Nghiên cứu qui trình chiết tách (±) gossypol từ hạt cây bông Gossypium hirsutum

  • Số trang: 56 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 112 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược - HÀ NỘI ______ *****______ HOÀNG NGUYÊN THÙY NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHIẾT TÁCH (±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY BÔNG GOSSYPIUM HỈRSUTUM KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SỸ Người hướng dẫn; 1. TSTĐào Thanh Hiền 2. TS. Nguyễn Văn Tài Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền 2. Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu Thời gian thực hiện : 10/2010 - 05/2011 t r iíủ n í; đh d u ík : hà nôi T H Ư V IỆÌ^ẳ .,A.... ínáng 0:... So ĐKCB:. . Nqày HÀ N Ộ I-2011 năm . 2Q.A-Ĩ J LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp của mình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: TS. Đào Thanh Hiền - Giảng viên - Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường ĐH Dược Hà Nội. TS. Nguyễn Văn Tài - Phó khoa - Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu. TS. Nguyễn Thế Hùng - Giảng viên - Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường ĐH Dược Hà Nội. Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu đã luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo trong trường, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong có được sự góp ý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên. Hà Nội, tháng 5 năm 2011 Sinh viên Hoàng Nguyên Thùy MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN Đ Ề......................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...............................................................................3 1.1. Sự tồn tại của gossypol trong hạt của cây bông Gossypium hirsutum...3 1.2. Tính chất vật lý, hóa học của gossypol.................................................... 3 1.3. Tác dụng dược lý của gossypol................................................................ 5 1.3.1. Tác dụng chống ung thư.................................................................... 5 1.3.2. Tác dụng tránh thai nam .................................................................... 8 1.3.3. Tác dụng khác.................................................................................... 9 1.4. Một số qui trình chiết tách gossypol...................................................... 10 1.4.1. Phương pháp 1..................................................................................10 1.4.2. Phương pháp 2 .................................................................................. 11 1.4.3. Phương pháp 3 ..................................................................................12 1.4.4. Phương pháp 4 .................................................................................. 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .............. 16 2.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................16 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất...................................................................16 2.1.2. Máy móc và dụng cụ.........................................................................16 2.2. Nội dung nghiên cứu...............................................................................17 2.3. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................17 2.3.1. Phương pháp chiết xuất và tinh chế gossypol................................. 17 2.3.1.1. Phương pháp chiết xuất............................................................. 17 2.3.1.2. Phương pháp tinh chế gossypol................................................ 18 2.3.2. Phương pháp kiểm tra cấu trúc và xác định hàm lượng G-AA có trong sản phẩm tách được................................................................................. 18 2.3.2.1. Định tính sự có mặt của gossypol bằng phương pháp sắc ký lóp mỏng......................................................................................................18 2.3.2.2. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV- VIS).........................19 2.3.2.3. Nhận dạng gossypol tách được................................................. 19 2.3.2.4. Định lượng gossypol có trong sản phẩm thu được................... 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN.......................21 3.1. Kết quả thực nghiệm...............................................................................21 3.1.1. Chuẩn bị nguyên liệu........................................................................21 3.1.2. Chiết gossypol racemic.................................................................. 21 3.1.3. Kết tinh gossypol acid acetic......................................................... 23 3.1.4. Kiểm tra cấu trúc chất tách được....................................................25 3.1.5. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm thu được............................. 26 3.1.6 . Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trong qui trình chiết xuất....... 28 3.1.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp dung môi aceton/nước.28 3.1.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết........................ 30 3.1.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân............. ....32 3.1.6.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid H3PO4 dùng thủy phân33 3.1.7. Tóm lại............................................................................................35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XƯÁT............................................................................38 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẶN VĂN DCM: Dichlo methan DEE: Diethyl ether EtOH: Ethanol G-AA: Gossypol acid acetic IR: Phổ hồng ngoại MEK: Methyl ethyl keton SKLM: Sắc kí lóp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 3.1 : Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ acetone/ nước 29 Bảng 3.2- Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết 31 Bảng 3.3- Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân 32 Bảng 3.4- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid và thời gian thủy phân 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ sơ ĐÒ TRONG LUẬN VÃN Trang Hình L l: Gossypol và các dạng đông phân quang học Hình 3.1: SKLM của cao chiết so sánh với gossypol đổi chiếu (l):Gossypol đổi chiếu; (2): Cao chiết Hình 3.2: SKLM của sản phẩm chiết tách được so sánh với gossypol đổi chiếu ' 25 (1). Gossypol đổi chiểu; (3): G-AA thu được Hình 3.3: Phổ u v của sản phẩm G-AA thu được Hình 3.4: Đường chuẩn G-AA bằng phương pháp u v 26 27 Hình 3.5: SKLM của sản phẩm chiết được mẻ lớn so sánh với gossypol đẻi chiếu 37 (1). Gossypol đổi chiếu; (4). G-AA thu được Sơ đồ 3.1: Chỉêt xuất và tinh chế G-AA 23 - 1 - ĐẶT VẤN ĐÈ Ung thư là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay trên thế giới. Theo thống kê của Bộ Y tế, ước tính mỗi năm ở nước ta có khoảng 150.000 bệnh nhân ung thư mới mắc và 75.000 người tử vong do ung thư. Con số này có xu hướng ngày càng gia tăng [43]. Phưong pháp chủ yếu điều trị ung thư là dùng các liệu pháp hoá trị, xạ trị. Tuy nhiên, hóa trị và xạ trị lại làm suy giảm miễn dịch và ảnh hưởng đến các tế bào bình thưòng khác làm cho sức khỏe bệnh nhân dần dần kiệt quệ. Hiện nay, hướng đi mới trong điều trị ung thư là các thuốc điều trị ung thư theo hướng đích, không chỉ cho hiệu quả hơn các thuốc hóa trị truyền thống mà còn ít gây độc với các tế bào bình thường. Trong liệu pháp mới này có thể kể đến các kháng thể đon dòng, các chất chống tạo mạch máu mới nuôi khối u, các chất chống proteasome, các chất ức chế Bcl-2 (họ protein gây cái chết theo chưong trình của tế bào) như genasense, gossypol... Gossypol là một hợp chất polyphenol có nhiều trong hạt của các loài thuộc chi Gossypỉum, họ Bông {Malvaceae). Gossypol được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học, trong đó tác dụng gây độc tế bào của nó đã được biết đến từ lâu [13]. Tuy nhiên, gần đây, các nhà khoa học mới phát hiện gossypol có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-2. Từ đó, gossypol được kì vọng trở thành một thuốc chống ung thư theo hướng đích mới. ở Việt Nam, bông vải là loại cây công nghiệp được trồng phổ biến để lấy xơ, diện tích ước tính đạt 8.500 ha. Đây là một nguồn nguyên liệu sẵn có và vô cùng phong phú cho việc sản xuất gossypol. Điều này mở ra hy vọng Việt Nam có thể tự sản xuất được một loại thuốc điều trị ung thư bắt kịp xu hướng điều trị mới với giá thành rẻ, phù hợp với khả năng kinh tế của người dân. - 2 - Từ năm 1997 đến nay, ở nước ta đã có 2 tác giả nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế gossypol. Tuy nhiên phương pháp mà 2 tác giả này đưa ra còn có nhiều nhược điểm, hiệu suất chưa cao và qui trình chưa phù hợp để áp dụng vào sản xuất qui mô lớn. Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CÚXJ QUI TRÌNH CHIÉT TÁCH (±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY BÔNG GOSSYPIUMHIRSUTUM' Mục tiêu của đề tài: - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế (±) gossypol từ hạt cây bông Gossypỉum hirsutum. - Khảo sát một số điều kiện trong qui trình chiết xuất, từ đó tìm ra qui trình có hiệu suất cao, góp phần áp dụng vào qui mô sản xuất lớn. - 3 - CHƯOÍNG 1. TỎNG QUAN 1.1. Sự tồn tại của gossypol trong hạt của cây bông Gossypium hirsutum Gossypol là một hơp chất polyphenol màu vàng, được chiết xuất từ cây bông {Gossypỉum sp.) và 1 loài cây nhiệt đới Thepesia populnea, đều thuộc họ bông Malvaceae [21, 24'. Gossypol tồn tại trong nhiều bộ phận của cây như vỏ rễ, lá, hoa, vỏ hạt... Hạt bông chứa 16-24% protein và 13-24% dầu trong tổng khối lượng nhân hạt. Ngoài ra còn có các flavonoid và các chất mầu mà chủ yếu là gossypol. Trong hạt bông, gossypol tồn tại chủ yếu trong các tuyến chất màu bên trong nhân, chiếm 90% lượng sắc tố trong các tuyến, và thưÒTig chiếm khoảng 0,4- 1,7% khối lượng của nhân hạt [18]. ở Việt Nam có 5 loài thuộc chi Bông (Gossypium) là G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum, G. herbaceum và G. acuminatum [ 1]. Trong đó, G. hỉrsutum là một loài phổ biến. Cùng với các hợp chất sesquiterpen trong tuyến sắc tổ, chức năng tự nhiên của gossypol là một chất trừ sâu (kháng khuẩn) thiên nhiên giúp cây trồng kháng lại các mầm bệnh và côn trùng. 1.2. Tính chất vật lý, hóa học của gossypol Gossypol được phân lập lần đầu tiên năm 1886 dưới dạng hỗn hợp với các sắc tố, acid béo và phospholipid trong suốt quá trình tinh chế dầu hạt bông. Đến năm 1938, cấu trúc của gossypol mới được suy luận dựa vào các tính chất vật lý và hóa học của nó. Tên gọi “gossypol” được dùng để ám chỉ xuất xứ từ cây bông và là một hợp chất phenol thiên nhiên, cấu trúc hóa học đã được chứng minh bởi Eward, người đã tổng hợp ra phân tử và chứng minh được nó có cấu trúc là l,r,6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'dimethyl-2 ,2 '-binaphthalen-8 ,8 '-dicarboxaldehyd [ 10 ]. cấu tạo của gossypol - 4 - gồm 2 khung naphthalen đối xứng, mỗi khung chứa 3 nhóm -OH và 1 nhóm CHO. Hai nhóm -O H ở vị trí 1 - 1 ’ hoạt động hon 4 nhóm -O H còn lại, do chúng ở gần 2 nhóm aldehyd ở vị trí 8 - 8 ’. Hai nhóm aldehyd này cũng góp phần lớn vào hóa tính đặc biệt của phân tử gossypol, nó đóng vai trò trong việc tạo nên các dạng hỗ biến của gossypol, và được cho rằng là nhóm chức đóng vai trò quan trọng tạo nên độc tính của gossypol [4]. Nhờ đó gossypol dễ dàng chuyển hóa thành 3 dạng đồng phân tautomeric khác nhau là: aldehyd, ketone, và hemiacetal trong các dung môi khác nhau. Nhóm aldehyd tự do này cũng dễ dàng phản ứng với các amin tạo thành dẫn xuất base Schiff, do đó trong tự nhiên gossypol chủ yếu tồn tại dưới dạng base Schiff với các nhóm amino của protein. HO CHO )f=Ầ —{/ OHC OH OH HO X. \4 ìj ỉ ếằ& m ĩõ \ y/ ĩ i \ FoTTTiụ]a: MW: m3 HO CHO (’Ị“CífâKvpỉ>ỉ P“Fí)rm IM IS _ -> si }i > Hình 1.1: Gossypol và các dạng đông phân quang học - 5 - Gossypol tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học là (+)-gossypol và ()-gossypol. Trong hạt cây bông đều có tồn tại cả hai dạng đồng phân này, tuy nhiên tỉ lệ của chúng ở các loài và các giống khác nhau là khác nhau. Hai dạng đồng phân này cũng thể hiện các tác dụng dược lý khác nhau, trong đó (-)-gossypol được chứng minh là có hiệu quả hơn. Do các nhóm -O H và -CHO hoạt hóa nên gossypol dễ bị oxy hóa, đặc biệt khi có các tác nhân là ánh sáng, nhiệt độ cao và oxy không khí. Gossypol dễ bị oxy hóa trong dung dịch kiềm, có màu đỏ sáng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, và màu xanh đậm trong dung dịch FeCls. Do trong cấu trúc có chứa nhiều nhóm phân cực (6 nhóm -O H và 2 nhóm -CHO) nên gossypol tan trong nhiều dung môi hữu cơ phân cực như methanol, ethanol, butanol, diethyl ether, aceton, chloroform, dichlo methan, ethyl acetat... Gossypol it tan trong hexan, ether dầu (30°C- 60°C) và do CÓ 2 nhóm dialkylnaphthalen nên nó không tan trong nước. Điểm chảy của tinh thể gossypol tinh sạch phụ thuộc vào dung môi dùng để kết tinh nó. Gossypol kết tinh trong diethyl ether có điểm chảy là 184°c, kết tinh trong chloroform có điểm chảy là I 9 9 V , kết tinh trong ligroin có điểm chảy là 214°c [20^. 1.3. Tác dụng dược lý của gossypol 1.3.1. Tác dụng chống ung thư Tác dụng chống ung thư của gossypol được phát hiện đã tạo ra một sự thay đổi cơ bản trong nhận thức của các nhà khoa học. Gossypol không còn bị coi là một họp chất bất lợi có trong hạt bông, mà là một hợp chất tự nhiên có các tính chất dược lý và hóa học có giá trị khai thác. Có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư ỉn vitro của gossypol trên nhiều dòng tế bào ung thư người khác nhau như ung thư buồng trứng, ung - 6 - thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyến thượng thận, ung thư cổ tử cung, ung thư tế bào phổi nhỏ...[11, 34, 36, 39]. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng đồng phân (-) có hiệu lực mạnh hơn trên hầu hết các hệ thống sinh học khi so sánh với đồng phân (+) và hỗn hợp racemic. Nguyên nhân là đồng phân (-) ở nồng độ thấp ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào, điều này không thấy ở (+)-gossypol và nồng độ cao của (-)-gossypol [2 2 ]. (-)-Gossypol có tác dụng gây độc tế bào mạnh hơn so với hỗn họp racemic và (+)-gossypol. Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol gây độc tế bào mạnh hơn 2- 14 lần so với (+)-gossypol trên tất cả các dòng tế bào ung thư '5]. Tác dụng gây độc tế bào của gossypol cũng đã được quan sát trên các tế bào kháng lại adriamycin, vinblastin, và cisplatin [22]. Các nghiên cứu so sánh cho thấy (-)-gossypol có hoạt tính chống ung thư mạnh hơn cisplatin, melphalan và dacarbazin trên 2 dòng ung thư sắc tố, cispaltin và daunorubicin trên dòng ung thư phổi, và mạnh hơn hydroxyure và busphalan trên một số dòng ung thư máu [35]. Một số dẫn chất của gossypol cũng được tổng họp và so sánh với gossypol về tác dụng gây độc tế bào. Dan xuất base Schiff của (-)gossypol với L- phenylalanin methyl ester được chứng minh là có hoạt tính mạnh hơn (-)-gossypol trên các dòng tế bào ung thư sắc tố ác tính (SK- MEL19), ung thư cổ tử cung (Sihas), ung thư tế bào phổi nhỏ (H69) và ung thư bạch cầu nguyên bào tủy (K562) [34'. Nhiều thử nghiệm lâm sàng về tác dụng gây độc tế bào của gossypol đã được thực hiện. Nghiên cứu lâm sàng pha 1 trên 34 bệnh nhân ung thư đã kháng thuốc ở nhiều type khác nhau, dùng theo đưòng uống gossypol racemic 30-180 mg/tuần; kết quả cho thấy có hiệu quả lâm sàng tối thiểu nhưng không có bằng chứng của ức chế tủy xương [36]. Trong thử nghiệm với 21 bệnh nhân ung thư tuyến thượng thận di căn, cho uống gossypol với liều 30- 70 - 7 - mg/ngày, cho thấy đã có dung nạp tốt với chỉ một tác dụng phụ nguy hiểm nhất là tắc ruột [11]. Nghiên cứu trên bệnh nhân u thần kinh đệm ác tính tái phát, cho uống gossypol 20 mg/ngày, kết quả là đã có sự dung nạp, tỉ lệ đáp ứng tuy thấp nhưng có thể đo được [7]. Nghiên cứu trên 20 bệnh nhân nữ ung thư vú di căn đã kháng, các thử nghiệm lâm sàng pha I/ II bao gồm cho uống gossypol 30-50 mg/ngày , kết quả cho thấy sự đáp ứng không đáng kể ở một bệnh nhân, có độ ổn định bệnh với sự giảm trên 50% các maker ung thư ở 2 bệnh nhân [39]. Nghiên cứu về cơ chế tác dụng chống ung thư của gossypol đã đưa ra nhiều giả thuyết. Nghiên cứu của Floridi và cộng sự năm 1983 chỉ ra rằng sự gián đoạn của quá trình chuyển hóa năng lượng có thể là cơ chế mà gossypol ảnh hưởng đến các tế bào phân chia nhanh với yêu cầu chuyển hóa cao, thay vì thông qua tác động trực tiếp đến sự nhân đôi của ADN [13]. Các nghiên cứu khác trên nhiều dòng tế bào ung thư đã quan sát được tác dụng ức chế của gossypol trên các enzyme liên quan đến sự tổng họp và sửa chữa ADN, đặc biệt là ADN- polymerase, nucleotide reductase và ADN potoisomerase [3, 26, 33], và trên các enzyme giúp các dòng tế bào này chống lại việc bị phá hủy bởi sự oxy hóa [14’. Gossypol ức chế một số enzym, có thể là kết quả của sự hình thành base Schiff thông qua phản ứng của nhóm aldehyd của gossypol với nhóm amin của lysin có trong các enzym, thông qua liên kết hydro hình thành với catechol hydroxyl. Gossypol ức chế các loại khác nhau của NAD(P) liên kếtenzym xúc tác cho quá trình oxy hóa và NAD(P)H liên kết- enzym xúc tác cho sự khử, quá trình tạo thành năng lượng cho tế bào, ví dụ con đưòng đường phân, chu trình Kreb xảy ra trong ty thể, và chuỗi vận chuyển electron xảy ra bên trong màng ty thể [6 ]. Các enzym dehydrogenase trong bào tương và trong ty thể đều bị ức chế bởi gossypol [15, 38'. - 8 - Nghiên cứu của Flack và cộng sự năm 1993 đưa ra giả thuyết gossypol ức chế nitơ oxyd, do đó gây ra sự co mạch và làm giảm dòng máu đến mô và tế bào ung thư [ 1 2 ]. Với sự phát triển của sinh học phân tử, các nhà khoa học gần đây đã phát hiện ra tác dụng gây độc tế bào của gossypol có liên quan đến các protein Bcl-2. Đây là một họ protein có vai trò kiểm soát cái chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) theo con đường ty thể [41]. Sự biểu hiện quá mức của các protein này, chủ yếu là Bcl-2 và Bc1-Xl, ngăn cản apoptosis thông qua con đường ty thể, thường được thấy trong các dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc. Gossypol có hoạt động như một chất bắt chước domain BH3, liên kết với các domain BH 3 của các protein anti-apoptosis, phát động quá trình apoptosis [17]. (-)-Gossypol làm giảm biểu hiện của Bcl-2, Bc1-Xl và Mcl-1 trên dòng tế bào ung thư bàng quang đã kháng thuốc (ƯM-UC9), và do đó làm cho các dòng tế bào ung thư bàng quang đã kháng với các thuốc hóa trị liệu như carboplatin, gemcitabin, và paclitaxel trở nên nhạy cảm trở lại [23’. Tóm lại, gossypol được hứa hẹn như là một trong những họp chất đi đầu trong nhóm các thuốc chống ung thư mới, đặc biệt để chống lại tính kháng với liệu pháp hóa học và xạ trị của các tế bào ung thư. 1.3.2. Tác dụng tránh thai nam Vào năm 1978, một thử nghiệm lâm sàng với qui mô lớn tại Trung Quốc trên 10.000 nam giới tình nguyện khỏe mạnh, họ được uống gossypol 20mg/ngày trong vòng 75 ngày (liều tấn công), và 50mg/tuần (liều duy trì). Tương đối ít các tác dụng phụ quan sát được, 0,75% số người phát triển nghiêm trọng chứng hạ kali máu, và có 10% số người uống gossypol trên 1 năm không hồi phục được quá trình sinh tinh trùng. Một cuộc nghiên cứu mang tính quốc tế bao gồm 151 người Brazil, Nigeria, Kenya và Trung Quốc - 9 - được uống gossypol 15 mg/ ngày trong 12 đến 16 tuần, sau đó duy trì liều 7,5 hoặc 10 mg/ ngày trong 40 tuần. Không có ai trong số những người tham gia phải ngừng gossypol do hạ kali máu, và sự sinh tinh trùng phục hồi ngay sau khi ngừng gossypol [8 ’. Tác dụng tránh thai nam của gossypol được cho là do sự ức chế LDHC4 của ty thể (LDH-X), enzym mà chỉ có ở tinh hoàn, tinh trùng và là thiết yếu cho sự sản xuất năng lượng, (-)-gossypol chống lại sự phát triển của tinh trùng in vivo, lí do là sự liên kết của gossypol với hàng rào máu- ống sinh tinh bằng cơ chế tạo phức hợp albumin- gossypol [42]. Cơ chế của tác dụng tránh thai nam cũng đồng thời do ức chế nhiều hệ enzym khác, ví dụ ribonucleotide reductase [26], malate dehydrogenase (MDH), kinase glyceraldehyde-3-phosphat dehydrogenase (GA3PDH), protein c (PKC), và cytoplasmic phospholipase A2 (cPLA2) [37]. Enzym cuối cùng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng khử cực đầu của tinh trùng trong sự trưởng thành của tinh trùng. Một cơ chế khác là gossypol ức chế mạnh các enzyme hủy đầu tinh trùng như acrosin, azocoll proteinase, arylsulfatase, neuraminidase, và hyaluronidase. Vai trò của các enzyme này là phá vỡ màng ngoài của trứng, nhờ đó tinh trùng có thể thâm nhập vào trứng để thụ tinh. 1.3.3. Tác dụng khác Gossypol được chứng minh là có tác dụng diệt virus và kí sinh trùng. Nó thể hiện tác dụng chống virus đối với các virus có vỏ, ví dụ như HIV1 và HSV2, nhưng không thể hiện trên virus không có vỏ như poliovirus [25, 31 . (-)-Gossypol (nồng độ ức chế trung bình [IC50= 5,2 |LiM) có hiệu lực mạnh hơn (+)-gossypol (IC 50= 50,7|^M) khi chổng lại sự sao chép của HIVl nhưng lại không mạnh bằng zidovudin (AZT). Khi kết họp điều trị với AZT, (-)- - 10 - gossypol không có các tác dụng phụ nghiêm trọng gây độc trên tủy xương [25]. Gossypol có tác dụng ức chế các chủng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum nhạy cảm và đề kháng với chloroquin [32, 38]. Các dẫn xuất của gossypol cũng thể hiện tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét tương tự như gossypol (IC50 = 7-15ịxM) [32]. Tác dụng diệt kí sinh trùng khác bao gồm ức chế Entamoeba histolytica và Tỉypanosoma cruzi [15, 29]. Gossypol cũng là một chất chống oxy hóa tự nhiên có hiệu quả. Các dẫn xuất base Schiff của gossypol được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa tương đương với gossypol. Nhưng khi thay đổi nhóm hydroxyl phenolic của gossypol thì hoạt tính chống oxy hóa của các dẫn xuất bị giảm, chứng tỏ rằng các nhóm hydroxyl đóng vai trò quyết định trong tác dụng chống oxy hóa của gossypol [40]. 1.4. Một số qui trình chiết tách gossypol L4.1. Phương pháp 1: Nguyên liệu: vỏ rễ của cây bông Gossypỉum barbadense Phương pháp: Chiết gossypol toàn phần bằng dung môi aceton, dịch chiết đem kết tinh trong hệ dung môi aceton : acid acetic để thu sản phẩm gossypol acid acetic (G-AA). Mô tả: Nguyên liệu đem ngâm lạnh với aceton ở nhiệt độ phòng. Hết thời gian, đem lọc. Dịch lọc, đem cất thu hồi dung môi trên máy cất chân không đến một thể tích xác định. Sau đó thêm vào một lượng acid cetic phù họp, để kết tinh qua đêm. Hết thời gian, đem lọc, rửa tinh thể bằng hexan. Tinh thể thu được đem sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng cho hết -11 - hexan. Ket tinh lại một lần nữa với aceton và acid acetic như trên, thu được sản phẩm G-AA [28'. Nhận xét: - ư u điểm; phương pháp chiết và kết tinh đơn giản. Sản phẩm kết tinh là G-AA là dẫn chất được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về tác dụng dược lý của gossypol. Hơn nữa G-AA còn được chứng minh là bền hon gossypol. - Nhược điểm của phương pháp là tác giả không đưa ra hiệu suất của qui trình. Hơn nữa qui trình đi từ vỏ rễ của cây bông, đây là nguyên liệu không sẵn có do phải phá bỏ cả cây mới lấy được. 1.4.2. Phương pháp 2: Nguyên liệu: Gôm hạt bông (cottonseed gum), hoặc soapstock: đây đều là những sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất dầu hạt bông, chứa gossypol dưới dạng liên kết với một số chất khác như phospholipid, protein trong nhân hạt bông. Phương pháp: Phương pháp của Dowd và cộng sự [27]. Thủy phân gossypol dưới dạng liên kết bằng acid thích hơp, sau đó dùng một dung môi hữu cơ tách lấy gossypol tự do, ly tâm để tách riêng pha hữu cơ chứa gossypol và pha nước chứa phospholipid, pha hữu cơ đem thu hồi một phần dung môi rồi kết tinh bằng cách thêm acid acetic, tách riêng tinh thể G-AA tạo thành. Mô tả: Dung môi được dùng là methyl ethyl keton (MEK) chứa acid phosphoric hoặc acid oxalic. Nồng độ acid là 0,2 M với acid oxalic hoặc 0,4 M với acid phosphoric. Nguyên liệu được cho vào bình thích họp, thêm MEK đã được acid hóa, đun hồi lưu ở 75°c, thời gian thủy phân là Ih nếu dùng acid oxalic và 2 giờ nếu dùng acid phosphoric, trong thời gian thủy phân có khuấy trộn. Hết giờ, làm lạnh bình về 1o^c, sau đó cho hỗn họp vào li tâm để phân - 12 - tách riêng ra hai pha: pha MEK chứa gossypol và pha nước chứa phosphatid. Pha nước này được rửa lại khoảng 3 lần với MEK. Gộp pha MEK ở trên với các phần MEK rửa pha nước, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến còn khoảng một thể tích phù hợp cho kết tinh, rồi thêm acid acetic để kết tinh. Lượng acid acetic thêm vào bằng khoảng 1/3 lượng MEK. Kết tinh ở 25®c, trong điều kiện tránh ánh sáng để ngăn cản quá trình gossypol bị oxy hóa. Hết thời gian kết tinh, tách lấy tinh thể G-AA bằng cách lọc dưới áp suất giảm hoặc li tâm. Rửa tinh thể bằng hexan đến khi dung dịch rửa hết màu. Cuối cùng tinh thể G-AA đem sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng. Có thể tinh sạch sản phẩm bằng cách kết tinh lại nhiều lần bằng acid acetic và MEK như trên. Phưong pháp cho sản phẩm có độ tinh sạch đạt khoảng 87%, hiệu suất của cả quá trình từ 2,1- 3,0% [27]. Nhận xét: Bước quan trọng nhất của phương pháp này là bước thủy phân giải phóng gossypol tự do từ dạng liên kết. Phương pháp dễ thực hiện và có thể nâng lên thực hiện ở qui mô lớn. Hơn nữa, phưooig pháp này sử dụng các nguyên liệu là các sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất dầu hạt bông, vì thế nguyên liệu rẻ tiền. Sản phẩm thu được cuối cùng là G-AA, là chất được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về tác dụng dược lý của gossypol. Quá trình chiết gossypol toàn phần cũng như kết tinh tạo G-AA yêu cầu ít thời gian (khoảng 30 giờ đến 48 giờ), tránh được sự tác động của nhiệt độ cao và ánh sáng nên giảm thiểu được sự oxy hóa gossypol. 1.4.3. Phương pháp 3: Nguyên liệu: Nhân hạt của cây bông Gossypium hirsutum, giống 43-04. - 13 - Phương pháp: Sử dụng phương pháp Carruth [9], nguyên liệu được chiết bằng ether dầu nhiệt độ sôi thấp để loại dầu béo, rồi chiết gossypol bằng DEE. Dịch chiết DEE thêm acid acetic bãng để kết tinh thu G-AA. Mô tả; Nguyên liệu được chiết với ether dầu có nhiệt độ sôi thấp trong 48 giờ để loại hết dầu béo, lượng dung môi gấp 10 lần nguyên liệu (v/w). Tiếp đó, bã nguyên liệu được tiếp tục chiết bằng DEE trong 24 giờ, lưọng DEE gấp 8 lần nguyên liệu. Dịch chiết DEE thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến còn một thể tích thích hợp. Phần dịch chiết DEE đã cô đặc được đem lọc, rồi thêm acid acetic băng. Đe kết tinh qua đêm trong tủ lạnh. Sau đó lọc thu tinh thể và rửa tinh thể bằng hexan. Hiệu suất của quá trình trên là 0,45%. Tuy nhiên sản phẩm thu được vẫn có màu hơi nâu. Do đó, tác giả đã tiến hành kết tinh lại 3 lần nữa trong điều kiện như trên, thu được sản phẩm G-AA có màu vàng sáng, hiệu suất đạt 0,28% [30]. Nhận xét: - ư u điểm: Phưong pháp đơn giản, dễ thực hiện. - Nhược điểm: sử dụng tốn dung môi, và các dung môi đều dễ cháy nổ, không được sử dụng trong sản xuất lớn. Cụ thể, tác giả chiết 1 ,5 kg nguyên liệu cần đến 15 lít ether dầu, 12 lít DEE và 0,4 lít acid acetic băng cho giai đoạn kết tinh. Mặt khác, thời gian chiết dài có thể làm tăng khả năng sản phẩm bị oxy hóa. Giai đoạn kết tinh yêu cầu thực hiện trong thời gian dài, và ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh), điều này khó thực hiện được ở qui mô sản xuất lón. 1.4.4. Phương pháp 4: Nguyên liệu: Bột nhân hạt bông của cây bông Gossypium barbadense
- Xem thêm -