Tài liệu Nghiên cứu rong biển việt nam và xây dựng tổ hợp công nghệ thu nhận các polysacarit (carrageenan fucoidan, alginat canxi)

1 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ (Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga) (2008 - 2010) NGHIÊN CỨU RONG BIỂN VIỆT NAM VÀ XÂY DỰNG TỔ HỢP CÔNG NGHỆ THU NHẬN CÁC POLYSACARIT (CARRAGEENAN, FUCOIDAN, ALGINAT CANXI) Cơ quan chủ trì: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chủ nhiệm Nhiệm vụ: PGS.TS. Bùi Minh Lý Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2010) 8822 Nha Trang 2010 2 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ (Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga) (2008 - 2010) NGHIÊN CỨU RONG BIỂN VIỆT NAM VÀ XÂY DỰNG TỔ HỢP CÔNG NGHỆ THU NHẬN CÁC POLYSACARIT (CARRAGEENAN, FUCOIDAN, ALGINAT CANXI) Cơ quan chủ trì: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chủ nhiệm Nhiệm vụ: PGS.TS. Bùi Minh Lý Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2010) Xác nhận của cơ quan chủ trì Chủ nhiệm Nhiệm vụ PGS.TS. Bùi Minh Lý Nha Trang 2010 3 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ (Theo Nghị định thư Khoa học - Công nghệ với Liên bang Nga) (2008 - 2010) Thông tin chung về Nhiệm vụ: Tên Nhiệm vụ: Nghiên cứu rong biển Việt Nam và xây dựng tổ hợp công nghệ thu nhận các polysacarit (Carrageenan, fucoidan, alginat canxi) Thời gian thực hiện: 24 tháng Từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2010 Họ và tên chủ nhiệm phía Việt Nam: Bùi Minh Lý Học hàm, học vị, chuyên môn: PGS.TS. Hóa học Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính Cơ quan chủ trì Việt Nam: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Họ và tên chủ nhiệm đối tác nước ngoài: Podkorytova A. V. Học hàm, học vị, chuyên môn: GS.TSKH Hóa học Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp, Trưởng phòng Hóa sinh và Công nghệ Chế biến cá, động vật thân mềm và rong biển- Viện Nghiên cứu Thủy sản và Hải Dương học- Bộ Nông nghiệp- L.B.Nga (VNIRO) Địa chỉ: 17 Ul. Krasnoselskaya, Moskva, 107140, Russia Xuất xứ thỏa thuận đã có với đối tác nước ngoài 1. Thời gian ký kết thỏa thuận: 09/2006 2. Cấp ký kết thỏa thuận: - Về phía đối tác Nga do Viện trưởng TSKH Boris N.Kotenev - Về phía đối tác Việt Nam do Viện trưởng PGS.TS. Bùi Minh Lý 3. Các nội dung thỏa thuận chính: - Phát triển tiềm năng và đảm bảo việc sử dụng hợp lý nguồn lợi rong biển Việt Nam; - Xây dựng các công nghệ hiện đại khai thác và sử dụng tối ưu các nguồn lợi đó. - Nghiên cứu hóa sinh rong biển và cấu trúc các polysacarit chiết tách từ chúng. - Xây dựng công nghệ phức hợp chế biến rong biển. - Chế tạo các dịch keo (hydrocolloid) với các tính chất mới, xây dựng tổ hợp sinh- dược học sản xuất các dịch keo rong biển. DANH SÁCH CÁC CÁN BỘ THAM GIA NHIỆM VỤ Stt 1 Họ và tên PGS.TS. Bùi Minh Lý 2 TS. Trần Thị Thanh Vân 3 TS. Nguyễn Duy Nhứt Đơn vị Nội dung công việc Viện NC&ƯDCN NT, Chủ trì nhiệm vụ Viện KH&CNVN Nt Nghiên cứu cấu trúc, công nghệ tách chiết thu nhận caragenan, alginat canxi Nt Nghiên cứu cấu trúc, công 4 4 TS. Nguyễn Đình Thuất 5 TS. Lê Như Hậu 6 ThS. Phạm Đức Thịnh 7 ThS.Võ Mai Như Hiếu 8 ThS. Cao Thị Thúy Hằng 9 KS. Hoàng Ngọc Minh 10 KS. Nguyễn Ngọc Linh 11 ThS. Trần Mai Đức 12 ThS. Đặng Xuân Cường 13 GS.TSKH. Podkorytova A. V. 14 GS.TSKH. Kadnikova I. A. 15 TS. Nemtsev S. V. 16 TS. Vaphina S.V. 17 TS. Blinova E. I. 18 TS. Sorokumova I. M. 19 TS. Ignatova 20 TS. Shulgina T. V. 21 TS. Vilkova O. N. nghệ tách chiết thu nhận fucoidan Nt Phân tích thành phần hóa học Nt Nghiên cứu phân loài các rong biển có HTSH Nt Nghiên cứu cấu trúc, công nghệ tách chiết thu nhận polysaccarit từ rong biển Nt Phân tích cấu trúc, công nghệ tách chiết thu nhận polysaccarit từ rong biển Nt Phân tích thành phần hóa học, công nghệ tách chiết Nt Công nghệ tách chiết thu nhận polysaccarit rong biển Nt Công nghệ tách chiết thu nhận polysaccarit rong biển Nt Nghiên cứu phân loài các rong biển có HTSH Nt Nghiên cứu phân loài các rong biển có HTSH Viện Nghiên cứu Thủy Tham gia đề xuất các nội sản và Hải dương học dung nghiên cứu thực hiện L.B. Nga tại Nha Trang và Moskva Nt Đề xuất các nội dung nghiên cứu thực hiện tại Nha Trang và Moskva Nt Nghiên cứu công nghệ tách chiết thu nhận các sản phẩm polysaccarit từ rong biển Việt Nam Nt Phân tích cấu trúc, đánh giá chất lượng polysacarit từ rong biển do Việt Nam cung cấp Nt Phân tích cấu trúc, công nghệ tách chiết polysaccarit Nt Phân tích cấu trúc, công nghệ tách chiết polysaccarit Nt Phân tích cấu trúc, công nghệ tách chiết polysaccarit Nt Phân tích cấu trúc, công nghệ tách chiết polysaccarit Nt Phân tích cấu trúc, công nghệ tách chiết polysaccarit i MỤC LỤC Trang i Mục lục vi Danh mục các từ viết tắt Danh mục các bảng viii Danh mục các hình xii MỞ ĐẦU PHẦN I 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ BIẾN ALGINOPHYTES VÀ CARRAGEENOPHYTES TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2 1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 9 12 1.3. Kết luận PHẦN II 14 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu cơ bản quá trình tích lũy sinh khối, sinh tổng hợp các polysacarit ở những giai đoạn phát triển khác nhau của cây rong 14 2.1.1. Phương pháp xác định sự tăng trọng của rong đỏ 14 2.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng polysacarit 14 2.1.3. Xác định sinh tổng hợp của rong nâu 15 2.2. Các phương pháp nghiên cứu sử dụng cho việc xây dựng quy trình xử lý và bảo quản rong nguyên liệu 16 2.2.1. Nguyên liệu 16 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.2.1. Phương pháp xác định carrageenan 16 2.2.2.2. Phương pháp xác định alginat 17 2.2.2.3. Phương pháp xác định vi sinh vật 17 2.3. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học rong carrageenophytes và alginophytes 20 2.3.1. Phân tích protein thô theo AOAC (1996) 20 2.3.2. Phân tích chất béo thô theo Chopar S.L và cs (1991) 21 2.3.3. Phân tích hàm lượng tro theo AOAC. Method 930.05 21 2.3.4. Phân tích hàm lượng fucoidan bằng phương pháp so màu 21 2.3.5. Xác định hàm lượng axít alginic 21 ii 2.3.6. Xác định hàm lượng laminaran trong rong 21 2.3.7. Xác định thành phần đường đơn của polysacarit của rong biển 22 2.3.8. Phân tích hàm lượng các nguyên tố kim loại nặng Hg, As, Cd và Pb trong fucoidan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử-lò graphite-chất cải biến hóa học (CM-GF-AAS) 23 2.3.8.1. Thiết bị 23 2.3.8.2. Hóa chất 24 2.3.8.3. Phá mẫu 24 2.3.8.4. Quy trình đo 24 2.4. Các phương pháp sử dụng cho nghiên cứu cơ bản cấu trúc hóa học của các polysacarit chiết tử 05 loài rong biển 25 2.4.1. Thu thập mẫu rong 25 2.4.2. Chiết polysacarit 25 2.4.2.1. Chiết carrageenan 25 2.4.2.2. Chiết alginat 25 2.4.2.3. Chiết fucoidan 25 2.4.3. Tách phân đoạn 26 2.4.3.1. Tách phân đoạn fucoidan 26 2.4.3.2. Tách phân đoạn axit alginic 26 2.4.4. Phân tích thành phần hóa học 26 2.4.4.1. Xác định hàm lượng sulfat trong polysacarit 26 2.4.4.2. Xác định thành phần monosacarit trong carrageenan 26 2.4.4.3. Phân tích thành phần monosacarit trong fucoidan 27 2.4.4.4. Xác định hàm lượng axit uronic 27 2.4.4.5. Thủy phân fucoidan để đo MS 27 2.4.4.6. Deacetyl hoá 27 2.4.5. Các phương pháp phân tích vật lý 27 2.4.5.1. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp tán xạ ánh sáng (LS) 27 2.4.5.2. Phổ hồng ngoại (IR) 28 2.4.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 28 2.4.5.4. Phổ khối lượng (MS) 28 2.5. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu thu nhận các polysacarit 28 2.5.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu thu nhận 28 iii carrageenan 2.5.1.1. Nguyên liệu 28 2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu 28 2.5.2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu thu nhận alginat canxi 30 2.5.2.1. Nguyên liệu 30 2.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu 30 2.5.3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu thu nhận fucoidan 31 2.5.3.1. Nguyên liệu 31 2.5.3.2. Phương pháp nghiên cứu 31 PHẦN III 32 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nghiên cứu cơ bản quá trình tích lũy sinh khối, sinh tổng hợp các polysacarit ở những giai đoạn phát triển khác nhau của cây rong 32 3.1.1. Khảo sát quá trình tích lũy sinh khối của 02 loài rong đỏ 32 3.1.2. Quá trình sinh tổng hợp polysacarit của 02 loài rong carrageenophytes 33 3.1.3. Khảo sát sự biến động sinh lượng và quá trình tích lũy alginat, manitol và fucoidan ở một số loài rong nâu 38 3.2. Quy trình xử lý và bảo quản tối ưu rong nguyên liệu 43 3.2.1. Ảnh hưởng của các điều kiện xử lý sau thu hoạch đến chất lượng của rong nguyên liệu 43 3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nước rửa rong sau thu hoạch và thời gian bảo quản rong khô đến sự biến đổi thành phần hóa học và vi sinh của rong nguyên liệu 45 3.2.3. Quy trình sơ chế và bảo quản rong nguyên liệu 54 3.3. Kết quả phân tích thành phần hóa học của 2 loài rong carrageenophytes và 3 loài rong alginophytess 56 3.4. Kết quả nghiên cứu cơ bản về cấu trúc hóa học của các polysacarit chiết từ 05 loài rong biển 62 3.4.1. Cấu trúc của polysacarit chiết từ 02 loài rong đỏ K.alvarezii và K.striatum 63 3.4.1.1. Trọng lượng phân tử của carrageenan 63 3.4.1.2. Thành phần hóa học 63 3.4.1.3. Phổ hồng ngoại (IR) 64 3.4.1.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 66 iv 3.4.1.5. Phổ ESI-MS 69 3.4.2. Đặc điểm cấu trúc của alginat chiết từ 03 loài rong nâu 70 3.4.3. Cấu trúc của fucoidan chiết từ 03 loài rong nâu 76 3.4.3.1. Đặc điểm cấu trúc của fucoidan chiết từ loài rong nâu Turbinaria ornata 76 3.4.3.2. Đặc điểm cấu trúc của fucoidan chiết từ loài rong S.polycystum 79 3.4.3.3. Cấu trúc fucoidan của loài rong S.swartzii 87 3.5. Nghiên cứu công nghệ thu nhận các polysacarit từ rong biển 3.5.1. Công nghệ chiết xuất carrageenan 95 95 3.5.1.1. Xác định các chỉ tiêu vi sinh vật của rong nguyên liệu 96 3.5.1.2. Thành phần hóa học 97 3.5.1.3. Tính chất vật lý của carrageenan 97 3.5.1.4. Thành phần hóa học của carrageenan 98 3.5.1.5. Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận carrageenan tự nhiên (tủa bằng EtOH) 99 3.5.1.6. Quy trình công nghệ sản xuất carageenan tự nhiên (tủa bằng EtOH) từ rong đỏ K.alvarezii và K.striatum được trồng tại Việt Nam theo định hướng sử dụng làm chất phụ gia cho thực phẩm với chức năng tạo đông, tạo keo và chất có hoạt tính sinh học 101 3.5.1.7. Quy trình công nghệ sản xuất κ-carrageenan (tủa bằng KCl) từ rong đỏ K.alvarezii và K.striatum được trồng ở Việt Nam theo định hướng sử dụng làm chất phụ gia cho thực phẩm với chức năng tạo đông, tạo keo và chất có hoạt tính sinh học 104 3.5.1.8. Quy trình công nghệ sản xuất κ-carrageenan bán tinh chế 107 3.5.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận alginat canxi từ rong nâu 109 3.5.2.1. Xác định chất lượng rong nguyên liệu 109 3.5.2.2. Tìm điều kiện tối ưu xử lý rong nguyên liệu 110 3.5.2.3. Tìm điều kiện tối ưu chiết alginat 113 3.5.2.4. Tìm điều kiện chiết alginat tối ưu từ bã thải rong nâu 113 3.5.2.5. Tìm điều kiện chiết alginat tối ưu từ rong nâu 115 3.5.2.6. Tìm điều kiện tối ưu để chuyển NaAlg về Ca(Alg)2 117 v 3.5.2.7. Tìm điều kiện tẩy trắng Ca(Alg)2 tối ưu 118 3.5.2.8. Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ rong nâu quy mô pilốt 118 3.5.2.9. Dây chuyền công nghệ sản xuất canxi alginat từ rong nâu quy mô pilốt 119 3.5.2.10. Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ bã thải rong nâu quy mô pilốt 120 3.5.2.11. Dây chuyền công nghệ sản xuất canxi alginat từ bã thải rong nâu quy mô pilốt 121 3.5.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất fucoidan 122 3.5.3.1. Chọn nguyên liệu 122 3.5.3.2. Xác định chất lượng rong nguyên liệu 123 3.5.3.3. Xác định điều kiện tối ưu chiết fucoidan 124 3.5.3.4. Loại alginat và các chất khoáng ra khỏi dịch chiết fucoidan 125 3.5.3.5. Sấy fucoidan 127 3.5.3.6. Dây chuyền công nghệ sản xuất fucoidan từ rong nâu quy mô pilốt 128 3.6. Các tiêu chất lượng cơ sở 129 3.6.1. Tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của sản phẩm carrageenan thu nhận từ rong đỏ Việt Nam 129 3.6.2. Tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam 136 3.6.3. Tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm canxi alginat thu nhận từ rong nâu Việt Nam 143 PHẦN IV 149 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 149 4.1. Kết luận 4.1.1. Kết quả khoa học và công nghệ thu được 149 4.1.2. Kết quả nhận được từ phía đối tác L.B. Nga 150 150 4.2. Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO 152 MỤC LỤC 161 vi CÁC TỪ VIẾT TẮT 13 1 CNMR - phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon-13 HNMR - phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 3,6 AG - 3,6-anhydro galactose AOAC – Journal of the Association of Official Agricultural Chemists BDH, UK - hãng BDH cuả Anh Quốc BGBL - Brilliant Green Bile Lactose Broth - môi trường nuôi cấy BGBL CFU - colon forming unit - khuẩn lạc CM-GF-AAS – Chemical modifier-Graphit furnace-Atomic absorption spectrometry CR-500DX - thiết bị đo lưu biến DRBC Agar - Môi trường thạch Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar DNP International Co., Inc - công ty Mỹ chuyên cung cấp polysaccarit DW – Dried weight (trọng lượng khô) EC Broth - Môi trường canh Escherichia coli Broth ESI-MS - khối phổ kế nguồn ion phun điện tử sương mù FL5 - phân đoạn laminaran số 5 FT-IR - phổ hồng ngoại biến đổi Furrier Fuc,Xyl,Rha,Man,Glc,Gal - đường đơn fucose, rhamnose, mannose, glucose, galactose G - guluronic G6M - 6-methyl galactopyranosyl GC-FID-Sắc ký khí đêtectơ ion ngọn lửa-Gas chromatography-Flame Ionization detector GF/D - màng lọc hãng GF GM - block mannuronic với guluronic axit Halg - axit alginic HMQC, COSY, TOCSY các dạng phổ NMR HPLC - sắc ký lỏng phân giải cao HTSH - hoạt tính sinh học IMViC - môi trường Indol, Mrthyl Red, Voges Proskauer, Citrate IR - quang phổ hồng ngoại IUPAC - International Union of Pure Ananlytical Chemicals and Applied Chemistry - Liên hiệp Quốc tế Hóa Tinh khiết và Hóa Ứng dụng KDa - kilo Danton vii KHTN và CNQG - Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Kl/g - khuẩn lạc/gram LC/MSD - Liquid Chromatography/Mass-spectrometry detector LS - light scattering - tán xạ ánh sáng LST Broth - môi trường Lactose Trypton Lauryl Sulphate Broth M - mannuronic MEA - Môi trường thạch Malt Extract Agar MMB - metylmorpholin boran MS-ESI - khối phổ kế nguồn ion phun điện tử sương mù NITRA - Nhatrang Institute of Technology Research and Application - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang NMR - cộng hưởng từ hạt nhân PCA - plate count agar - môi trường nuôi cấy PCA PDA - Môi trường thạch Potato Dextrose Agar PIBOC - Pacific Institute of Bioorganic Chemistry - Viện Sinh học và Hóa hữu cơ Thái Bình Dương PTFE - polytetra flor ethylen SDA - Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar SDB - Môi trường canh Sabouraud Dextrose Agar SPW - Saline Pepton Water - môi trường nuôi cấy SPW SRC - semi-refined carrageenan T.Đ.T.T - tốc độ tăng trọng TCVN - tiêu chuẩn Việt Nam TFA - triflo axetic TINRO – Pacific Scientific Research Fisheries Center TSA - Trypton Soya Agar - môi trường nuôi cấy TSA UV-VIS - thiết bị quang phổ vùng cực tím - khả kiến VKHK - vi khuẩn hiếu khí VNIRO – Russian Federal Institute of Fisheries and Oceanography VRB - Violet Red Bile Agar - môi trường nuôi cấyVRB VSV - Vi sinh vật VSVHK vinh vật hiếu khí WW - trọng lượng rong ướt viii DANH MỤC BẢNG STT Số bảng Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Sản lượng rong carrageenophytes (tấn khô) thu hoạch trên thế giới năm 2001 2 2 Bảng 1.2. Alginophyte resources (tonnens dry weight; 2001) 4 3 Bảng 2.1. Các điều kiện đo quang phổ hấp thụ nguyên tử GF-AAS sử dụng ống graphite phủ lớp graphite xử lý nhiệt cùng với đĩa đệm (platform) 23 4 Bảng 2.2. Chương trình nhiệt độ của lò graphite 23 5 Bảng 2.3. Chương trình nhiệt độ của lò vi sóng: Ram to temperature control 24 6 Bảng 2.4. Các chất cải biến hóa học và nồng độ sử dụng 25 7 Bảng 3.1. Tốc độ tăng trọng %/ngày của các dòng rong K.alvarezii và K.striatum 32 8 Bảng 3.2. Sự biến đổi của polysacarit và tính chất gel của chúng theo thời gian nuôi trồng tại mùa nhiệt độ thấp (từ tháng 10 đến tháng 3 năm sau) 34 9 Bảng 3.3. Sự biến đổi của polysacarit và tính chất gel của chúng theo thời gian nuôi trồng mùa nhiệt độ cao (từ tháng 4 đến tháng 9) 35 10 Bảng 3.4. Biển đổi thành phần hóa học của carrageenan theo thời gian nuôi trồng 35 11 Bảng 3.5. Hàm lượng manitol biến đổi theo tháng của 03 loài rong nâu vùng biển Khanh Hòa 41 12 Bảng 3.6. Hàm lượng alginat biến đổi theo tháng của 03 loài rong nâu vùng biển Khánh Hòa 41 13 Bảng 3.7. Hàm lượng fucoidan biến đổi theo tháng của 03 loài rong nâu vùng biển Khánh Hòa 42 14 Bảng 3.8. Thời gian các bãi rong có thể bắt đầu khai thác 42 15 Bảng 3.9. Sự biến đổi của độ nhớt, hiệu suất alginat và hiệu suất fucoidan của rong nâu theo phương pháp làm khô nhanh và làm khô chậm 44 16 Bảng 3.10. Sự biến đổi của độ nhớt và hiệu suất carrageenan của rong đỏ theo phương pháp làm khô nhanh và làm khô chậm 44 17 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian và phương pháp bảo quản lên độ ẩm của rong nguyên liệu 46 18 Bảng 3.12. Sự biển đổi thành phần carbohydrate phụ thuộc vào thời 47 ix gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu 19 Bảng 3.13. Sự biển đổi thành phần protein phụ thuộc vào thời gian và cách thức bảo quản 48 20 Bảng 3.14. Sự biển đổi hàm lượng carrageenan phụ thuộc vào thời gian và cách thức bảo quản 49 21 Bảng 3.15. Sự biến đổi hàm lượng alginat phụ thuộc vào thời gian cách thức bảo quản 50 22 Bảng 3.16. Biến đổi hàm lượng tổng vi sinh vật hiếu khí phụ thuộc vào thời gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu 51 23 Bảng 3.17. Biến đổi hàm lượng tổng nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào thời gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu 52 24 Bảng 3.18. Biến đổi hàm lượng Coliform tổng số phụ thuộc vào thời gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu 52 25 Bảng 3.19. Biến đổi hàm lượng E.coli tổng số phụ thuộc vào thời gian và cách thức bảo quản rong nguyên liệu 53 26 Bảng 3.20. Thành phần hóa học chính của các loài rong đỏ 58 27 Bảng 3.21. Thành phần đường đơn của polysacarit rong đỏ 58 28 Bảng 3.22. Thành phần hóa học chính của các loài rong nâu 58 29 Bảng 3.23. Thành phần đường đơn của polysacarit rong nâu 58 30 Bảng 3.24. Tính chất lý hóa của polysacarit chiết từ loài rong Kappaphycus alvarezii có xử lý kiềm 59 31 Bảng 3.25. Tính chất lý hóa của polysacarit chiết từ loài rong Kappaphycus striatum 59 32 Bảng 3.26. Polysacarit chiết từ loài rong Kappaphycus alvarezii (2) và K.striatum (1) không xử lý kiềm 60 33 Bảng 3.27. Thành phần hóa học và tính chất lý hóa của alginat canxi chiết từ rong nâu 60 34 Bảng 3.28. Thành phần hóa học của fucoidan chiết từ 03 loài rong nâu 61 35 Bảng 3.29. Chỉ tiêu chất lượng một số sản phẩm fucoidan nước ngoài 62 36 Bảng 3.30. Kết quả đo trọng lượng phân tử (Mw) trung bình của carrageenan chiết từ hai loài rong K.alvarezii và K.striatum bằng phương pháp tán xạ ánh sáng (LS) 63 37 Bảng 3.31. Kết quả phân tích thành phần hoá học 64 38 Bảng 3.32. Một số dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử và các liên kết trong phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan 65 39 Bảng 3.32. Một số dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử và các liên kết trong phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan 68 x 40 Bảng 3.34. Tương quan rút ra từ phổ COSY 68 41 Bảng 3.35. Độ dịch chuyển hóa học của 1H NMR đo tại 800C 69 42 Bảng 3.36. Một số mảnh đặc trưng trên phổ ESI-MS của mẫu 70 43 Bảng 3.37. Một số dao động đặc trưng của gốc M và G trong vùng 750-950 cm-1 71 44 Bảng 3.38. Hiệu suất tách phân đoạn của các mẫu natri alginat 72 45 Bảng 3.39. Một số vân phổ chính trong vùng “vân tay” trên phổ hồng ngoại của các phân đoạn natri alginat thủy phân 73 46 Bảng 3.40. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của 13C trong các phân đọan F1, F2 và F3 74 47 Bảng 3.41. Đặc điểm cấu trúc của axit alginic của 03 loài rong nâu 75 48 Bảng 3.42. Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan chiết từ rong Turbinaria ornata 76 49 Bảng 3.43. Thành phần đường trong phân tích methyl hóa 02 phân đoạn fucoidan chiết từ loài rong Turbinaria ornata 78 50 Bảng 3.44. Thành phần đường của các phân đoạn fucoidan tách trên nhựa lỏng cetavlon 88 51 Bảng 3.45. Thành phần đơn phân tử có thể có của mảnh ion có số khối m/z = 448 90 52 Bảng 3.46. Các mảnh MS/MS nhiều lần của fucoidan F-20 90 53 Bảng 3.47. Hợp phần của các mảnh ion con từ ion mẹ m/z 448 91 54 Bảng 3.48. Kết quả phân tích vi sinh vật của mẫu rong nguyên liệu thô 97 55 Bảng 3.49. Thành phần hóa học cơ bản của rong đỏ thuộc chi Kappaphycus 97 56 Bảng 3.50. Hiệu suất các loại carrageenan khác nhau theo phần trăm khối lượng cân từ rong thuộc chi Kappaphycus 97 57 Bảng 3.51. Tính chất vật lý của gel 2% dung dịch carrageenan được tách ra từ rong đỏ thuộc chi Kappaphycus 98 58 Bảng 3.52. Thành phần hóa học của các chất chiết và carrageenan được tách từ rong đỏ thuộc chi Kappaphycus 98 59 Bảng 3.53. Ảnh hưởng của điều kiện xử lý đến sức đông (1,5% + 0,2% KCl) và độ truyền qua của carrageenan 100 60 Bảng 3.54. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến sức đông (1,5% trong 0,2% KCl) và độ nhớt của carrageenan chiết từ loài rong K.alvarezii - Khánh Hội - Ninh Thuận 100 61 Bảng 3.55. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất carrageenan từ rong K.alvarezii - Khánh Hội - Ninh Thuận 101 xi 62 Bảng 3.56. Ảnh hưởng của điều kiện xử lý kiềm lên tính chất hóa lý của carrgeenan chiết từ rong K.alvarezii 108 63 Bảng 3.57. Thành phần hóa học và tính chất vật lý của carrageenan 108 64 Bảng 3.58. Kết quả phân tích vi sinh vật của mẫu rong nguyên liệu thô 109 65 Bảng 3.59. Thành phần hóa học của rong nâu và bã thải rong nâu trong quy trình sản suất fucoidan 110 66 Bảng 3.60. Ảnh hưởng của điều kiện tiền xử lý lên hiệu suất,độ nhớt (mCps) và màu của alginat 112 67 Bảng 3.61. Ảnh hưởng của pH và thời gian chiết lênhiệu suất thu hồi alginat 114 68 Bảng 3.62. Ảnh hưởng của pH và thời gian chiết lên hiệu suất chiết alginat 114 69 Bảng 3.63. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết lên hiệu suất chiết của alginat 116 70 Bảng 3.64. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết lên độ nhớt của alginat 116 71 Bảng 3.65. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết lên độ nhớt của dung dịch alginat 116 72 Bảng 3.66. Ảnh hưởng của tỷ lệ CaCl2:Alginat lên khả năng lọc của alginat 117 73 Bảng 3.67. Ảnh hưởng của clorin ( NaOCl) 1% lên độ nhớt của alginat 118 74 Bảng 3.68. Kết quả thử nghiệm gây độc tế bào của fucoidan được tách chiết từ một số loài rong nâu thuộc vùng biển phía Nam Việt Nam 123 75 Bảng 3.69. Kết quả phân tích vi sinh vật của mẫu rong nguyên liệu thô 123 76 Bảng 3.70. Thành phần hóa học chính của các loài rong nâu 124 77 Bảng 3.71. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết, tỷ lệ rong nước lên khả năng chiết fucoidan 125 78 Bảng 3.72. Sự biến đổi thành phần hóa học chính của tủa vào nồng độ tác nhân kết tủa EtOH 126 79 Bảng 3.73. Hàm lượng fucoidan, alginat và kim loại nặng trong kết tủa thu được từ dung dịch cô đặc bằng chưng cất 126 80 Bảng 3.74. Hàm lượng fucoidan, alginat và kim loại nặng trong tủa thu được từ dung dịch cô đặc bằng lọc rây phân tử 127 xii DANH MỤC HÌNH STT Số hình Tên hình Trang 1 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập và tách phân đoạn laminaran 22 2 Hình 3.1. Tốc độ tăng trọng %/ngày của các loài rong K. striatum (dòng màu nâu và màu xanh) và K. alvarezii 33 3 Hình 3.2. Hiệu suất carrageenan từ K. alvarezii qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác 36 4 Hình 3.3. Hiệu suất carrageenan từ K. striatum qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ thấp)với các biện pháp xử lý khác 36 5 Hình 3.4. Sức đông carrageenan từ K. alvarezii qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau 36 6 Hình 3.5. Sức đông carrageenan từ K. striatum qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau 36 7 Hình 3.6. Độ nhớt carrageenan từ K. alvarezii qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau 36 8 Hình 3.7. Độ nhớt carrageenan từ K. striatum qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ thấp) với các biện pháp xử lý khác nhau 36 9 Hình 3.8. Hiệu suất carrageenan từ K. alvarezii qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau 36 10 Hình 3.9. Hiệu suất carrageenan từ K. striatum qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau 36 11 Hình 3.10. Sức đông carrageenan từ K. alvarezii qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau 37 12 Hình 3.11. Sức đông carrageenan từ K. striatum qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau 37 13 Hình 3.12. Độ nhớt carrageenan từ K. alvarezii qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau 37 14 Hình 3.13. Độ nhớt carrageenan từ K. striatum qua thời gian trồng (mùa nhiệt độ cao) với các biện pháp xử lý khác nhau 37 15 Hình 3.14. Biển đổi thành phần hóa học của carrageenan theo thời gian nuôi trồng tại mùa nhiệt độ thấp 37 16 Hình 3.15. Biển đổi thành phần hóa học của carrageenan theo thời gian nuôi trồng tại mùa nhiệt độ cao 37 17 Hình 3.16. Biến động sinh lượng tổng trung bình và riêng cho từng loài rong Mơ ở Bãi Nam 39 18 Hình 3.17. Biến động sinh lượng tổng trung bình và riêng cho từng loài rong Mơ ở Hòn Chồng 39 19 Hình 3.18. Biến động sinh lượng tổng trung bình và riêng cho từng loài 39 xiii rong Mơ ở Sông Lô 20 Hình 3.19. So sánh biến động sinh lượng trung bình của rong Mơ ở 4 bãi rong Sông Lô, Hòn Chồng, Bãi Nam và rạn ngầm Grand Bank trong năm 2008 40 21 Hình 3.20. Hàm lượng manitol biến đổi theo tháng của 03 loài rong nâu vùng biển Khánh Hòa 41 22 Hình 3.21. Hàm lượng alginat biến đổi theo tháng của 03 loài rong nâu vùng biển Khánh Hòa 41 23 Hình 2.22. Hàm lượng fucoidan biến đổi theo tháng của 03 loài rong tại vùng biển Khánh Hòa 42 24 Hình 3.23. Sự biến đổi của độ nhớt và hiệu suất alginat của rong nâu theo phương pháp làm khô nhanh và làm khô chậm 44 25 Hình 3.24. Sự biến đổi hiệu suất fucoidan của rong nâu theo phương pháp làm khô nhanh và làm khô chậm 44 26 Hình 3.25. Sự thay đổi của độ ẩm của rong đỏ theo thời gian và phương pháp bảo quản 46 27 Hình 3.26. Sự thay đổi của độ ẩm của rong nâu theo thời gian và phương pháp bảo quản 46 28 Hình 3.27. Sự biển đổi carbon hydrate của rong đỏ theo thời gian và phương pháp bảo quản 47 29 Hình 3.28. Sự biển đổi carbohydrate của rong nâu theo thời gian và phương pháp bảo quản 48 30 Hình 3.29. Sự biển đổi protein của rong đỏ thời gian và phương pháp bảo quản 49 31 Hình 3.30. Sự biển đổi protein của rong nâu theo thời gian và phương pháp bảo quản 49 32 Hình 3.31. Hàm lượng caragenan phụ thuộc vào thời gian và cách thức bảo quản 50 33 Hình 3.32. Sự biến đổi alginat theo thời gian và phương pháp bảo quản khác nhau 51 34 Hình 3.33. Sơ đồ quy trình sơ chế và bảo quản rong nâu 54 35 Hình 3.34. Đồ thị các đường chuẩn 56 36 Hình 3.35. Đồ thị đường chuẩn sulfat 57 37 Hình 3.36. Sắc ký đồ của các gốc đường đơn chuẩn chạy trên máy sắc ký lỏng HPLC IC-5000 Biotronic, Shimpack ISA-07/S2504 (0,4x25cm) 57 38 Hình 3.37. Phổ IR của carrageenan chiết từ rong K. alvarezii 64 39 Hình 3.38. Phổ IR của carrageenan chiết từ rong K. striatum 65 xiv 40 Hình 3.39. Phổ 13C NMR của carrageenan chiết từ rong K.alvarezii 66 41 Hình 3.40. Phổ 13C NMR của carrageenan chiết từ rong K.alvarezii 66 42 Hình 3.41. Phổ HMQC của mẫu đo tại 800C 67 43 Hình 3.42. Phổ H1-H1 COSYcủa mẫu đo tại 800C 67 44 Hình 3.43. Phổ 1H-1H TOCSY của mẫu đo tại 800C 68 45 Hình 3.44. Phổ ESI-MS của carrageenan chiết từ rong K.alvarezii 69 46 Hình 3.45. Sự phân mảnh của mẫu nghiên cứu 70 47 Hình 3.46. Phổ hồng ngoại của alginat tách chiết từ loài rong Turbinaria ornata 72 48 Hình 3.47. Phổ ESI-MS của phân đoạn fucoidan chiết từ rong Turbinaria ornata 77 49 Hình 3.48. Phổ H1-NMR của phân đoạn 1,0N-fucoidan 78 50 Hình 3.49. Sắc ký đồ GLC phân tích thành phần đường trung tính 80 51 Hình 3.50. Phổ hồng ngoại của phân đoạn fucoidan F20 của loài rong nâu S.polycystum 81 52 Hình 3.51. Phổ 13C-NMR của phân đoạn fucoidan F20 của loài rong nâu S.polycystum 82 53 Hình 3.52. Phổ 1H-NMR của phân đoạn fucoidan F20 của loài rong nâu S.polycystum 83 54 Hình 3.53. Phổ H-H COSY của phân đoạn fucoidan F4 của loài rong nâu S.polycystum 84 55 Hình 3.54. Phổ ESI-MS của mẫu oligo-F20 của loài rong S.polycystum 85 56 Hình 3.55. Cấu trúc (a) và sơ đồ phân mảnh (b) của một đoạn trong phân đoạn F-20 của mẫu fucoidan được tách chiết từ loài rong S. polycystum 86 57 Hình 3.56. Phổ IR của phân đoạn fucoidan F-20 chiết từ rong nâu S.swartzii 88 58 Hình 3.57. Phổ C13-NMR của phân đoạn fucoidan F-20 từ rong nâu S.swartzii được đo trong nước nặng 89 59 Hình 3.58. Phổ H1-NMR của phân đoạn fucoidan F-20 từ rong nâu S.swartzii được đo trong nước nặng 89 60 Hình 3.59. Phổ H-H COSY của phân đoạn fucoidan F-20 phân lập từ rong nâu S.swartzii đo trong nước nặng 89 61 Hình 3.60. Phổ HSQC của phân đoạn fucoidan F-20 phân lập từ rong nâu S.swartzii đo trong nước nặng 89 62 Hình 3.61. Cấu trúc của fucoidan từ F20 94 xv 63 Hình 3.62. Sơ đồ phân mảnh của fucoidan từ F-20 94 64 Hình 3.63. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất carrageenan tự nhiên từ rong K.alvarezii và K.striatum bằng phương pháp kết tủa với cồn ethylic 103 65 Hình 3.64. Sơ đồ quy trình công nghệ tách chiết carrageenan từ rong biển bằng phương pháp kết tủa với KCl 105 66 Hình 3.65. Quy trình thu nhận carrageenan bằng xử lý kiềm dung dịch chiết từ rong K.alvarezii 109 67 Hình 3.66. Biểu đồ ảnh hưởng của pH và thời gian chiết lên hiệu suất thu hồi alginat từ bã thải rong nâu 114 68 Hình 3.67. Biểu đồ biến đổi hiệu suất chiết alginat phụ thuộc vào thời gian chiết 115 69 Hình 3.68. Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ rong nâu 120 70 Hình 3.69. Quy trình công nghệ sản xuất canxi alginat từ bã thải rong nâu 121 71 Hình 3.70. Sơ đồ dây chuyền công nghệ sản xuất fucoidan từ rong nâu 128 MỞ ĐẦU Với tổng chiều dài bờ biển nhiệt đới trên 3.600 km nước ta có một nguồn lợi lớn rong biển cho phép sản xuất ra nhiều loại polysacarit quý giá, trong đó có 3 sản phẩm polysacarit hiện đang được thị trường thế giới đặc biệt quan tâm. Đó là carrageenan, fucoidan và alginat canxi đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và trong các lĩnh vực y học khác nhau. Carrageenan thể hiện nhiều tính chất đặc biệt: iota carrageenan tạo gel trong suốt, đàn hồi khi có mặt muối canxi, trong khi kappa tạo gel có độ cứng cao với muối kali, nhưng với muối Ca nó lại tạo gel giòn, còn lambda thì không tạo gel mà tạo dung dịch độ nhớt cao. Fucoidan có tính năng kháng u, chống huyết khối, tăng cường khả năng miễn dịch, chống viêm nhiễm. Alginat canxi được biết như một vật liệu trung gian lý tưởng để cố định các loại enzym khác nhau hoặc chuyển đổi thành các muối kim loại khác nhau, đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi với giá trị gia tăng trong công nghệ thực phẩm, sinh học và y học. Trong nhiệm vụ hợp tác nghiên cứu theo Nghị định thư này, cùng với các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Thủy sản và Hải dương học L.B.Nga chúng tôi đã nghiên cứu rong biển Việt Nam và xây dựng tổ hợp công nghệ thu nhận các polysacarit carrageennan, fucoidan và alginat canxi, với các nội dung chính như sau: - Thu mẫu, nghiên cứu quá trình tích lũy sinh khối, sinh tổng hợp các polysacarit ở những giai đoạn phát triển khác nhau của 5 loài rong nguyên liệu, xử lý và bảo quản chúng. - Nghiên cứu thành phần hóa học của 2 loài rong đỏ và 3 loài rong nâu Việt Nam, các đặc tính cấu trúc và các tính chất lý-hóa của các polysacarit được tách chiết từ chúng. - Nghiên cứu thiết lập quy trình công nghệ thu nhận carrageenan từ loài rong đỏ Kappaphycus được nuôi trồng tại Việt nam. - Nghiên cứu xây dựng công nghệ phức hợp thu nhận fucoidan và alginat canxi từ rong Mơ Việt nam. - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho các sản phẩm carrageenan, fucoidan và alginat canxi thu được. Kết quả nghiên cứu thu được trong quá trình thực hiện Nhiệm vụ đã cho thấy các quy trình công nghệ thu nhận carrageenan, fucoidan và alginat canxi từ rong biển Việt Nam mà chúng tôi đã áp dụng đều là những công nghệ tiên tiến, cho phép không sử dụng đến hầu hết các hóa chất tẩy màu, trợ lắng và xử lý nguyên liệu, trong khi chỉ sử dụng lượng tối thiểu những vật liệu rẻ tiền sẵn có trong nước và không gây ô nhiễm đối với môi trường như Ca(OH)2 và CaCl2. Trong các công nghệ này chúng tôi đã sử dụng màng siêu lọc để cô đặc và làm sạch các polysacarit trước khi tủa ở nhiệt độ phòng, mà hầu như không sử dụng đến các hóa chất và không gây ô nhiễm môi trường, nhờ vậy chất lượng và hiệu suất thu hồi sản phẩm tăng lên đáng kể. Kết quả thu được tạo điều kiện cho việc xây dựng các tổ hợp sinh-dược học sản xuất các sản phẩm polysacarit có hoạt tính sinh học khác nhau.Các sản phẩm polysacarit thu được đã đạt tiêu chẩn chất lượng cơ sở tương đương với các sản phẩm do Viện VNIRO và công ty DNP sản xuất.