các bào quan khác nhau trong tế bào. Nhìn chung có thể nói squalene có khả năng bổ sung dưỡng khí cho tế bào, có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa, bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương do gốc tự do, tăng tốc độ tuần hoàn của máu, tăng khả năng tái sinh của tế bào, phòng ngừa hiện tượng lão hóa của da và các cơ quan trong cơ thể, giúp cho làn da và cơ thể hồi phục lại sức sống và nét thanh xuân. 1.2.2. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con ngƣời 1.2.2.1. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư Squalene đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ chống lại một số chất gây ung thư [83]. Năm 1996, Desai và các cộng sự của ông đã làm thử nghiệm trên 50 con chuột cái, gây thực nghiệm các khối u trên da bằng 7,12-dimethylbenz [a] anthracene và 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Sau đó, chuột được điều trị với 5% squalene đã làm giảm tỷ lệ mắc khối u ở nhóm này là 26,7% [26]. Squalene có vai trò ngăn ngừa ung thư phổi trên chuột thực nghiệm cũng đã được công bố [84]. Các nghiên cứu thực nghiệm đã cho thấy squalene có thể ức chế về mặt hóa học một cách hiệu quả các khối u trên da ở loài gặm nhấm. Squalene cũng có vai trò trong hóa trị liệu đối với ung thư tuyến tụy ở người. Việc bổ sung squalene vào trong màng bụng để tăng cường chức năng của hệ thống lưới nội mô, đặc biệt là kháng thế IgM đã cho thấy loài gặm nhấm cái có mang bướu thịt 180 có thể kéo dài được sự sống của nó [66]. Hơn nữa, squalene cũng có tác dụng bảo vệ tế bào dựa Nguyễn Cẩm Hà - K16 9