Tài liệu Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi cá chim vây vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG --------------- Lê Đình Đức “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC VÀ ỨNG DỤNG BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN NUÔI CÁ CHIM VÂY VÀNG (Trachinotus blochii LACEPEDE, 1801) GIAI ĐOẠN GIỐNG” LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60.54.10 Hướng dẫn khoa học: 1. TS Vũ Ngọc Bội 2. PGS.TS Lại Văn Hùng Nha Trang - 4/2012 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự cho phép của cơ quan chủ quản - Trường Đại học Nha Trang. Các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả 1 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ niềm tự hào vì đã được học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Nha Trang, một trong những trường đầu ngành về nuôi trồng và chế biến thủy sản. Xin được gửi lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Vũ Ngọc Bội và PGS.TS Lại Văn Hùng, những người thầy kính mến đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm đã giảng dạy và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện CNSH&MT, Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian đi học. Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Duy, Th.S Ngô Văn Mạnh, các bạn bè, đồng nghiệp và các bạn sinh viên đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn đến gia đình thương yêu đã chia sẻ, động viên tôi hoàn thành khóa học và luận văn này! 2 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6 DANH MỤC BẢNG 7 DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ 8 MỞ ĐẦU 9 Chương 1. TỔNG QUAN 12 1.1. Giới thiệu về probiotic 12 1.2. Phân loại vi sinh vật probiotic 12 1.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi 14 I.4. Cơ chế tác động của probiotic 16 I.4.1. Cạnh tranh vị trí bám dính và loại trừ vi khuẩn gây bệnh 16 I.4.2. Sản sinh ra các chất ức chế 17 I.4.3. Kích thích hệ miễn dịch 20 I.4.4. Ức chế cơ chế dò tìm mật độ tới hạn của vi khuẩn gây bệnh 21 1.4.5. Khả năng kháng virus 23 1.5. Ứng dụng của probiotic 23 1.5.1. Ứng dụng trong y học và chăn nuôi 23 1.5.2. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 24 1.6. Lactobacillus - vi khuẩn probiotic điển hình 25 1.7. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus làm probiotic 28 1.7.1. Trong y học và chăn nuôi 28 1.7.2. Trong nuôi trồng thủy sản 29 I.8. Sản xuất chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản 32 I.8.1. Phân lập và tuyển chọn giống vi khuẩn probiotic 32 1.8.2. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic 35 I.9. Cá Chim vây vàng 36 I.9.1. Giới thiệu về cá Chim vây vàng 36 I.9.2. Tình hình bệnh dịch trong nuôi cá biển 37 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 3 2.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 40 2.1.1. Mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus 40 2.1.2. Vi sinh vật chỉ thị 40 2.1.3. Cá Chim vây vàng 40 2.1.4. Muôi trường nuôi cấy vi sinh vật 40 2.1.5. Các thiết bị chuyên dụng 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1. Phân lập Lactobacillus 42 2.2.2. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio 42 2.2.3. Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa 43 2.2.3.1. Quan sát đặc điểm hình thái 43 2.2.3.2. Xác định đặc tính sinh hóa 43 2.2.4. Xác định khả năng sinh trưởng 43 2.2.5. Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp 43 2.2.6. Xác định các đặc tính probiotic 44 2.2.6.1. Xác định khả năng sinh enzym ngoại bào 44 2.2.6.2. Xác định khả năng sinh acid 44 2.2.6.3. Xác định khả năng sinh các chất kháng khuẩn 44 2.2.6.4. Xác định khả năng chịu mặn 45 2.2.6.5. Xác định khả năng chịu muối mật 45 2.2.7. Xác định chất phụ gia thích hợp cho quá trình đông khô 45 2.2.8. Bố trí thí nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng 45 2.2.9. Xác định khả năng tăng trưởng và chuyển hóa thức ăn ở cá 46 2.2.10. Xác định thành phần vi sinh đường ruột cá 47 2.2.11. Xử lý thống kê 47 2.3. Cách tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1. Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus 49 3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá Chim vây vàng 49 3.1.2.Tuyển chọn chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio 49 3.1.3. Tuyển chọn chủng Lactobacillus sinh enzym ngoại bào 51 4 3.2. Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng 52 3.2.1. Đặc điểm hình thái 52 3.2.2. Đặc tính sinh hóa 53 3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng 55 3.3.1. Đường cong sinh trưởng 55 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 56 3.3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường 58 3.3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 60 3.4. Một số đặc tính khác của các chủng probiotic 62 3.4.1. Khả năng sinh acid 62 3.4.2. Khả năng sinh bacteriocin 63 3.4.3. Khả năng chịu mặn 63 3.4.4. Khả năng chịu muối mật 65 3.5. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic ở dạng đông khô 67 3.5.1. Nghiên cứu lựa chọn chất chống đông 67 3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản 69 3.6. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô 70 3.7. Thử nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống 71 3.7.1. Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến tăng trưởng và chuyển hoá thức ăn của cá 71 3.7.1.1. Chiều dài 71 3.7.1.2. Khối lượng và tốc độ sinh trưởng đặc trưng (SGR) 73 3.7.1.3. Hệ số phân đàn về chiều dài (CVL) 73 3.7.1.4. Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) 74 3.7.3. Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến hệ vi sinh đường ruột cá 76 3.7.3.1. Tổng số Lactobacillus spp. 76 3.7.3.2. Tổng số Vibrio spp. 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHẦN PHỤ LỤC 89 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chữ viết tắt OD Optical Density (Mật độ quang) CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) APW Alkaline Peptone Water MRS de Man, Rogosa and Sharpe TCBS Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose MPN Most Probable Number FAO Food and Agriculture Oganization of the United Nation LAB Lactic acid bacteria FCR Hệ số chuyển hóa thức ăn SGR Tốc độ tăng trưởng đặc trưng CVL Hệ số phân đàn theo chiều dài 6 DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Mô tả trạng thái Eubiosis và Dysbiosis 16 2 Bảng 2.1. Bố trí các nghiệm thức trong thí nghiệm 46 3 Bảng 3.1. Khả năng kháng Vibrio của các chủng Lactobacillus 50 4 Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym protease và amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn Lactobacillus 52 5 Bảng 3.3. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của các chủng L1.2, L1.3 và L1.8 53 6 Bảng 3.4. Đặc tính sinh hóa của các chủng L1.2, L1.3 và L1.8 54 7 Bảng 3.5. Mật độ tế bào (OD620) theo thời gian nuôi cấy 55 8 Bảng 3.6. Khả năng sinh acid của chủng L1.2 và L1.3. 62 9 Bảng 3.7. Khả năng sinh bacteriocin của chủng L1.2 và L1.3 63 10 Bảng 3.8. Quy trình đông khô chế phẩm probiotic 68 11 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chất chống đông đến tỷ lệ sống của chủng L1.2 và L1.3 68 12 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ sống của chủng L1.2 và L1.3 69 13 Bảng 3.11. Chiều dài toàn thân, khối lượng, tốc độ sinh trưởng đặc trưng (SGR) và hệ số phân đàn về chiều dài (CVL) của cá 71 14 Bảng 3.12. Thành phần của hệ vi sinh đường ruột cá Chim vây vàng trước và sau khi sử dụng chế phẩm probiotic 75 7 DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Tên đồ thị, hình vẽ Trang Hình 1.1. Sơ đồ tuyển chọn chủng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản 34 Hình 1.2. Sơ đồ quy trình sản suất chế phẩm probiotic dạng bột 35 Hình 2.1. Sơ đồ tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 48 Hình 3.1. Khả năng kháng Vibrio của một số chủng Lactobacillus 49 Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2, L1.3 và L1.8 55 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của 56 chủng L1.2 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của 57 chủng L1.3 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của 57 chủng L1.8 Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.2 58 Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.3 Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.8 Hình 3.9. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của chủng L1.2 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh của chủng L1.3 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ muối (%) đến sinh trưởng của chủng L1.2 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ muối (%) đến sinh trưởng của chủng L1.3 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ muối mật (%) đến sinh trưởng của chủng L1.2 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ muối mật (%) đến sinh trưởng của chủng L1.3 Hình 3.15. Ảnh hưởng của chất chống đông đến tỷ lệ sống của chủng L1.2 và L1.3 Hình 3.16. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm probiotic Hình 3.17. Chiều dài trung bình của cá 59 59 61 61 64 Hình 3.18. Khối lượng trung bình của cá Hình 3.19. Hệ số phân đàn về chiều dài (CVL) của cá Hình 3.20. Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) của cá Hình 3.21. Mật độ của Lactobacillus spp. tổng số trong đường ruột cá Hình 3.22. Mật độ của Vibrio spp. tổng số trong đường ruột cá 73 74 75 77 64 66 66 69 70 71 78 8 MỞ ĐẦU I. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, nuôi trồng thuỷ sản trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Đây là ngành có tốc độ tăng trưởng nhanh, trung bình hàng năm (từ năm 1970) là 8,9% so với tốc độ tăng trưởng 1,2% của đánh bắt và 2,8% của nuôi động vật trên cạn trong cùng thời điểm. Tổng sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của toàn thế giới đạt 55,1 triệu tấn năm 2009 với giá trị khoảng 98,4 tỷ USD trong đó nuôi trồng thuỷ sản nước mặn đạt 20,1 triệu tấn và giá trị 30 tỷ USD. Sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của các nước châu Á đạt trên 40 triệu tấn tương đương với 80% sản lượng toàn cầu trong năm 2009, tiếp theo là Châu Âu (6%) và Mỹ (5%) (FAO, 2010) [34]. Để đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản, các cơ sở sản xuất với quy mô lớn ra đời, đã đặt các loài thuỷ sản phải tiếp xúc với những điều kiện bất lợi, chủ yếu là liên quan đến bệnh và các vấn đề về suy thoái môi trường thường xuyên xảy ra, dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế. Vi khuẩn và virus gây bệnh là các tác nhân gây bệnh chủ yếu trên động vật thuỷ sản. Để phòng chống, điều trị và kiểm soát bệnh trên động vật thuỷ sản do các tác nhân này gây ra đã dẫn tới việc tăng đáng kể việc sử dụng thuốc thú y (hoá chất, thuốc kháng sinh và vacxin). Trong đó thuốc kháng sinh được sử dụng phổ biến với số lượng rất lớn [6], [23]. Mỹ là nước sản xuất thuốc kháng sinh lớn nhất thế giới, khoảng 18.000 tấn mỗi năm với mục đích sử dụng cho y tế và nông nghiệp, trong đó 12.600 tấn (gần 70%) được sử dụng không phải để chữa bệnh mà dùng để thúc đẩy tăng trưởng (SCAN, 2003). Liên minh Châu Âu và Thụy Sĩ sản xuất 1600 tấn kháng sinh, trong đó khoảng 30% được sử dụng cho vật nuôi, với mục đích tương tự để tăng trưởng (SCAN, 2003). Như vậy, việc sử dụng kháng sinh lâu dài như một biện pháp phòng ngừa và yếu tố thúc đẩy tăng trưởng đã gây nên hiện tượng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh (tạo ra gen kháng kháng sinh). Nhiều nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn gây bệnh đã tăng lên theo từng năm. Đặc biệt, một số loài vi khuẩn gây bệnh có thể truyền gen kháng kháng sinh sang các loài vi khuẩn gây bệnh cho người. Tính chất nguy hiểm của tình trạng kháng thuốc ngày càng được ý thức hơn khi người ta thấy rằng những vi khuẩn kháng thuốc đã gây ra các bệnh 9 chết người còn lớn hơn cả bệnh AIDS. Ở Mỹ hơn 100 ngàn ca bệnh gây ra bởi Staphylococcus aureus kháng lại methicillin đã làm 18.600 người chết, trong khi cũng trong năm đó số người bị chết do HIV/AID chỉ là 17.000 (Tạp chí y khoa Mỹ 10, 2007). Để hạn chế hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, toàn bộ các nước trong Cộng đồng Châu Âu đã cấm sử dụng kháng sinh với vai trò là chất kích thích tăng trưởng từ ngày 1 tháng 1 năm 2006 [16]. Probiotic (các vi khuẩn có lợi) được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản, mà mầm bệnh được kiểm soát thông qua một loạt các cơ chế khác nhau như: cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh, sản sinh một số hợp chất kháng khuẩn như acid hữu cơ, hydro peroxide, bacteriocin; tăng cường hệ miễn dịch ngày càng được xem như là một thay thế cho thuốc kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh trên động vật thuỷ sản. Ngoài ra, probiotic còn có khả năng tổng hợp một số loại vitamin nhóm B, tổng hợp hệ enzym tiêu hoá tăng cường chuyển hoá thức ăn, do đó probiotic được coi là một nhân tố thúc đẩy tăng trưởng. Những nghiên cứu về sử dụng probiotic cho con người và động vật trên cạn đã được công bố từ lâu với rất nhiều công trình nghiên cứu có giá trị. Tuy nhiên, trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản mới được áp dụng trong những năm gần đây và đã cho rất nhiều kết quả khả quan [22], [23]. Cá Chim vây vàng là loài cá sống chủ yếu ở giữa và tầng mặt thuộc vùng biển ấm. Cá Chim vây vàng có giá trị kinh tế cao, được nuôi nhiều ở các nước: Đài Loan, Trung Quốc, Singapore, Indonesia… vì rất dễ nuôi, nhanh lớn, ít bị bệnh. Đài Loan là nơi sản xuất giống đầu tiên vào năm 1989, sau đó công nghệ sản xuất giống lan rộng ra nhiều nước như Trung Quốc, Indonesia và Việt Nam. Từ năm 2006 Trường Cao đẳng Thủy sản Bắc Ninh đã thực hiện thành công dự án “Nhập công nghệ sản xuất giống cá Chim vây vàng” đã chủ động được nguồn con giống, mở ra một triển vọng mới cho nghề nuôi cá biển. Từ năm 2008, trường Đại học Nha Trang cũng đã sản xuất thành công giống cá Chim vây vàng, đã cung cấp hàng trăm nghìn con giống cho khu vực Nam Trung Bộ. Cá Chim vây vàng là một trong ba đối tượng đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa vào chương trình hành động “Phát triển nghề nuôi biển đảo năm 2010”. Tuy nhiên, cùng với sự tăng trưởng nhanh của nghề nuôi biển đã dẫn tới ô nhiễm môi trường nước biển và phát tán bệnh tật. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy đã có các sự cố về bệnh tật xảy ra tại các lồng nuôi. Bệnh do vi khuẩn, virus và ký sinh trùng có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn của quá trình nuôi, đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn gây ra như bệnh xuất huyết trên da [09], [20]. 10 Từ những phân tích ở trên, việc “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng” là cần thiết và là một hướng đi mới trong việc ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản. II. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn probiotic thuộc giống Lactobacillus trên cá Chim vây vàng 2. Thử nghiệm in vitro khả năng kháng khuẩn (Vibrio), khả năng sinh enzym ngoại bào (protease, amylase), acid và các hợp chất kháng khuẩn, khả năng chịu mặn, khả năng chịu muối mật. 3. Sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô (lựa chọn chất chống đông phù hợp, xác định thời gian bảo quản). 4. Thử nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống nuôi tại Nha Trang, Khánh Hoà. 5. Xác định khả năng phát triển và khả năng kháng Vibrio spp. của các chủng vi khuẩn probiotic bổ sung trong đường ruột cá Chim vây vàng. III. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1. Làm giàu bộ sưu tập chủng vi sinh vật probiotic biển. 2. Xây dựng được quy trình phân lập, tuyển chọn và sản xuất chế phẩm probiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống. 3. Đánh giá được hiệu quả của việc bổ sung chế phẩm probiotic (tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và khả năng kháng Vibrio) trên cá Chim vây vàng khi được nuôi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm probiotic. 11 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về probiotic Probiotic là một từ gốc tiếng Hy Lạp có nghĩa là "for life". Nó được dùng để mô tả các vi khuẩn "thân thiện" thường sống ở đường ruột và có đóng góp vào sức khỏe tốt của vật chủ. Thuật ngữ “Probiotic" được định nghĩa đầu tiên bởi Lilly và Stillwell (1965): “Probiotic là nhân tố thúc đẩy tăng trưởng được sản xuất bởi các vi sinh vật". Vượt qua thời gian cùng với sự hiểu biết lớn hơn về probiotic, nhiều định nghĩa mới ra đời, một trong những định nghĩa được đa số các nhà khoa học nhất trí “Probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ” (FAO/WHO, 2001) [36]. Những nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong khoảng hơn 2 thập kỷ gần đây nhưng tác dụng của nó thì đã được nhận thấy từ lâu. Eli Metchnikoff (1845-1919) là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic. Năm 1908, Eli Metchnikoff đã chứng tỏ rằng việc tăng tuổi thọ của một bộ phận nông dân Bungari là do sự tiêu thụ sữa lên men sữa chua với một chủng Lactobacillus nhất định. Ông tin rằng Lactobacillus spp có một ảnh hưởng quan trọng đến sức khỏe đường ruột, đặc biệt là nó ức chế các vi sinh vật không mong muốn trong ruột già và ruột non, và do đó giúp ổn định hệ thống tiêu hóa [22], [28]. Ngày nay probiotic được sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả trong việc phòng và trị bệnh cho con người. Một số chủng được sử dụng phổ biến cho con người thuộc các giống Lactobaciluss spp. và Bifidobacterium spp. Ngoài việc sản xuất các sản phẩm dược phẩm, probiotic còn được bổ sung vào rất nhiều các sản phẩm thực phẩm như: sữa, đồ uống, bánh kẹo... Các yếu tố quan trọng quyết định đến việc sử dụng hiệu quả probiotic trong dược phẩm cũng như thực phẩm là việc duy trì khả năng tồn tại và hoạt động của các chủng vi sinh vật có để tồn tại trong thực phẩm trong suốt thời gian bảo quản của thực phẩm, trong quá trình vận chuyển trong đường ruột với điều kiện axít và các enzym tiêu hóa ở dạ dày và muối mật trong ruột non [31], [76]. 1.2. Phân loại vi sinh vật probiotic Vi sinh vật có hoạt tính probiotic bao gồm các nhóm sau [28]: 12 - Nhóm vi khuẩn lactic (LAB): gồm các chủng thuộc giống Lactobacilus và Bifidobacterium. Đây là các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình, kỵ khí hoặc vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên, rất thân thuộc với con người và động vật. Vi khuẩn này có nhiều trong các sản phẩm muối chua, trong đường ruột của các người và động vật. Trong quá trình trao đổi chất vi khuẩn lactic có khả năng chuyển hoá đường thành acid lactic. Ngoài ra nó còn có khả năng sản sinh bacteriocin - một loại hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn với phổ ức chế các vi khuẩn khác rất rộng. Loại chất kháng khuẩn này khác với thuốc kháng sinh vì nó không gây ra đặc tính tính kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh. Cả acid lactic và bacteriocin đều có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh nhờ đó dẫn đến việc giải độc đường ruột và tăng khả năng tiêu hoá thức ăn. - Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: các chủng có hoạt tính amilase và protease (đặc biệt là protease kiềm). Đây là các chủng vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis…), các chủng này hiếu khí hoặc tuỳ tiện, không gây bệnh, gây độc đối với người và vật nuôi. Nhóm vi khuẩn này có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ bị ô nhiễm trong môi trường nước nuôi. Các vi khuẩn này còn đóng vai trò tăng cường khả năng tiêu hoá thức ăn trong đường ruột. Ngoài khả năng sinh các loại enzym phân giải ở trên, vi khuẩn thuộc nhóm này cũng có khả năng sinh bacteriosin: B. subtilis có khả năng sinh subtiline, inturine, B. licheniformis có khả năng sinh bacitraxin. Các chất này đều có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt là bacidraxin được sử dụng nhiều trong chăn nuôi để nâng cao tốc độ tăng trưởng và hiệu suất sử dụng thức ăn [30]. - Nhóm vi khuẩn quang tự dưỡng: gồm 5 giống Chlorobi, Cyanobacteria, Chloroflexi (filamentous anoxygenic phototrophs), Firmicutes (heliobacteria) and Proteobacteria (vi khuẩn tía có lưu huỳnh và không có lưu huỳnh. Chúng có khả năng đồng hoá H2S và CO2 để xây dựng tế bào và không sinh O2. Các vi khuẩn này kỵ khí bắt buộc và cần ánh sáng trong quá trình đồng hoá. Chúng có khả năng khử màu, khử mùi do các hợp chất chứa lưu huỳnh sinh ra. Ngoài ra chúng còn có khả năng chuyển hoá NO2- thành NO3-, Fe2+ thành Fe3+. Nhóm vi khuẩn này có khả năng cải thiện chất lượng nước, cân bằng độ pH, loại trừ nhanh chóng N-NH3, H2S, acid hữu cơ đồng thời tăng cường tốc độ tăng trưởng và khả năng phòng chống dịch bệnh. - Nhóm nấm men gồm một số loài Saccharomyces. Scholz (1999) đã cho thấy các loại men S.cerevisiae và Phaffia rhodozyma giúp nâng cao sức đề kháng chống vibriosis, cải thiện tỉ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng, tăng khả năng đáp 13 ứng miễn dịch ở động vật. Màng tế bào nấm men là một nguồn giàu các chất glucans và mannans giúp kích thích hệ miễn dịch do chứa nhiều nucleotides, vitamin và vi khoáng là những chất bổ dưỡng cơ bản giúp nâng cao chức năng của hệ miễn dịch [55], [60]. 1.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh. Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). Theo thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng. Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500. Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau (khoảng 10 1-103; 101-10 4; 105-108 và 109-10 12 CFU/ml chất chứa tương ứng) [68]. Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính [70]: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật. Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh. Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật ruột. Để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột được chia thành 3 14 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và 0,01% tương ứng. Trạng thái mà các nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ). Ở trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa. Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần thức ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật. Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý... đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột. Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch mật, các enzym, chất đệm và chất nhầy...) cũng như kiểu và tần số nhu động ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu và tần số nhu động ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển...). Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”). Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử... (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong Bảng 1). Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi một cách không có kiểm soát đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Hiện nay, khối liên minh châu Âu (EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để bổ sung vào thức ăn như chất kích thích sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006. Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thức lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm và nuôi 15 trồng thủy sản. Để vượt qua những thách thức đó, đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh nhưng an toàn với vật nuôi. Một trong những hướng đi mới, hiệu quả là sử dụng chế phẩm probiotic [21], [69]. Bảng 1.1. Mô tả trạng thái Eubiosis và Dysbiosis Trạng thái Eubiosis Trạng thái Dysbiosis - Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và - Sự không cùng tồn tại giữa vật hệ vi sinh vật đường ruột – Sự cộng chủ và hệ vi sinh vật đường ruột. sinh - Sự phá hủy biểu mô đường - Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu ruột, làm cho thành đường ruột mỏng hóa chống lại các vi sinh vật xâm đi dẫn đến giảm sự hấp thụ các chất nhiễm. dinh dưỡng. - Kích thích hệ miễn dịch của vật - Sinh ra các cơ chất gây độc (NH3, chất độc…) - Tiêu hóa các chất dinh dưỡng. - Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH4, H2S, CO2). chủ. - Tổng hợp protein. - Tổng hợp các vitamin - Làm yếu hệ thống miễn dịch I.4. Cơ chế tác động của probiotic Việc tăng cường khả năng chống xâm nhập cùng với tác dụng ức chế trực tiếp đối với các vi khuẩn gây bệnh là hai nhân tố quan trọng giúp cho probiotic làm giảm sự ảnh hưởng cũng như thời gian nhiễm bệnh của các vi khuẩn gây bệnh. Các chủng probiotic thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trong cả các thử nghiệm in vitro và in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong hơn một thập kỷ qua nhưng do những giới hạn về phương pháp và giới hạn về đạo đức của việc nghiên cứu trên động vật là những khó khăn trong việc tìm hiểu cơ chế tác động của probiotic, hoặc chỉ có thể tìm hiểu và giải thích được từng phần. Mặc dù vậy thông qua những lợi ích của việc sử dụng và điều trị bằng probiotic, cơ chế hoạt động của vi khuẩn probiotic bao gồm: I.4.1. Cạnh tranh vị trí bám dính và loại trừ vi khuẩn gây bệnh Khả năng bám dính của các tế bào probiotic trong chất nhầy ruột và các tế bào biểu mô từ lâu đã được xem là một trong những tiêu chí lựa chọn quan trọng nhất. 16 Khả năng bám dính vào niêm mạc ruột có thể giúp cho các tế bào probiotic không bị rửa trôi khỏi đường ruột và nhờ đó chúng mới có khả năng cố định và phát triển trong đường ruột. Từ đó, chúng mới có khả năng tác động đến hệ miễn dịch và cạnh tranh loại trừ các mầm bệnh. Khả năng bám dính của các chủng probiotic phục thuộc vào nhiều yếu tố như bản thân vi khuẩn probiotic, pH của đường ruột, các enzym tiêu hóa trong đường ruột, sự có mặt của muối mật. Ngoài ra độ tuổi của vật chủ và trạng thái sinh lý cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng bám dính. Những cơ thể vật chủ non và thể trạng khỏe mạnh thì khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic cũng tốt hơn. Khả năng bám dính được tạo nên nhờ một số nhân tố chủ yếu: protein thành tế bào, carbohydrate và acid lipoteichoic [49]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic được coi như là cơ chế họat động probiotic. Một số phương pháp khác nhau có được sử dụng để đánh giá khả năng bám dính của các chế phẩm sinh học. Phổ biến nhất là đánh giá khả năng kết dính với tế bào niêm mạc ruột và chất nhầy ruột [18]. Vi khuẩn probiotic còn có khả năng kết hợp với vi khuẩn gây bệnh theo kiểu đồng keo tụ, chúng kết dính với nhau tạo thành chùm và từ đó có khả năng loại bỏ các vi khuẩn gây bệnh nếu nồng độ các vi khuẩn probiotic đủ lớn. Đây là cơ sở quan trọng giúp ta có thể đánh giá sơ bộ một chủng probiotic có khả năng phù hợp hay không [61]. Cạnh tranh vị trí bám dính trên đường ruột là một tiêu chí quan trọng để dánh giá hiệu quả của vi sinh vật probiotic. Vi khuẩn probiotic cạnh tranh vị trí bám dính trên thành ruột hay trên các biểu mô khác có vai trò ngăn cản sự khu trú và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Người ta đã chứng minh khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt ruột của Lactobacillus GG và Lactobacillus plantarum 299V để ngăn cản sự phát triển và lây lan của vi khuẩn Escherichia coli 0157H7 gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật nuôi. Ngoài ra một số vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus cũng được biết có thể khóa chặt các thụ thể bề mặt trong đường ruột để hạn chế được sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh khác [70]. I.4.2. Sản sinh ra các chất ức chế Mặc dù tác dụng có lợi cho sức khỏe của sữa lên men chỉ được phát hiện vào đầu thế kỷ 20 qua những nghiên cứu của Metchnikoff. Nhưng sữa và rau quả lên men đã được sử dụng từ nhiều thế kỷ trước. Ngày nay vi khuẩn lactic (LAB), 17 vi khuẩn propionic, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp với vai trò là giống khởi động, đồng khởi động hoặc bảo vệ sinh học để kéo dài thời gian bảo quản của rất nhiều sản phẩm thực phẩm như sữa, rau quả, thịt... Cơ sở khoa học của quá trình bảo quản này là quá trình lên men lactic, propionic. Nhờ các quá trình này sẽ tạo ra được một môi trường ph thấp và nhiều các chất kháng khuẩn được tạo ra. Các vi khuẩn probiotic (LAB, Bifidobacterium) có khả năng sản sinh hàng loạt các chất ức chế: acid hữu cơ, H2O2, CO2, bacteriocin, các hợp chất kháng khuẩn phân tử lượng thấp, và một số các hợp chất khác. Các chất này được sinh ra bên trong đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác [49], [72]. - Acid hữu cơ Acid hữu cơ được tạo nên bởi hầu hết các vi khuẩn lactic thông qua quá trình lên men đường hexose. Các acid hữu cơ được hình thành phụ thuộc vào các chủng giống vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình có khả năng sử dụng đường theo con đường đường phân để tạo ra hai phân tử acid lactic từ một phân tử glucose. Các chủng vi khuẩn lactic lên men dị hình có khả năng tạo ra acid lactic, ethanol, acid acetic, propionic, CO2. Các acid hữu cơ khác như acetic, propionic có các giá trị Pka thấp hơn, có khả năng ức chế cao hơn acid latic và có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Thêm vào đó dưới tác dụng của pH thấp do các acid không phân ly làm giảm gradien H+ cũng là nguyên nhân gây ức chế vi khuẩn và cuối cùng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn. Hơn thế nữa acid lactic đã cho thấy khả năng dễ dàng thấm qua màng tế bào của vi khuẩn Gram – qua lớp phospholipid dẫn đến acid lactic có những tính chất như những chất kháng khuẩn khác [49]. - H2O2 Khi có mặt của FAD oxydase và O2, vi khuẩn có khả năng sản sinh ra H2O2. Khả năng kháng khuẩn của H2O2 nhờ vào khả năng oxy hóa mạnh thành tế bào vi khuẩn của H2O2. Trong điều kiện tự nhiên, khả năng này được tăng cường nhờ sự có mặt của hệ enzym lactoperoxidase sẽ tạo nên hypothiocyanate (OSCN ) hoặc oxyacid cao hơn (O2SCN- và O3SCN-). Tác động của những oxyacid này sẽ phá hủy các enzyms trao đổi chất của vi khuẩn chẳng hạn như glyceraldehyte 3-phosphate dehydrogenase hoặc phá hủy thành tế bào vi khuẩn. 18 - CO2 CO2 là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic không đồng hình. CO2 có thể tạo ra môi trường yếm khí, nhờ đó có khả năng gây ức chế đối với các vi khuẩn hiếu khí thông qua việc tác động lên thành tế bào vi khuẩn. Khả năng ức khuẩn của CO2 có được nhờ vào khả năng ức chế các enzym decarboxylase và khả năng tích lũy CO2 trong lớp phospholipid và làm rối loạn tính thấm của màng tế bào. CO2 có khả năng ức chế nhiều vi khuẩn đặc biệt là các vi khuẩn Gram -. Tác dụng ức khuẩn của CO2 đã được ứng dụng trong thương mại cho nhiều sản phẩm đông lạnh bằng việc bao gói sản phẩm trong môi trường CO2 [49] -Bacteriocin Bacteriocin là những hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các protein được tổng hợp bằng nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế khả năng phát triển của nhiều loại vi khuẩn khác. Chúng thuộc nhóm protein đồng thể, có phổ tác dụng, cơ chế, khối lượng phân tử, nguồn gốc di truyền, và tính chất sinh hóa khác nhau. Trong nhiều tài liệu thì bacteriocin thường bị nhầm lẫn với kháng sinh, nhưng chúng khác kháng sinh ở một số điểm: được tổng hợp ở ribosom, tế bào chủ miễn dịch với chúng do có khả năng tạo các protein miễn dịch, cơ chế tác dụng của bacteriocin và kháng sinh khác nhau và phổ diệt khuẩn của bacteriocin hẹp hơn. Thông thường bacteriocin được sản xuất bởi các vi khuẩn Gram (-) có phổ tác dụng rộng hơn so với bacteriocin được tạo ra từ vi khuẩn Gram (+). Bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn Gram (+), chủ yếu là vi khuẩn LAB có khả năng ức chế các chủng tương tự nó hoặc những loài gần nó (168). Bacteriocin sản xuất bởi LAB được chia thành 4 loại chính: (I) Lantibiotics, (II) Bacteriocin bền nhiệt mạch ngắn (<10kDa), (III) Bacteriocin không bền nhiệt mạch dài (>30Kda). (IV) Bacteriocin phức tạp có chứa lipid và carbohydrat. Nhưng những thông tin liên quan đến việc phân loại vày bị giới hạn và phục vụ chủ yếu cho việc tinh sạch bacteriocin [49], [65]. Bacteriocin từ LAB được sử dụng như những chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm và ứng dụng trong probiotic. Với những mục đích này thì ưu điểm của bacteriocin là có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, ức chết nhiều vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên nhiều bacteriocin từ LAB có phổ kháng khuẩn hẹp và hầu hết không có tác dụng đối với vi khuẩn Gram -. Do vậy việc kết hợp bacteriocin với các cơ chế bảo quản khác sẽ làm tăng khả năng khả năng ức chế các vi khuẩn Gram -. Đối với ứng dụng probiotic bacteriocin phải có hoạt tính trong đường 19