Tài liệu Nghiên cứu sản xuất chế phẩm npv trên tế bào sống đề phòng trừ sâu khoan

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆT NAM -----------------*----------------NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NPV TRÊN TẾ BÀO SỐNG ĐỂ PHÒNG TRỪ SÂU KHOANG Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.62.01.12 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học PGS.TS Lê Văn Trịnh HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn nhiệt tình, sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị nơi tôi công tác cũng như Ban lãnh đạo của Viện Bảo vệ thực vật, Trung tâm Đấu tranh Sinh học và Ban Đào tạo sau đại học . Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Lê Văn Trịnh – Giám đốc Trung tâm đấu tranh Sinh học, Viện Bảo vệ thực vật, một người thầy đáng kính trong công việc cũng như trong cuộc sống, đã trực tiếp hướng dẫn và định hướng chuyên môn. Đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình công tác và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Để thực hiện được nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ từ đề tài cấp Nhà nước: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-spl (Nucleo Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp”. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, các chị trong nhóm đề tài đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cao học này là công trình nghiên cứu của riêng cá nhân tôi. Các tài liệu, số liệu được nêu trong luận văn là trung thực. Các luận điểm và các kết quả nghiên cứu chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cảm ơn ------------------------------------------------------------------------------ I Lời cam đoan -------------------------------------------------------------------------- II Mục lục--- ---------------------------------------------------------------------------- III Danh mục bảng -------------------------------------------------------------------- VII Danh mục hình----------------------------------------------------------------------- IX MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------- 1 1.Tính cấp thiết của đề tài ---------------------------------------------------------- 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ------------------------------------------------- 2 3. Yêu cầu cần đạt ------------------------------------------------------------------- 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài -------------------------------------- 3 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ---------------------------------------------- 3 5.1. Đối tượng nghiên cứu -------------------------------------------------------- 3 5.2. Phạm vi nghiên cứu ---------------------------------------------------------- 3 CHƯƠNG I: CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU --------- 4 1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu ---------------------------------------- 4 1.2. Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài -------------------------------------------- 5 1.2.1. Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura) hại cây trồng ------------- 5 1.2.2. Đặc điểm của vi rút NPV ------------------------------------------------- 6 1.2.3. Cơ chế gây bệnh của vi rút côn trùng ---------------------------------- 10 1.2.4. Tiềm năng sử dụng vi rút NPV trong phòng trừ sâu hại ------------- 12 1.2.5. Nghiên cứu phân lập, làm thuần thực liệu vi rút NPV sâu khoang - 13 1.2.6. Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào nuôi nhân ---------------- 14 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 1.2.7. Kỹ thuật tạo dạng chế phẩm NPV sâu khoang ------------------------ 15 1.2.8. Kỹ thuật sử dụng chế phẩm NPV sâu khoang ------------------------- 18 1.3. Kết quả nghiên cứu ở trong nước------------------------------------------- 19 1.3.1. Nghiên cứu về NPV ở Việt Nam ----------------------------------------- 19 1.3.2. Nghiên cứu phân lập, chọn lọc vi rút NPV có hoạt lực cao trong phòng trừ sâu khoang ---------------------------------------------------- 21 1.3.3. Nghiên cứu tạo dạng và sử dụng chế phẩm NPV để phòng trừ sâu hại cây trồng --------------------------------------------------------------- 21 1.3.4. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV để phòng trừ sâu hại ---------- 23 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ----------------------------------------------------------- 27 2.1. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu --------------------------------------------- 27 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ------------------------------------------------------- 27 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu --------------------------------------------- 28 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ------------------------------------------ 28 2.3. Nội dung nghiên cứu --------------------------------------------------------- 28 2.3.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang ------------------------------- 28 2.3.2. Nghiên cứu tạo dạng chế phẩm vi rút NPV từ nguồn vi rút được sản xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi ---------------------------- 28 2.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV ------ 29 2.4. Phương pháp nghiên cứu ---------------------------------------------------- 29 2.4.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang ------------------------------- 29 2.4.2. Nghiên cứu tạo dạng chế phẩm vi rút NPV từ nguồn vi rút được sản xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi ---------------------------- 34 2.4.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV ------ 35 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.5. Phương pháp xử lý số liệu --------------------------------------------------- 36 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ------------- 37 3.1. Nghiên cứu phân lập tạo thực liệu virút NPV sâu khoang -------------- 37 3.1.1. Thu thập, phân lập sâu khoang nhiễm bệnh ngoài tự nhiên -------- 37 3.1.2. Phân lập và chọn lọc nguồn thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao - 38 3.1.2.1. Hiệu lực của các nguồn thực liệu vi rút NPV thu ngoài đồng-- 38 3.1.2.2. Hiệu lực của các nguồn vi rút NPV qua các lần tuyển chọn --- 39 3.2. Thăm dò tạo dạng bột thấm nước chế phẩm NPV sâu khoang --------- 56 3.2.1. Phân lập thể vùi tinh của vi rút NPV sau lây nhiễm trên tế bào ---- 56 3.2.2. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm NPV dạng bột thấm nước ----------- 60 3.3. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV sau tạo dạng ----- 64 3.3.1. Hiệu lực gây chết sâu khoang trong phòng thí nghiệm -------------- 64 3.3.2. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng ------------------- 67 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ -------------------------------------------------------- 71 1. Kết luận -------------------------------------------------------------------------- 71 2. Đề nghị --------------------------------------------------------------------------- 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO --------------------------------------------------------- 72 1. Tiếng Việt------------------------------------------------------------------------ 72 2. Tiếng Anh------------------------------------------------------------------------ 74 PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH HOẠT ĐỘNG -------------------------- 78 PHỤ LỤC 2: XỬ LÝ SỐ LIỆU --------------------------------------------------- 79 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bảo vệ thực vật CS Cộng sự CT Công thức DMSO Dimethyl Sulfoxide FBS Fetal Bovine Serum GV Vi rút hạt (Granular virus) KTCN Kỹ thuật công nghệ NPV Vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) NPV-Spl Vi rút NPV sâu khoang NSP Ngày sau phun NSN Ngày sau nhiễm OB Thể vùi (Oclusion Body) PBS Phosphate Buffered Saline PIB Thể vùi (Polyhedra Inclusion Body) SDS Sodium Dodecyl Sulphate TL Thực liệu WP Bột thấm nước (Wetable powder) 2WP Bột thấm nước hàm lượng 2 tỷ thể vùi/gam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3. 1. Tỷ lệ sâu khoang nhiễm NPV trên các cây trồng qua các kỳ điều tra (Hà Nội, 2013)------------------------------------------------------- 37 Bảng 3. 2. Hoạt lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi của các nguồn thực liệu vi rút đã thu thập ------------------------------------- 39 Bảng 3. 3. Hoạt lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi sau phân lập lần 1 của các nguồn vi rút NPV đã thu được -------------------- 40 Bảng 3. 4.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1 sau phân lập lần 2 ------------------------------------------------------- 42 Bảng 3. 5.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2 sau phân lập lần 2 ------------------------------------------------------- 43 Bảng 3. 6.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3 sau phân lập lần 2 ------------------------------------------------------- 44 Bảng 3. 7.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1 sau phân lập lần 3 ------------------------------------------------------- 45 Bảng 3. 8. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2 sau phân lập lần 3 ------------------------------------------------------- 46 Bảng 3. 9. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3 sau phân lập lần 3 ------------------------------------------------------- 47 Bảng 3. 10. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1 sau phân lập lần 4 ------------------------------------------------------- 48 Bảng 3. 11. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2 sau phân lập lần 4 ------------------------------------------------------- 49 Bảng 3.12. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3 sau phân lập lần 4 ------------------------------------------------------- 50 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii Bảng 3. 13. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1 sau phân lập lần 5 ------------------------------------------------------- 51 Bảng 3. 14. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2 sau phân lập lần 5------------------------------------------------------ 52 Bảng 3. 15. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3 sau phân lập lần 5------------------------------------------------------ 53 Bảng 3. 16. Các nguồn vi rút NPV sâu khoang tiềm năng đã được chọn lọc sau 5 lần phân lập------------------------------------------------------ 54 Bảng 3. 17. Hiệu lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi của các nguồn vi rút NPV sau tuyển chọn ----------------------------------- 55 Bảng 3. 18. Các chủng NPVSpl sử dụng trong phân tích phả hệ-------------- 59 Bảng 3. 19. Hàm lượng thể vùi của các sản phẩm sau tạo dạng --------------- 60 Bảng 3. 20. Hiệu lực gây chết sâu khoang của các dạng sản phẩm ----------- 60 Bảng 3. 21. Hiệu lực gây chết sâu khoang tuổi 1; 2 và 3 của chế phẩm trong phòng thí nghiệm ------------------------------------------------------ 65 Bảng 3. 22. Hiệu lực gây chết non sâu khoang tuổi 4 và 5 của chế phẩm trong phòng thí nghiệm ----------------------------------------------- 66 Bảng 3. 23. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải của chế phẩm ------ 68 Bảng 3. 24. Hiệu lực của chế phẩm ở các liều lượng phun khác nhau đối với sâu khoang trên đậu tương (Từ Liêm, 2014) ------------------ 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1. Nhộng (A) và Ngài vũ hóa khỏe (B) Nhộng (C) và Ngài vũ hóa bị biến dạng do nhiễm NPV (D) -------------------------------------- 11 Hình 1. 2. Sâu khoang khỏe (A) và sâu khoang chết do nhiễm NPV (B) ---- 12 Hình 2. 1. Các bước để phân lập vi rút NPV sâu hại ---------------------------- 30 Hình 3. 1. Thể vùi NPV phân lập từ sâu khoang bị bệnh ngoài đồng -------- 39 Hình 3. 2. Thể vùi tinh được lưu giữ ---------------------------------------------- 53 Hình 3. 3. Tế bào sâu khoang nhiễm NPV (A); Thể vùi tinh (B) ------------- 57 Hình 3. 4. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV sâu khoang ----------------- 58 Hình 3. 5. Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining.------- 59 Hình 3. 6. Sản phẩm dạng bột thấm nước đóng gói khối lượng 10gam/gói - 63 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Các nhà khoa học đã xác định vi rút lây nhiễm trên sâu khoang là loài vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus- NPV) thuộc họ Baculoviridae và thuộc nhóm vi rút sinh thể vùi, mỗi thể vùi có chứa tới 200 thể vi rút (virion) hình que có vỏ ngoài là protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng vòng xoắn kép. Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kich thước từ 0,15- 15µm. NPV-Spl rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của nó. (Grzywacz, et al. (1996) [23]. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật (2001) [13], vi rút NPV có vai trò quan trọng góp phần điều tiết số lượng quần thể sâu khoang cũng như các loài côn trùng bộ Cánh phấn khác trên đồng ruộng. Kết quả theo dõi đã xác định khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, thì tỷ lệ sâu bị chết do nhiễm NPV từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu tương và từ 0,3- 1,9% trên lạc. Các chế phẩm sinh học sử dụng tác nhân vi rút NPV đều rất chuyên tính và có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Tuy nhiên, các loại vi rút chỉ có thể tồn tại, phát triển được trong các tế bào sống và trong điều kiện môi trường thích hợp. Vì vậy, việc sản xuất chế phẩm vi rút đòi hỏi phải được thực hiện trên cơ thể sâu hoặc trên các mô, tế bào sâu còn sống. Nhưng lâu nay, việc sản xuất NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủ công với quy mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm vi rút NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng. Theo cách này, sản xuất chế phẩm NPV để trừ sâu hại khó có thể thực hiện với quy mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn một loài sâu hại phụcvụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề khó khăn và phải có đủ nhà xưởng, trang thiết bị cần thiết. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 Để khắc phục những hạn chế nói trên, các nước như: Mỹ, Hà Lan, Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v. đã ứng dụng công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV với quy mô công nghiệp. Tại Nga đã có chế phẩm NPV dạng bột thương phẩm với tên là VIRIN Ha, VIRIN Dp để trừ sâu xanh hại thuốc lá, cà chua, sâu róm thông, v.v. Tại Trung Quốc đã nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học đa chức năng V-Bt để trừ sâu hại trên hàng vạn hecta bông, thuốc lá, cà chua, đậu đỗ, v.v. và nhiều sản phẩm vi rút NPV được sản xuất trên cơ sở nuôi nhân tế bào côn trùng đã được thương mại hóa như Keyun HaNPV dạng dịch lỏng để trừ sâu xanh, Keyun PxGV dạng dịch lỏng trừ sâu tơ hại bắp cải, Keyun SeNPV dạng bột thấm nước và dạng dịch thể trừ sâu keo da láng, Keyun Spl-NPV dạng bột thấm nước trừ sâu khoang, v.v. Để góp phần vào việc khai thác, phát triển và sử dụng các tác nhân sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) trên tế bào sống để phòng trừ sâu khoang (Spodoptera litura)” 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu thăm dò sản xuất chế phẩm NPV theo công nghệ nuôi nhân tế bào để phòng trừ sâu khoang hại cây trồng nông nghiệp. 3. Yêu cầu cần đạt - Thu thập, phân lập và tuyển chọn được 1-2 nguồn thực liệu vi rút NPV từ đồng ruộng có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang và có khả năng sinh thể vùi lớn. - Thử nghiệm sản xuất chế phẩm NPV dạng bột thấm nước trên cơ sở lây nhiễm vi rút trên tế bào sâu khoang đã được nhân nuôi sẵn. - Đánh giá được hiệu quả gây chết sâu khoang trong điều kiện trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài + Ý nghĩa khoa học Kết quả thực hiện đề tài sẽ đóng góp tư liệu khoa học về tiềm năng sinh thể vùi và hiệu quả gây chết của vi rút NPV sâu khoang trên đồng ruộng tại các vùng sản xuất nông nghiệp ngoại thành Hà Nội. Đồng thời, bước đầu cung cấp các dẫn liệu khoa học về khả năng lây nhiễm vi rút NPV thu thập ngoài đồng ruộng trên tế bào sâu khoang sau khi được nhân nuôi trên môi trường nhân tạo. + Ý nghĩa thực tiễn Kết quả thu thập, phân lập và tuyển chọn nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực cao sẽ góp phần khai thác nguồn tài nguyên hữu ích trong tự nhiên. Đồng thời, góp phần tạo thực liệu phục vụ sản xuất chế phẩm thử nghiệm sản xuất chế phẩm trên cơ sở lây nhiễm NPV trên tế bào đã được nuôi nhân sẵn. Kết quả đánh giá hiệu quả trừ sâu khoang của chế phẩm NPV có ý nghĩa to lớn trong việc hướng tới xây dựng kỹ thuật sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu khoang. Từ đó, hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn, góp phần cải thiện và nâng cao chất lượng nông sản , bảo tồn các loài sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5.1. Đối tượng nghiên cứu - NPV sâu khoang 5.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu thu thập, chọn lọc chủng NPV có hoạt lực cao gây chết đối với sâu khoang tại Mê Linh, Đông Anh, Từ Liêm. Xác định kỹ thuật tạo dạng cũng như cách sử dụng có hiệu quả của chế phẩm NPV-Spl để phòng trừ sâu khoang hại cây trồng. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 CHƯƠNG I CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu Tác nhân vi rút NPV đều rất chuyên tính và có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Trên đồng ruộng, vi rút NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao, kết quả theo dõi liên tục từ năm 1988 đến 1995 trên đay tại Đan Phượng (Hà Tây cũ) đã xác định tỷ lệ sâu đo xanh chết cao nhất do NPV của các năm biến động từ 31,1% (năm 1995) đến 66,6% (năm 1992) (Nguyễn Văn Cảm và CS, 1996) [2]. Còn trên sâu khoang hại trên cây đậu tương và lạc thường có tỷ lệ chết do vi rút NPV đạt từ 1,2- 12,5%. Theo Pourmirza (2000) [34],vi rút NPV sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng sẽ nhân lên ngay trong nhân hoặc trong nguyên sinh chất của tế bào, phá hủy các mô và làm cho vật chủ chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hóa bị biến dạng), trong giai đoạn trưởng thành thì tuổi thọ giảm và khả năng đẻ trứng kém, gây ảnh hưởng tới số lượng quần thể ở các thế hệ sau. Nguồn vi rút tồn đọng trong tự nhiên tiếp tục chờ cơ hội nhờ quá trình canh tác, làm đất hoặc mưa gió sẽ xâm nhiễm gây hại cho sâu hại ở các thế hệ tiếp theo. Trên đồng ruộng, vi rút NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm và chỉ bị tiêu diệt thể vùi khi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặcbám dính trên thân cây, lá cây hay tàn dư cây trồng ở vị trí bị phơi dưới ánh sáng trực xạ cũng như cực tím (Grzywacz, et al.1996) [23]. Hơn nữa, các loài vi rút gây chết trên côn trùng, sâu hại thường có đặc điểm chuyên cao với ký chủ của chúng. Do vậy, vi rút gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4 triển vọng trong phát triển sản phẩm bảo vệ thực vật, phục vụ đấu tranh sinh học phòng chống sâu hại cây trồng. Như vậy, việc sử dụng chế phẩm vi rút NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinh học sử dụng trong phòng trừ sâu hại, vừa bổ sung nguồn vi rút hữu ích vào đồng ruộng, góp phần bảo vệ, duy trì quần thể các sinh vật có ích, đảm bảo an toàn sức khoẻ người lao động, môi trường và chất lượng sản phẩm khi thu hoạch. 1.2. Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài 1.2.1. Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura) hại cây trồng Là đối tượng sâu hại có tại hầu hết các vùng rau ăn lá trong cả nước, nhất là rau thập tự và rau muống. Sâu khoang có thể sống và gây hại tới 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau. Sâu khoang là đối tượng sâu hại quan trọng trên rau muống, rau thập tự, cà chua, đậu tương, lạc, v.v. Sau khi trứng nở, sâu non tuổi nhỏ thường sống tập trung và gặm nhấm phần thịt lá ở mặt dưới. Khi sâu lớn từ cuối sâu tuổi 2, chúng phân tán và ăn khuyết lá, thậm chí ăn trụi toàn bộ lá cây, nụ, hoa và quả non. Trứng đẻ thành ổ, to như hạt đậu xanh và có lớp lông màu nâu vàng bao phủ bên ngoài. Bên trong chứa nhiều trứng và trứng có hình bán cầu, đường kính từ 0,4- 0,5mm màu trắng vàng, sau chuyển màu vàng tro, đến khi sắp nở trứng có màu tro tối. Sâu non hình ống tròn, khi đẫy sức sâu dài từ 38- 51mm, màu nâu đen hoặc nâu tối. Trên lưng có vạch lưng và vạch phụ lưng màu vàng nhạt. Sâu non tuổi 1 và 2 thường sống tập trung gây hại ở mặt dưới lá, triệu chứng lá bị hại rất dễ nhận biết. Khi sâu lớn từ cuối tuổi 2 trở đi, chúng di chuyển và sống phân tán, ban đêm bò lên cắn phá, ban ngày thì ẩn nấp dưới gốc cây, kẽ lá hoặc nằm dưới lớp tàn dư thực vật. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 Nhộng sâu khoang màu nâu tươi hoặc nâu đậm và bóng, dài 18- 21mm. Trưởng thành có thân dài từ 16- 21mm và sải cánh từ 37- 42mm. Ở 2 cánh trước có màu nâu tối và 2 cánh sau màu trắng trong phản quang màu tím. Trưởng thành ưa thích mùi vị chua ngọt và thường hoạt động vào thời gian từ chiều tối đến nửa đêm. Các nhà khoa học đã xác định thời gian vòng đời sâu khoang khá dài từ 20,0- 60,0 ngày tuỳ theo điều kiện nhiết độ không khí cao hay thấp. Nhìn chung, sâu non sâu khoang phát dục trong thời gian dài, nên khả năng và mức độ gây hại cây trồng của chúng khá lớn. Sâu khoang là đối tượng có tiềm năng sinh sản cao, một trưởng thành cái có thể đẻ từ 491,9 – 668,0 trứng và tỷ lệ trứng nở đạt từ 97,6- 98,9%. Trên rau thập tự, rau muống, khoai sọ, v.v. sâu khoang phát sinh quanh năm và có sự luân chuyển từ cây này sang cây khác. Đặc biệt sâu thường phát sinh thành dịch nặng tại các ruộng rau gần mương nước, ao hồ, đầm. Tuy nhiên, nếu gặp nhiệt độ không khí thấp, mưa xuân ẩm ướt hoặc có mưa lớn vào cuối tháng 10 hàng năm thì sâu khoang bị chết nhiều do sự phát triển xâm nhiễm của vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) và nấm có ích Beauveria. Sau khi phá hại trên rau thập tự, đến mùa đông và xuân, sâu khoang di chuyển sang khoai sọ, khoai lang, rau muống, đậu tương đông để tiếp tục phát triển quần thể và gây hại trên cây trồng. 1.2.2. Đặc điểm của vi rút NPV Lịch sử cổ đại ghi nhận những phát hiện về bệnh tằm dâu và ong khi con người bắt đầu nhân nuôi, thuần dưỡng hai loài côn trùng có ích này.Năm 384-322 Trước Công nguyên Aristotle đã miêu tả bệnh của ong, nhưng người Trung Quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2700 năm Trước Công nguyên.Đến năm 1856, Cornalia và Maestri [19] đã mô tả bệnh tằm nghệ bệnh vi rút. Các tác giả này đã phát hiện thấy các thể đa diện trong cơ thể tằm. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6 Bolle (1898) mô tả sự hoà tan thể đa diện trong ruột tằm và giải phóng các hạt .Năm 1919, Akkva, Komarek và Breidl (1923)đã phát hiện dịch qua lọc có bản chất vi rút và dịch lọc này có khả năng gây bệnh, tạo nên những thể đa diện ở côn trùng).(dẫn theo Phạm Văn Lầm, 1995 [6]) Người đầu tiên nhìn thấy vi rút gây bệnh côn trùng là Bergold [16]trong những công trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử. Vi rút NPV thuộc họ Baculoviridea là một trong 7 thành viên thuộc nhóm vi rút ký sinh côn trùng. Vi rút NPV ở thể hình gậy kích thước 330-80 nm. Baculovirus thuộc họ Baculoviridae chỉ có một chi. Chi này được chia thành các nhóm phụ là vi rút đa diện nhân (NPV), vi rút hạt (GV) và Oryctes giống vi rút (OV). Vi rút NPV có dạng hình gậy, chứa ADN, nucleocapsid, có kích thước 35- 50 x 200 - 320 nm. Các hạt vi rút có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsid. Hơn nữa NPV có một đặc tính là hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào côn trùng với kích thước 0,5 - 15 nm. Vi rút NPV có cấu tạo gồm: vỏ ngoài, vỏ capsid, và lõi axit nucleic. - Vỏ ngoài: là một lớp màng nhầy ngoài cùng có tính chất là protein và gọi là protein ngoài. Protein ngoài mang trính kháng nguyên và có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ. - Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp keo dính. Protein cấu tạo nên vỏ Capsid được gọi là protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên làm tăng khả năng gây bệnh của vi rút. - Genom: Genom của vi rút NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch xoắn kép (ADN ds). Khi nhiễm vào tế bào vật chủ vi rút tuồn lõi ADN vào tế bào vật chủ, ADN của vi rút sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của ADN. Mặt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7 khác khi tế bào bị nhiễm vi rút, ADN của vi rút sinh ra men azenaza ức chế ADN của tế bào chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN (lõi…), vi rút tiến hành lắp ráp để tạo thành thể vi rút mới. Quá trình nhân lên của vi rút NPV và sự hình thành thể đa diện được tiến hành trong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân sau đó vận chuyển vào trong nhân để hình thành các thể đa diện. Số lượng vi rút và thể đa diện ngày một tăng, kêt quả phá vỡ tế bào chủ, giải phóng vi rút tự do và thể đa diện. Vi rút tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt đầu chu trình phá vỡ tế bào tiếp theo. Các tế bào chủ bị phá vỡ, quá trình phát bệnh biểu hiện ra bên ngoài. Vi rút NPV tồn tại ở 2 dạng: + Dạng tự do (NPV hình thành thể vùi đa diện PIB) chứa một nhân capsidtrong một vỏ bọc vi rút. Do đó NPV loại này được gọi là SNPVs (hoặc SEVs)): Dễ bị bất hoạt hơn khi ngâm trong cồn 70 %, vi rút tự do bất hoạt trong vòng 5 phút (nếu ở thể đa diện vi rút bị bất hoạt trong vòng 3 giờ). Trong cơ thể dạng tự do có thể xâm nhập tế bào gây nhiễm ngay. + Dạng thể đa diện (NPV hình thành các thể vùi đa diện chứa nhiều nhân capsid trong một vỏ vi rút gọi là MNPVs (hoặc MEVs) : Theo Rammosca & Hink (1974) [36], thể đa diện còn được gọi là thể bao hàm, thể đa diện chứa khoảng 3-5 % hạt vi rút thành thục còn lại là protein. Vỏ của thể bao hàm là protein loại polyhedrin. Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm. Do đó trong dịch ruột của sâu khoang pH là 9-10 các thể đa diện bị phá vỡ giải phóng các hạt vi rút tự do. Vi rút xâm nhập vào tế bào máu đến tế bào da, tế bào biểu mô khí quản, tế bào mỡ và các cơ quan khác trong cơ thể sâu để gây bệnh. Cuối cùng làm sâu bị chết. Trong môi trường tự nhiên vi rút NPV thường tồn tại ở 2 dạng : Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8 - Dạng tự do dễ gây bệnh, nó xâm nhập vào đường miệng qua thức ăn, qua các vết xây xước trên da sâu non của sâu hại. - Thể đa diện (còn gọi là thể vùi) thường tồn tại trên tàn dư thực vật. Nhờ quá trình canh tác, các thể vùi bám trên lá cây, khi sâu ăn thực vật thì thể vùi đi theo đường miệng vào ruột. Các khối đa diện có đặc điểm dễ bị kiềm hoá, dùng 1/10N NaOH có thể phá vỡ các vỏ đa diện giải phóng các virion. Chính vì vậy, trong ruột côn trùng, dịch ruột mang tính kiềm nên các polyhedra dễ bị phân huỷ để lây nhiễm tiếp vào các nhân của các tế bào khác. Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một sợi đôi ADN dạng vòng. Trọng lượng phân tử của thể đa diện từ 5 – 100 x 106 Da. Tại ruột giữa, do tác động của pH cao giúp phá vỡ vỏ protein và giải phóng ra các thể hoạt động (các virion). Một phần bị thải ra ngoài do tác dụng của protein huỳnh quang đỏ trong dịch tiêu hóa của ruột, phần lớn xâm nhập vào tế bào gây bệnh tại chỗ, sau đó theo máu đến các cơ quan nội tạng khác nhau trong cơ thể lây nhiễm và gây bệnh. Khi tiếp xúc với tế bào, trên lớp vỏ của vi rút có khả năng giúp cho vi rút gắn với thực thể của tế bào để xâm nhập vào bên trong, quá trình tổng hợp protein và ADN của vi rút được tiến hành trong nhân và có thể quan sát được băng phương pháp vạch chất đồng vị. Protein loại polyhedrin được tổng hợp ngoài nhân, sau đó vận chuyển vào trong nhân bao lấy các hạt vi rút thành thục tạo thành thể đa diện. Phân tích trên kính hiển vi điện tử thấy các thể vùi đa diện nhân là những tinh thể lớn, nhiều cạnh, có dạng như hình que, hình vuông, kích thước từ 1- 4μm. Các thể vùi này có cấu tạo bởi các thể protein. Các lát cắt cực mỏng phóng đại trên 60.000 lần cho thấy các khối đa diện chứa nhiều virion hình que. Các virion là thể nucleocapsid trong một lớp vỏ bao và nucleopsid này có dạng hình que. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9 Thể đa diện có thể tồn tại ngoài tế bào vật chủ, tận dụng tính chất này người ta đã sử dụng vi rút NPV để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, tiêu diệt côn trùng có hại. 1.2.3. Cơ chế gây bệnh của vi rút côn trùng Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các vi rút nhân lên ngay trong nhân hoặc trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau. Nguồn vi rút tồn đọng trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ sở khoa học này, vi rút gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp sinh học để phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lai. A B C D Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10