Tài liệu Nghiên cứu sản xuất IgG KHÁNG DỊCH HẠCH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT  NGUYỄN THỊ LOAN BỨỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ÑAØ LAÏT – 2010 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT  NGUYỄN THỊ LOAN BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60 42 30 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN BỔN Đà Lạt - 2010 2 Luận văn này được hoàn thành tại: Phân xưởng Vắc xin thành phẩm – Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN BỔN Phản biện 1: …………………………………………………….. Phản biện 2: …………………………………………………….. Luận văn này sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm thi luận văn Thạc sĩ họp tại: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………… Vào lúc: …… giờ, ngày………..tháng………năm 2010 Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Đà Lạt 3 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:  Ban giám hiệu và các thầy cô giáo Khoa Sau đại học - trường Đại học Đà Lạt đã tạo điều kiện cho tôi học tập, truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập tại trường.  Tiến sĩ Phan Bổn, Quản đốc phân xưởng Vắc xin thành phẩm, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện đề tài.  Ban giám đốc Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt đã cho phép và tạo điều kiện cơ sở vật chất để tôi thực hiện đề tài.  TS. Nguyễn Xuân Tùng đã tận tình giúp đỡ, cung cấp cho tôi một số tài liệu để tôi hoàn thành luận văn.  Các anh chị cùng các cô kĩ thuật viên của phân xưởng Vắc xin thành phẩm đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.  CN. Trần Ngọc Nhơn, CN. Đặng Hồng Vân Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện một số kĩ thuật trong phòng thí nghiệm để tôi hoàn thành đề tài.  Thầy Nguyễn Văn Chức, cán bộ thư viện trường Đại học Đà Lạt đã nhiệt tình giúp tôi tìm kiếm thông tin, tài liệu để tôi thực hiện đề tài.  Gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Học viên: Nguyễn Thị Loan 4 ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra. Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét. Bệnh đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong. Tuy đã được phát hiện từ lâu nhưng hiện nay các ổ dịch thiên nhiên vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực trên trái đất. Trong gần nửa thế kỉ qua có 7 quốc gia trên thế giới bệnh xảy ra hàng năm là Brazil, Cộng hòa Dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanma, Pêru, Hoa Kì và Việt Nam [6,23,50]. Hiện nay bệnh dịch hạch vẫn còn tồn tại ở nhiều khu vực trên thế giới, đặc biệt là ở Châu Phi. Gần đây nhất tháng 08/2009 ở Trung Quốc dịch hạch thể phổi đã xuất hiện làm 3 người thiệt mạng, 12 người bị nhiễm bệnh và hơn 10.000 người bị cách ly [57]. Ở Việt Nam, dịch hạch đã xuất hiện lần đầu tiên ở Nha Trang ( 1898 ) và Sài Gòn (1906). Kể từ khi xuất hiện, dịch hạch tiếp tục lây lan ra các tỉnh, thành trong cả nước và trở thành dịch lưu hành địa phương. Khu vực miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ là những nơi có tỉ lệ mắc dịch hạch cao nhất trong cả nước. Đặc biệt là giai đoạn 1966 – 1972 dịch lớn xảy ra ở Việt Nam chiếm hầu hết số mắc trên thế giới. Số mắc và tử vong dịch hạch có chiều hướng giảm mạnh và phạm vi dịch hạch lưu hành thu hẹp nhiều. Trong bốn năm từ 1999 – 2002 dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương là hai tỉnh Đắc Lắc và Gia Lai. Hiện nay, ở Việt Nam bệnh dịch hạch đã được kiểm soát, chỉ còn tồn tại ở các ổ dịch trong thiên nhiên trong các loài gặm nhấm, không còn xuất hiện ở người và chủ yếu là ở Tây Nguyên [5, 6, 16]. Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ học vẫn phải được tiến hành thường xuyên bởi dịch có thể xuất hiện bất cứ khi nào gặp điều kiện thuận lợi và gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc sống của con người. Điển hình là dịch hạch thể phổi đã bùng phát ở Trung Quốc tháng 08 vừa qua cho thấy công tác 5 điều tra giám sát dịch tễ học dịch hạch không thể chủ quan. Vì vậy để phát hiện sớm dịch hạch trong các vật chủ ở các ổ dịch hiện nay thì đòi hỏi phải có phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác. Trong những năm qua để chẩn đoán labo và điều tra giám sát dịch tễ học dịch hạch ngoài thực địa, hầu như tất cả các labo trong nước đều sử dụng các chế phẩm chẩn đoán dựa trên các bộ kít chẩn đoán dịch hạch của Liên Xô cũ là bộ kít kháng nguyên F1 gắn hồng cầu cừu đông khô và kháng thể F1 gắn hồng cầu cừu dạng đông khô hoặc dạng nước, nguồn cung cấp này ngày càng ít đi và hầu như không còn. Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã dùng kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên F1 đặc hiệu của vi khuẩn dịch hạch, đây là phương pháp chẩn đoán cho kết quả chỉ sau vài giờ và độ chính xác lên tới 98 – 99,4%. Tuy vậy ở Việt Nam chưa có labo nào sản xuất bộ kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang để phát hiện vi khuẩn dịch hạch, vì thế để có nguồn nguyên liệu IgG sản xuất kít chẩn đoán kháng thể gắn huỳnh quang đáp ứng nhu cầu giám sát dịch tễ học dịch hạch trong nước, chúng tôi tiến hành đề tài sau: BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT IgG KHÁNG DỊCH HẠCH Mục tiêu đề tài: - Sản xuất IgG kháng dịch hạch - Đánh giá chất lượng IgG sản xuất được. Các nội dung đề tài cần tiến hành: - Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch - Nghiên cứu phát đồ gây miễn dịch - Ứng dụng các phương pháp tinh chế kháng thể IgG - Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng IgG sản xuất. 6 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 DỊCH HẠCH 1.1.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới [ 6, 20, 23, 57] Vào năm 1894, Alexandre Yersin đã phát hiện ra vi khuẩn Yersinia pestis là tác nhân gây ra bệnh dịch hạch. Kể từ khi xuất hiện, dịch hạch đã gây ra các vụ đại dịch lớn trên thế giới. Đại dịch lần thứ I xảy ra ở Trung Phi ở thế kỉ VI sau đó lan đến Hy Lạp và Địa Trung Hải đã làm cho 100 triệu người chết. Đại dịch lần thứ II xuất hiện ở Trung Á quanh biển Caspies vào thế kỉ thứ XIV sau đó xâm nhập vào Châu Âu, làm chết khoảng 50 triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu chiếm 1/3 dân số Châu Âu thời kì đó. Đại dịch lần thứ III bắt đầu từ Yunnan Trung Quốc lan đến Hồng Kông (1894). Trong vòng 10 năm ( 1894 – 1903 ) dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu. Từ 1954 – 2001, tổ chức Y tế thế giới đã ghi nhận có 38 quốc gia xảy ra bệnh dịch hạch với tổng số mắc là 89.651 trường hợp và 7.715 bệnh nhân chết. Từ 1989 – 2003, bệnh dịch hạch có chiều hướng gia tăng, đặc biệt là ở Châu Phi với số mắc là 31.273 trường hợp, chiếm tỉ lệ 82,5% tổng số mắc trên thế giới và số chết là 2.421, chiếm tỉ lệ 7,74%. Theo phát hiện mới nhất tháng 08/2009 tại thành phố Ziketan, tỉnh Thanh Hải, tây bắc Trung Quốc dịch hạch thể phổi đã bùng phát làm 3 người chết và 12 người bị nhiễm bệnh, 10.000 người đã bị cách ly để ngăn chặn dịch. Sau nhiều năm im lặng, việc xuất hiện lại bệnh dịch hạch trên người ở Ấn Độ 1994, ở Algeria vào năm 2003 và gần đây nhất là năm 2009 ở Trung Quốc đã cho 7 thấy rằng bệnh dịch hạch chưa được loại trừ hoàn toàn và là bệnh nguy hiểm có nguy cơ bùng phát bất cứ khi nào gặp điều kiện thuận lợi. 1.1.2 Tình hình dịch hạch ở Việt Nam [ 5, 6, 16 ] Từ đại dịch lần thứ III ở Hồng Kông, dịch hạch đã xâm nhập vào Việt Nam lần đầu tiên năm 1898. Trong suốt hơn một thế kỉ qua dịch hạch vẫn luôn tồn tại với những thời kì khác nhau và chưa được loại trừ hoàn toàn. Thời kì xâm nhập và lây lan nội địa ( 1898 – 1922 ) Xuất hiện lần đầu tiên tại Nha Trang ( 1898 ) dịch hạch tiếp tục lưu hành ở Sài Gòn ( 1906 ); Lạng Sơn ( 1909 ); Sóc Trăng ( 1907 ); Hà Nội, Phan Thiết và Huế (1908); Phan Rí , Đà Nẵng ( 1910 ). Thời kì lắng dịu và trở thành dịch hạch lưu hành tại địa phương ( 1923 – 1990 ) Thời kì này bệnh chỉ còn lưu hành ở một số tỉnh như: Phan Thiết, Sài Gòn. Từ hai nơi này có một số thời điểm dịch lan rộng như Lâm Đồng ( 1947, 1948, 1950 ), Bình Long và Tây Ninh ( 1955 – 1956). Thời kì bùng phát lan tràn và lưu hành trên diện rộng ( 1961 – 1990) + 1961 – 1975: dịch hạch bùng phát, lan tràn hầu hết các tỉnh thành ở miền Nam. Đặc biệt giai đoạn 1967 – 1971 dịch lớn xảy ra ở Việt Nam với số mắc là 21.716 bệnh nhân, chiếm 97,2% số mắc ở Châu Á và 89,2% số mắc trên toàn thế giới. + 1976 – 1990: dịch lây lan trên diện rộng ở các tỉnh phía bắc như Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Thái, Hà Sơn Bình, Hải Hưng, Hà Nam Ninh, Thanh Hóa và Nghệ Tĩnh. Thời kì thu hẹp và lưu hành dai dẳng tại một số ổ dịch ( từ 1991 đến nay ) Từ 1991 đến nay dịch hạch ở nước ta có xu hướng giảm xuống nhưng vẫn còn tồn tại ở một số tỉnh miền Trung, Đông Nam Bộ, nhiều nhất là ở các tỉnh Tây 8 Nguyên. Trong 4 năm ( 1999 – 2002 ) dịch chỉ còn ghi nhận tại 2 tỉnh Đắc Lắc với 194 bệnh nhân và Gia Lai 61 bệnh nhân. Nhìn chung, tình hình dịch hạch ở Việt Nam hiện nay đã được khống chế. Tuy nhiên vẫn tồn tại một số ổ dịch lẻ tẻ trong tự nhiên, chủ yếu là trên loài động vật gặm nhấm. Do đó công tác chẩn đoán huyết thanh và điều tra giám sát dịch tễ học vẫn cần tiến hành thường xuyên. 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH 1.2.1 Phân loại vi khuẩn dịch hạch Tại hội nghị quốc tế vi sinh vật học lần thứ 10 ( 1970 ) đã quyết định phân loại vi khuẩn dịch hạch như sau: Vi khuẩn dịch hạch thuộc giống Yersinia, loài pestis, họ Enterobacteriace . Giống Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài gây bệnh cho người: Yersinia pestis: gây bệnh dịch hạch Yersinia pseudotuberculosis: gây bệnh giả lao Yersinia enterocolitica: gây viêm ruột đại tràng 1.2.2 Hình thể và tính chất bắt màu [ 2, 19 ] Yersin (1894) là người đầu tiên mô tả hình thái vi khuẩn dịch hạch, tiếp theo là Gabritrevsky (1897), Allerecht và Ghon (1900) cũng mô tả tương tự. Vi khuẩn dịch hạch là trực khuẩn ngắn, hình bầu dục, tròn hai dầu, dài 1-2 μm, rộng 0,3-0,7 μm. Vi khuẩn không có lông, không di động, không sinh nha bào, nếu nuôi cấy ở 370C thì có vỏ. Chúng thường nằm riêng lẻ hay từng cặp, ít khi xếp thành đám. Vi khuẩn bắt màu lưỡng cực, Gram ( - ) rất rõ khi nhuộm bằng phương pháp Wayson. Trên các tiêu bản khác nhau, hình thể và cách sắp xếp của vi khuẩn dịch hạch có thể khác nhau. 9 Hình 1.1: Hình thể Yersinia pestis nằm riêng lẻ. 1.2.3 Tính chất nuôi cấy [ 2 ] Yersinia pestis là vi khuẩn hiếu khí. Sokkey (1938), Habbu (1943), Turnansky (1958) và những người khác cho rằng vi khuẩn dịch hạch có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ -20C - 450C , nhiệt độ thích hợp hơn là 270C - 280C; pH tối thích là 6,9 – 7,1. Vi khuẩn có thể sinh trưởng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường canh thang: Sau 24- 48 giờ vi khuẩn tạo thành những bông tuyết lơ lửng trong canh thang bám vào thành ống nghiệm, dưới đáy có lắng cặn nhưng canh thang vẫn trong. Trên bề mặt có thể tạo thành một váng mỏng khi thời gian nuôi cấy kéo dài, đây là cách mọc theo lối ngưng kết. Trên môi trường thạch đặc: Sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn dịch hạch tạo thành khuẩn lạc dạng R điển hình có kích thước 2-3mm, màu trắng trong, bờ dẹt. Nếu nhìn dưới kính hiển vi thấy ở giữa có các hạt màu nâu xám, bề mặt xù xì lồi cao, trong có hình răng cưa. Nếu để 10 khuẩn lạc tiếp tục phát triển ở giữa tối dần và lồi cao hơn, vùng răng cưa xung quanh giảm dần rồi mất hẳn. Dù là môi trường nào đi nữa, theo Girard: “ Tất cả các giống vi khuẩn nào làm đục môi trường thì không phải là trực khuẩn dịch hạch”. Tính chất sinh trưởng của Y.pestis trên môi trường nuôi cấy sẽ thay đổi tùy thuộc vào thành phần môi trường và nhiệt độ. Nhiều tác giả đã nghiên cứu về nguyên nhân cũng như ý nghĩa thực tiễn của các yếu tố này. 1.2.4 Tính chất sinh hóa:[ 2, 27, 33 ] Thành phần sinh hóa của Yersinia pestis: Nước chiếm tỉ lệ từ 75-85% trọng lượng tế bào vi khuẩn. Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Thành phần khô của Yersinia pestis được tạo thành từ các chất vô cơ và hữu cơ, gồm: + Các chất khoáng (chiếm 3,5 - 4%): gồm phospho, kali, natri, magie, lưu huỳnh, canxi,clo và sắt. + Các chất hữu cơ gồm: protein chiếm khoảng 62-77%, acid nucleic 8-14,8% và glucid chiếm 2,5 - 20% phần khô của tế bào. Tính chất sinh vật hóa học: Yersinia pestis có khả năng tổng hợp các loại enzym cần cho quá trình trao đổi chất. Một số phản ứng sinh hóa trong quá trình trao đổi chất đã được dùng để chẩn đoán và phân chia giữa các loài VKDH từ các ổ dịch thiên nhiên khác nhau. Y. pestis có khả năng phân giải không sinh hơi các loại đường: glucose mannitol, levulose, galactose, mantose, không len men đường rhamnose, lactose và melibiose. Sản phẩm của sự phân giải này được Y. pestis sử dụng làm nguồn nguyên liệu và năng lượng để xây dựng tế bào. Ngoài ra, một số sản phẩm trung gian của quá trình trao đổi glucid còn tham gia tích cực vào các phản ứng quan trọng khác của sự trao đổi chất. Hầu hết các chủng VKDH không sinh indol, H2S; không có khả năng 11 phân giải urê. Kết quả phản ứng khử nitrat và lên men glycerol khác nhau được sử dụng để phân chia các nhóm trực khuẩn dịch hạch. 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên [ 21, 26, 30, 32, 37, 38, 48, 50 ] Schiitre là người đầu tiên nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên của Y. pestis. Bằng phương pháp hấp phụ và kết tủa ông đã thu được kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân. Các nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc kháng nguyên của Y. pestis được mở ra khi các nhà khoa học sử dụng phương pháp kết tủa trong thạch. Allan và cs, Crumpton và Davies đã xác định thành phần của Y. pestis gồm: - Kháng nguyên vỏ - Kháng nguyên độc tố. - Kháng nguyên do các thành phần polysaccarit không đóng vai trò bảo vệ Số lượng kháng nguyên của VKDH được phát hiện nhiều nhưng chỉ có một số được nghiên cứu kĩ là KN F1, KN VW, KN độc tố, các chất và các men có hoạt tính kháng nguyên ( pesticine, congulase, fibrinolizine ). Kháng nguyên F1: KN F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có Y. pestis mới có KN F1. Các vi khuẩn nhóm khác không có KN này. William và cs đã nghiên cứu trên 300 chủng Y. pestis độc và không độc ( EV76) cho thấy tất cả các chủng đều có KN F1, bởi vậy KNF1 được dùng cho chẩn đoán dịch hạch. Khi nuôi cấy Y. pestis ở 370C, F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt tế bào. Còn khi nuôi cấy ở 280C, F1 chỉ được hình thành rất ít và nằm dưới dạng kết hợp với các thành phần khác. KN F1 có trọng lượng phân tử là 2.032.229 Da. Phân tử protein KN F1 có cấu trúc bậc 4 với kiểu tác dụng tương hỗ không hóa trị và kị nước. KNF1 dạng keo có cấu trúc bên trong theo kiểu hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm và kênh nhỏ xác định nó như một màng sinh học phụ thêm của thành phần tế bào. KN F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc biệt đã tạo cho nó có tính đề kháng cao với các nhân tố hóa lí. KN F1 bền với nhiệt, đun nóng 80-1000C trong 15 12 phút mới làm biến đổi các hapten của nó và chỉ bị phân hủy hoàn toàn khi nung nóng 1000C/1 giờ. KN F1 là yếu tố độc lực chủ yếu có khả năng chống lại thực bào của các bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân. KN F1 có tính sinh miễn dịch. KN F1 có khả năng kích thích tạo ra kháng thể chống lại nhiễm trùng ở động vật. Một tính chất quan trọng khác nữa đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh KN F1 trợ giúp cho Y. pestis trốn được thực bào. KN F1 có tính đa năng là một KN quan trọng nhất của Y. pestis, một nhân tố miễn dịch tích cực hàng đầu và có tính đặc hiệu cao duy nhất chỉ có ở Y. pestis. Do đó KN F1 đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết thanh bệnh dịch hạch. Kháng nguyên V và W: Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y. pestis nhờ kháng nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với KN F1. Những chủng không độc thiếu KN F1 có thể kháng thực bào nhờ các kháng nguyên này. Y. pestis sản sinh kháng nguyên V và W đồng thời chứ không tách biệt. Kháng nguyên W được tiết tự do vào môi trường xung quanh, kháng nguyên V liên kết chặt chẽ với tế bào vi khuẩn. Lawton và cs lần đầu tiên đã tách được kháng nguyên này dưới dạng tinh khiết và chỉ ra rằng KN V là protein có trọng lượng phân tử 90.000 Da và KN W là lipoprotein với trọng lượng phân tử 145.000 Da. Kháng nguyên độc tố: Y. pestis có 2 loại độc tố chính xác định khả năng gây bệnh là nội độc tố và ngoại độc tố. + Nội độc tố: Nội độc tố dịch hạch là một thành phần cấu trúc của vách tế bào và có liên quan chặt chẽ với lipopolisacarit (LPS) nội độc tố của các vi khuẩn gram (-) khác. Vào năm 1956, David đã mô tả thành phần hóa học của LPS được chiết xuất bằng phenol và nước từ Y. pestis. LPS có tất cả các đặc tính gây bệnh và tất cả những tính 13 chất sinh học như gây sốt lưỡng pha ở thỏ, choáng, gây chết ở động vật do sự hủy hoại mao mạch, hoại huyết ở thận, gan và các tổ chức khác. Ảnh hưởng sinh học khác của độc tố vi khuẩn dịch hạch có thể gây nhiễm cho con người đã được Walker chứng minh trên động vật thí nghiệm. Chúng ảnh hưởng đến sự trao đổi chất như làm giảm glycogen ở gan và máu, đồng thời tăng urê máu hoặc suy yếu chức năng của thận và trao đổi chất cacbon. + Ngoại độc tố: Ngoại độc tố dịch hạch là các enzym ngoại tiết của vi khuẩn. Ngoại độc tố là một dạng protein hòa tan gọi là độc tố murin rất độc đối với chuột nhắt nhưng ít gây chết đối với những động vật khác. Độc tố murin chỉ có ở màng tế bào vi khuẩn. Ngoại độc tố murin ức chế chức năng hô hấp của ti thể ở tế bào chuột nhưng không ức chế ti thể ở tế bào thỏ, khỉ và tinh tinh. Độc tố murin còn làm ti thể phồng lên và mất đi khả năng nhận dạng ion canxi và photpho vô cơ. Montie và cs đã phát hiện thêm murin có tác động đối kháng với AMP vòng. Việc tổng hợp munrin do plasmid Fral/Tox điều khiển. 1.3 CÁC CON ĐƢỜNG LÂY TRUYỀN BỆNH DỊCH HẠCH Dịch hạch là bệnh chủ yếu của động vật hoang dại và chuột, người chỉ là vật chủ thứ yếu. Trong tự nhiên, bệnh lan truyền qua 4 con đường: ( trong đó chủ yếu lây qua đường máu ). + Đường máu: lây qua vết đốt côn trùng, chủ yếu là do bọ chét. Bọ chét hút máu làm lan truyền bệnh trong các giống chuột và từ chuột sang người. + Đường tiêu hóa: thực phẩm, nước bị ô nhiễm do chuột trực tiếp gieo rắc mầm bệnh vào, đường lây này trên thực tế ít nguy hiểm vì trực khuẩn dịch hạch dễ bị chết khi đun sôi nấu chín. + Đường hô hấp: từ bệnh nhân dịch hạch thể phổi có thể lây trực tiếp cho người xung quanh qua các giọt đờm, nước bọt bắn ra khi bệnh nhân ho, hắt hơi, nói chuyện (lây qua đường này rất nhanh) + Đường da, niêm mạc: qua tiếp xúc trực tiếp với vùng da tổn thương (hiếm gặp). 14 1.4 MIỄN DỊCH HỌC DỊCH HẠCH [ 47, 50 ] Sau khi xâm nhập qua da nơi vết đốt của bọ chét, Y. pestis bị sự tấn công bởi các globulin miễn dịch. Nhưng vi khuẩn được mang bởi bọ chét đã có sẵn một số kháng nguyên F1 có khả năng kháng thực bào, giúp vi khuẩn thích ứng với tình trạng ký sinh và phát triển nội bào. Cơ chế hoạt động kháng thực bào của KN F1 được làm rõ bởi R.C. Williams: hai yếu tố cần cho sự opsonins để tăng tính thực bào có hiệu quả là bổ thể C2 và C4 + C2 : gắn trên bề mặt đại thực bào, giúp đại thực bào tăng khả năng bắt giữ kháng nguyên. + C4 : góp phần ngưng tập bạch cầu đa nhân tạo ổ viêm sớm Tuy vậy C2 và C4 đã bị KN F1 hòa tan vào huyết thanh làm cho con đường hoạt hóa bổ thể bị gián đoạn. Do hoạt động kháng bổ thể cực mạnh của KN F1 nên ở giai đoạn ủ bệnh thế hệ sau trở nên đề kháng với sự thực bào và chúng được tung ra từ các hạch, lan rộng khắp cơ thể, điều này đã giải thích khả năng của Y. pestis giết được vật chủ mà nó ký sinh vào. 1.5 KHÁNG THỂ 1.5.1 Cấu trúc kháng thể [ 1 ] Các kháng thể ( antibody ) hay còn gọi là các globulin miễn dịch ( immunoglobulin ) có bản chất protein, do các tế bào lympho B cũng như các tương bào ( biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. Phân tử globulin miễn dịch là một phân tử protein gồm 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một: hai chuỗi nhẹ và hai chuỗi nặng nối với nhau bằng cầu disulfide và có độ đàn hồi nhất định. 15 Hình 1.2: Cấu trúc của một phân tử kháng thể Chuỗi nhẹ, kí hiệu L ( light chain ) Chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử khoảng 23.000Da. Có 2 loại chuỗi nhẹ chung cho tất cả các lớp globulin miễn dịch: chuỗi nhẹ Kappa ( kí hiệu K), chuỗi nhẹ lambda (kí hiệu ). Tính kháng nguyên của hai loại chuỗi nhẹ này hoàn toàn khác nhau. Tỷ lệ mang chuỗi nhẹ K và của các phân tử globulin miễn dịch có khác nhau giữa các loài. Một phân tử globulin miễn dịch chứa chuỗi nhẹ K hoặc , không khi nào mang cả hai loại. Hai chuỗi nhẹ của phân tử globulin miễn dịch không những cùng loại mà còn hoàn toàn giống nhau về cấu trúc. Cho đến nay người ta thấy rằng chỉ có một chuỗi nhẹ K, nhưng có ít nhất 4 chuỗi nhẹ . Về cấu tạo chung, mỗi chuỗi nhẹ gồm 211- 221 axit amin và chia thành hai phần dài bằng nhau: + Phần hằng định, kí hiệu C (constant) tận cùng –COOH với trình tự axit amin tương đối hằng định và được kí hiệu là CK (cho typ Kappa ) và C ( cho typ lambda ). + Phần thay đổi, kí hiệu V ( variable ) tận cùng là - NH2. Trật tự axit amin trong phần này thay đổi theo từng nhóm một do đó nó khác nhau ngay cả trong một 16 cá thể, phần này được kí hiệu là VK ( cho typ Kappa ) và V ( cho typ lambda ). Trong phần này có những vị trí sắp xếp axit amin rất thay đổi. Chuỗi nặng, kí hiệu H ( Heavy chain ) Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử từ 50.000 đến 70.000 Da. Chúng được chia thành 5 lớp: , , , , . Các chuỗi nặng có tính đặc hiệu riêng và quyết định globulin miễn dịch thuộc lớp này. Tương ứng với mỗi lớp chuỗi nặng là một loại globulin miễn dịch, còn chuỗi nhẹ có thể là K hoặc . Chuỗi nặng có khoảng 440 axit amin và cũng chia thành 2 phần : + Phần hằng định ( C ) tận cùng bằng – COOH, có số axit amin nhiều gấp 3 lần số axit amin của phần hằng định chuỗi nhẹ, tức khoảng 330 axit amin. Do sự khác biệt về tính chất kháng nguyên ở vùng hằng định này mà một số lớp globulin miễn dịch còn được chia thành các lớp dưới như 1, 2, 3, 4 hoặc 1, 2. + Phần thay đổi: cũng giống như phần thay đổi của chuỗi nhẹ, vùng thay đổi chuỗi nặng ở phía tận cùng –NH2. Trong trật tự axit amin có một số đoạn cực kì thay đổi xen giữa những đoạn tương đối ổn định. Ở cả hai chuỗi nhẹ và chuỗi nặng, vùng cực kì thay đổi được xác định ở gần các axit amin 30, 50, 95. Những vùng cực kì thay đổi như thế tham gia trực tiếp vào việc hình thành vị trí kết hợp kháng nguyên. Các vùng hằng định không có vai trò nhận diện KN, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể. Do đó phần “ chân của chữ Y” còn được gọi là Fc ( tức phần hoạt động sinh học của kháng thể ). Mỗi immunoglobulin có 4 vùng thay đổi ở đầu “ hai cánh tay của chữ Y”. Sự kết hợp của một vùng thay đổi trên chuỗi nặng ( VH ) và một vùng thay đổi trên chuỗi nhẹ (VL ) tạo nên vị trí nhận diện KN ( còn gọi là paratope ). Như vậy mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn KN. Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một KT có thể gắn được với 2 KN giống nhau. Hai “ cánh tay của chữ Y” còn gọi là Fab ( tức là phần nhận biết KN ). Nơi kháng nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope. 17 Hình 1.3: Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 1.5.2 Các lớp kháng thể Các kháng thể được chia thành 5 lớp là IgG, IgA, IgM, IgD và IgE, có thể tóm tắt một số đặc tính chính của các lớp kháng thể như sau: Vị trí chủ yếu Tỉ lệ ( tổng lượng KT/HT Trọng lượng phân tử (Da) Vai trò IgG Máu IgA Niêm nhầy các dịch tiết IgM Lympho máu IgD Lympho B 5 – 10% IgE Bạch cầu ái kiềm, tế bào mast < 1% 70 – 80% 10 – 15% 150.000 150.000 – 600.000 900.000 180.000 170.000 – 200.000 Trung hòa các độc tố, VK, virus Ngưng tụ, trung hòa VK, virus Ngưng tụ theo con đường cổ điển của bổ thể Dị ứng, trung hòa các ký sinh trùng Hoạt hóa các tế bào lympho B < 1% Bảng 1.1: Tóm tắt tính chất của các lớp globulin miễn dịch khác nhau 18 Hình 1.4: Cấu trúc một số lớp kháng thể 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN DỊCH HẠCH 1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng Là bước đầu tiên chính yếu trong công tác chẩn đoán dịch hạch đối với bất cứ người nào bị sốt, hạch rất đau, số lượng hạch nhiều, kích thước hạch lớn hơn hoặc bằng 0,1 cm, nghi ngờ mắc bệnh dịch hạch, sống trong vùng có dịch hạch lưu hành hoặc từ những vùng có dịch trở về. 1.6.2 Chẩn đoán vi sinh vật 1.6.2.1 Nhuộm soi Từ các bệnh phẩm và mẫu nghiệm làm tiêu bản và nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram và Wayson. Quan sát dưới kính hiển vi xác định hình thể và tính chất bắt màu của Y. pestis. 1.6.2.2 Nuôi cấy trực tiếp Trên môi trường thạch: Có thể sử dụng nhiều loại môi trường để nuôi cấy vi khuẩn dịch hạch: thạch máu, Hottinger, Brain heart infusion ( BHI). Cấy bệnh phẩm lên các môi trường này, ủ 280C, sau 24- 48 giờ, vi khuẩn dịch hạch phát triển tạo thành khuẩn lạc dạng R. 19 Trên môi trường lỏng: Cấy bệnh phẩm vào canh thang Hottinger hoặc BHI, ủ 280C, sau 24 - 48 giờ, VKDH mọc theo lối ngưng kết, không làm đục môi trường. 1.6.2.3 Tiêm truyền cho súc vật thí nghiệm Thường sử dụng chuột bạch hay chuột lang là súc vật nhạy cảm với vi khuẩn dịch hạch. Có thể tiêm dưới da, màng bụng hoặc xát da tùy theo mức độ tạp nhiễm của bệnh phẩm. Sau khi tiêm, chuột thường chết trong vòng 3- 10 ngày với các tổn thương xuất hiện ở gan, lách, hạch, phổi. Cấy các phủ tạng vào môi trường thạch, cấy máu tim vào canh thang và làm tiêu bản nhuộm soi. Tiếp tục quy trình như nuôi cấy trực tiếp. 1.6.3 Phƣơng pháp huyết thanh học [ 2, 3, 18, 26, 33, 35, 36, 40, 42, 45, 58 ] Trong thực tế điều tra giám sát dịch hạch, dùng phương pháp chẩn đoán vi sinh vật vẫn còn nhiều trường hợp không phát hiện được. Đặc biệt với các bệnh nhân đã được điều trị sớm với kháng sinh, những người sống trong các ổ dịch đã bị nhiễm khuẩn nhưng không phát bệnh, không có triệu chứng lâm sàng nhưng huyết thanh của họ có kháng thể kháng F1 hoặc trong trường hợp cần hồi cứu thì phương pháp huyết thanh học rất cần thiết. Một số kỹ thuật sau thường được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh dịch hạch. 1.6.3.1 Ngưng kết hồng cầu thụ động phát hiện kháng thể kháng F1 của Y. pestis Người đầu tiên mở ra triển vọng dùng hồng cầu làm yếu tố tạo ngưng kết chính là Salk ( 1944 ). Ông phát hiện thấy khi hồng cầu ở nồng độ thấp ( 2,5% ) nếu có chất làm chúng ngưng kết thì hồng cầu sẽ bao phủ đáy ống nghiệm màu hồng mờ hình cái dù. Nếu không có chất làm ngưng kết thì hồng cầu lắng xuống đáy hình tròn bờ đều rõ rệt. Tiếp theo, Boyden ( 1951 ) nhận thấy có thể gắn protein lên bề mặt các hồng cầu đã được xử lý bằng axit tannic, hồng cầu này bị ngưng kết bởi KHT đặc hiệu chống protein đó. Do kháng thể trong KHT kết hợp với KN là protein nên phản ứng