Tài liệu NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thanh Hương NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh-2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thanh Hương NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh-2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Việc tham khảo nghiên cứu của các tác giả khác đều được trích dẫn rõ ràng. TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thanh Hương LỜI CẢM ƠN Hoàn thành được luận văn và được bảo vệ luận văn, em xin gửi đến Cô, PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương lời cảm ơn sâu sắc nhất. Em xin cảm ơn Cô. Con cảm ơn Mẹ đã cho con một chỗ dựa vững chắc để con có thể vượt qua mọi khó khăn. Em xin cảm ơn chị hai, anh rể và các cháu đã luôn ủng hộ em cả về tinh thần và vật chất để em có được ngày hôm nay. Em cảm ơn chị hai đã luôn ở bên em. Em cảm ơn Cô Minh Tâm đã giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn đến Cô Ly Tao, cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình em tiến hành thực nghiệm tại đây. Em xin cảm ơn các Thầy, Cô đã tham gia giảng dạy lớp Cao học Sinh học Thực nghiệm K23, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã ở bên tôi. Xin chân thành cảm ơn. TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thanh Hương MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 3 1.1. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine ............................................................................ 3 1.1.1. Khái niệm ...................................................................................................... 3 1.1.2. Quá trình lên men .......................................................................................... 3 1.1.3. Các hình thức lên men ................................................................................... 3 1.2. Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum ....................................................................11 1.2.1. Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại ......................................................... 12 1.2.2. Đặc điểm sinh lý .......................................................................................... 13 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa ....................................................................................... 13 1.2.4. Đặc điểm di truyền ...................................................................................... 14 1.3. Amino acid L-lysine ....................................................................................................16 1.3.1. Đặc điểm ...................................................................................................... 16 1.3.2. Vai trò và ứng dụng ..................................................................................... 17 1.3.3. Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn .................................................................... 19 1.3.4. Bản chất quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở vi khuẩn Corynebacterium glutamicum ...................................................................... 20 1.3.5. Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum ................................................................................................... 23 1.4. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài ................ 26 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 29 2.1. Nguyên liệu .................................................................................................................. 29 2.2. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................................... 33 2.2.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống ............................................ 33 2.2.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm .......................... 33 2.2.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine ................................................................................................ 35 2.3. Phương pháp phân tích thí nghiệm ............................................................................. 36 2.3.1. Phương pháp vi sinh .................................................................................... 36 2.3.2. Phương pháp hóa sinh ................................................................................. 38 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 39 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................................... 40 3.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống ........................................................... 40 3.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm ............................................................ 42 3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine .50 3.3.1. Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất ............................................... 50 3.3.2. Khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất................................................................. 53 3.3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine ................................................................................................ 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 65 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích ...............................................................................29 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài ................................................................30 Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài...........................................31 Bảng 2.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc .....................................................................34 Bảng 2.5 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu ...........34 Bảng 3.1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 ...............40 Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc ......................................................................42 Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát ....................................................43 Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khởi đầu ......................................................................44 Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu ..................................................45 Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD ..........46 Bảng 3.7 Khả năng sử dụng đường của Corynebacterium glutamicum ...................52 Bảng 3.8 So sánh lên men batch và fed-batch........................................................... 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên môi trường phức hợp. (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét . ............................................................................................................. 12 Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 . .......................... 15 Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα và lysCβ được cấu tạo bởi bốn chuỗi poplypeptide giống hệt nhau . ......................... 16 Hình 1.4 Cấu trúc không gian và cấu tạo phân tử của lysine ..................................... 17 Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine ở vi khuẩn. ................ 20 Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine ở Corynebacterium glutamicum .............. 21 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ......................................................................... 32 Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) và hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b). .................. 41 Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể hiện sự ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp lên lượng L-lysine ........................................................................................ 48 Hình 3.3 Đồ thị tối ưu ................................................................................................. 49 Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong lên men batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine ............................... 50 Hình 3.5 Khả năng hình thành sinh khối, L-lysine và lượng đường sót khi nuôi cấy Corynebacterium glutamicum ở các nồng độ glucose khác nhau ......... 54 Hình 3.6 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum-B-0632 .................. 57 Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine trong lên men batch và fed-batch ................ 58 Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả năng sinh trưởng của Corynebacterium glutamicum trong lên men batch và fed-batch ................................................................. 59 Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót trong lên men batch và fed-batch ............. 60 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Amino acid rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của người và động vật, đặc biệt là các amino acid không thay thế. Sự thiếu hụt amino acid nói chung và các amino acid không thay thế nói riêng sẽ dẫn đến tình trạng bệnh lý. L-lysine là một amino acid thuộc nhóm không thay thế được quan tâm nhiều hơn cả, vì có nhu cầu khá cao, nhưng lại thường bị thiếu hụt nhất trong khẩu phần ăn. Mặt khác, L-lysine dễ bị phân hủy trong quá trình chế biến thức ăn và cơ thể tuyệt đối không tổng hợp được. Do đó, thiếu Llysine rất phổ biến, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Thiếu L-lysine làm giảm tổng hợp protein cơ thể, trẻ biếng ăn, chậm lớn, thiếu men tiêu hóa…. Hiện nay, việc sử dụng công nghệ vi sinh để sản xuất L-lysine là hướng đang được quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, quy trình sản xuất vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm, số lượng các nghiên cứu về sản xuất L-lysine còn ít, chủng giống chưa đạt chuẩn, năng suất thấp [1]. Với mục tiêu cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine, chúng tôi chọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch. Đây là lý do chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine từ chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum-B-0632. 3. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống Đại học Quốc Gia Hà Nội. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống. 2. Tối ưu hóa môi trường lên men thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. 3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine. 2 5. Phạm vi nghiên cứu Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng trong lên men batch, tạo tiền đề cho bước đầu khảo sát lên men fed-batch gián đoạn thu nhận L-lysine ở quy mô phòng thí nghiệm. 6. Đóng góp của luận văn Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các thông số tối ưu của quá trình lên men batch và bước đầu thử nghiệm lên men fed-batch. Kết quả này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn Về mặt khoa học: đề tài góp phần khẳng định ưu điểm của phương pháp lên men fed-batch trong lên men tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thu nhận amino acid L-lysine. Về mặt thực tiễn: cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine 1.1.1. Khái niệm “Lên men” là thuật ngữ được sử dụng từ khá lâu, có nguồn gốc từ tiếng La tinh “fervere” có nghĩa là “làm chín” để chỉ hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây hoặc ngũ cốc. Trong lĩnh vực hóa sinh, lên men được hiểu là sự tạo thành năng lượng từ các quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, trong lĩnh vực vi sinh vật học, cụm từ này lại được dùng để chỉ chung cho quá trình tạo ra sản phẩm bằng cách nuôi cấy vi sinh vật thích hợp [28]. 1.1.2. Quá trình lên men Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kỵ khí. Quá trình lên men bắt đầu từ sự phân giải các hợp chất chứa carbohydrate thành đường glucose và kết thúc là sự tạo thành CO2 và một số hợp chất chứa carbon chưa được oxy hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic,... Người ta thường dùng tên sản phẩm điển hình tích lũy trong từng loại lên men để gọi quá trình lên men ấy. Ví dụ, quá trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic thì gọi là lên men lactic (muối dưa, cà, làm sữa chua). Tuy nhiên, có nhiều vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa không hoàn toàn cơ chất tạo ra những sản phẩm giống như lên men kỵ khí, quá trình này cũng được gọi là lên men mà thực chất là oxy hóa hiếu khí. Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men, vì đã tạo ra những sản phẩm có giá trị [2]. 1.1.3. Các hình thức lên men Tùy theo cách phân loại mà có nhiều hình thức lên men khác nhau: Theo tính chất môi trường: lên men dạng lỏng, lên men dạng rắn và bán rắn. Theo đặc tính sử dụng oxy của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí và lên men kỵ khí. Theo trạng thái: lên men tĩnh (không khuấy trộn hay sục khí) và lên men động (có khuấy trộn hoặc sục khí). Theo mức độ kiểm soát của quy trình: lên men có kiểm soát (kiểm soát độ tạp nhiễm, nồng độ cơ chất, pH…) và lên men không kiểm soát (tự nhiên). 4 Theo kỹ thuật lên men: lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục (continous) và lên men dạng bán liên tục (fed-batch hay dạng mẻ có bổ sung). Trong phần này, chúng tôi sẽ đề cập sâu hơn đến ba kỹ thuật lên men, đó là lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục và lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fedbatch). 1.1.3.1. Lên men theo mẻ Lên men theo mẻ hay còn gọi là lên men batch. Đây là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian nuôi cấy, ta không thêm vào chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất, ngoại trừ ammoniac được thêm vào để điều chỉnh pH (nếu có) [12], quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng không gian nhất định. Vi sinh vật bắt buộc phải trải qua các pha sinh trưởng: pha lag, pha log, pha ổn định và pha suy vong [2, 28]. Trong giai đoạn đầu (pha lag), gần như không có sự tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là sự thích nghi của tế bào với môi trường mới. Trong thực tế sản xuất, cần phải rút ngắn thời gian của pha này càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào pha tăng trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn. Sau giai đoạn thích nghi là giai đoạn tăng trưởng và dần đạt đến tốc độ tối đa (pha log) [28]. Sự tăng trưởng trong pha log được biểu diễn theo phương trình sau: dx/dt = µx (1.1) Trong đó: x là sinh khối vi sinh vật tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc độ tăng trưởng (/giờ). Hằng số µ khác nhau tùy vào từng giai đoạn trong chu kỳ tăng trưởng. Từ phương trình (1.1) ta có: dx/x = µdt  𝑡 𝑡 ∫𝑡𝑡 𝑑𝑑/𝑥 = µ ∫𝑡𝑡 𝑑𝑑  lnxt – lnxto = µ(t-to) Trong đó, xto là lượng sinh khối ban đầu, xt là lượng sinh khối sau khi nuôi cấy t giờ. Trong pha log, chất dinh dưỡng còn nhiều, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật trong điều kiện tối ưu nhất sẽ có µmax khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc rất lớn 5 vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và các sản phẩm do quá trình sinh trưởng của chính vi sinh vật tạo ra. Nếu duy trì việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy ở pha log thì tăng trưởng vẫn đạt được tốc độ cao. Sự tăng số lượng tế bào trong pha log diễn ra theo cấp số nhân với cơ số 2 theo phương trình sau: N = N0. 2n Với N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ  lg(N/N0) = n.lg2  n = lg(N/N0). 1/0,301  n = lg(N/N0). 3,32 Thời gian thế hệ được tính bằng công thức sau: tg = t/n với t là thời gian vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ. Hằng số tốc độ phân chia K là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy: K = n/t Pha cân bằng, lượng sinh khối tạo thành có thể được tính bằng công thức: x = Y.(si – sr) Trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm lượng cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại. Sự tăng trưởng sẽ ngừng lại (µ =0) khi sr = 0 hoặc trong môi trường nuôi cấy có sự tích lũy những chất độc đối với vi sinh vật. Giá trị Y giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một đơn vị cơ chất thành sinh khối vi sinh vật. Có thể dùng Y để tính toán một lượng cơ chất cần thiết để thu được một lượng sinh khối nhất định. Y thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy như: nhiệt độ, pH, lượng oxy, giới hạn nồng độ cơ chất…Theo Monod (1942), sự suy giảm tăng trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào hàm lượng cơ chất được thể hiện qua phương trình: µ = µmax. sr/(Ks+sr) Trong đó, Ks là hằng số sử dụng cơ chất. Khi sr = 0 thì µ = 0, nghĩa là vi sinh vật bước vào giai đoạn cân bằng trong chu kỳ sinh trưởng. Đối với một cơ chất nhất định, mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau [28]. 6 Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa. Nguyên nhân là do điều kiện bất lợi của môi trường như: nguồn dinh dưỡng cạn kiệt làm giảm quá trình trao đổi chất, sự tích lũy một số sản phẩm trao đổi chất gây độc cho vi sinh vật (acid) và một số enzyme (amilaza, proteinaza…) ngoài chức năng xúc tác các quá trình tổng hợp còn tham gia vào quá trình phân giải tế bào vi sinh vật. Các nguyên nhân trên dẫn đến sự chết của hàng loạt các tế bào [2]. Kỹ thuật lên men theo mẻ (batch) được sử dụng để sản xuất sinh khối, sản phẩm sơ cấp và sản phẩm thứ cấp. Hiện nay, phương pháp này vẫn đang được sử dụng phổ biến do có một số ưu điểm sau: đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổ sung thêm bất kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, vì vậy, giảm khả năng bị nhiễm cũng như chi phí. Tuy nhiên, phương pháp này cho sản lượng thấp do vi sinh vật không được cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanh chóng bước vào pha suy vong khi nguồn cơ chất cạn kiệt. Để nâng cao sản lượng, ta cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng trong suốt pha sinh trưởng của vi sinh vật. Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) và lên men liên tục đã khắc phục được nhược điểm của lên men theo mẻ. 1.1.3.2. Lên men liên tục Trong nuôi cấy theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua 4 pha tuần tự: pha thích nghi (pha lag), pha tăng trưởng (pha log), pha cân bằng và pha suy vong, nhưng đối với nuôi cấy liên tục, pha log được duy trì bằng cách bổ sung liên tục nguồn dinh dưỡng vào nồi lên men và một lượng dịch chứa vi khuẩn tương ứng được lấy ra. Khi đó, tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu [28]. Dòng chất dinh dưỡng nạp vào nồi lên men có liên quan đến thể tích nồi lên men theo tốc độ pha loãng giới hạn (D) theo công thức sau: D = F/V Trong đó, F là tốc độ nạp liệu (L/giờ), V là thể tích nồi lên men (L), D là tốc độ pha loãng hay hệ số pha loãng. Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ [2]. Tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong nồi lên men được biểu diễn qua phương trình: v+ = dx/dt = µx 7 Nếu vi sinh vật ngừng sinh trưởng, phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi nồi lên men với tốc độ: v− = - dx/dt = Dx Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi sinh vật trong nồi lên men trong nuôi cấy liên tục là sự chênh lệch giữa tốc độ tăng v+ và tốc độ giảm v−: v = v+ - v− = (µ-D)x Nếu µ>D thì v mang giá trị dương, nghĩa là mật độ vi sinh vật tăng. Ngược lại, nếu µ> Ks nên trong thực tế, sr thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái cân bằng ổn định, D < µmax và Ks << si [28]. b. Lên men theo mẻ có bổ sung không thay đổi thể tích Đối với hình thức lên men theo mẻ có bổ sung thay đổi thể tích, cơ chất được bổ sung với nồng độ cao nên không làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men. Động học hệ thống này được thể hiện qua phương trình: dx/dt = G.Y trong đó, G là tốc độ nạp cơ chất. Do dx/dt = µx nên: µx = GY  µ = GY/x Nếu GY/x <µmax thì khi nạp thêm cơ chất sẽ được sử dụng ngay. Tuy nhiên, do dx/dt > 0 nên: 10 xt = x0 +G.Y.t Ngoài cách phân loại trên thì lên men theo mẻ có bổ sung còn được phân loại theo kiểu nạp cơ chất, đó là lên men theo mẻ bổ sung liên tục và bổ sung gián đoạn. Đối với lên men theo mẻ bổ sung liên tục, chất dinh dưỡng trong bình dự trữ được nạp vào bình lên men với tốc độ không đổi. Nhờ hệ thống thông khí và khuấy cơ học, bình lên men được cung cấp đầy đủ oxy, đảm bảo việc phân bố nhanh và đồng đều chất dinh dưỡng trong dòng môi trường đi vào. Đối với lên men theo mẻ bổ sung gián đoạn, chất dinh dưỡng mới được bổ sung vào bình lên men theo từng thời điểm đã được khảo sát. Hình thức lên men theo mẻ có bổ sung đã giải quyết được một số nhược điểm của lên men theo mẻ: Trong công nghệ lên men amino acid thường đòi hỏi hàm lượng cơ chất cao để thu được sản lượng cao. Hàm lượng đường cao trong dịch nuôi cấy ban đầu sẽ ức chế sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn hoặc làm giảm lượng sản phẩm do sự hình thành các sản phẩm khác như acetate và lactate. Nếu bắt đầu quá trình nuôi cấy với hàm lượng đường thấp và bổ sung theo thời điểm thì pha lag có thể được rút ngắn, từ đó làm tăng sản lượng. Đối với những chủng đột biến khuyết dưỡng, nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu quá cao sẽ làm tế bào sinh trưởng quá mức hoặc gây ra ức chế ngược, làm giảm sản lượng. Trong trường hợp này, việc bổ sung chất dinh dưỡng theo mẻ với tỷ lệ nhất định sẽ giúp thu được sản lượng tối đa. Hình thức này đã được sử dụng trong nuôi cấy chủng Corynebacterium glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng thu L-phenylalanine và Ltyrosine. Nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu cao gây ra sự phát triển quá nhanh của vi sinh vật ở pha log, dẫn đến nhu cầu oxy của chúng vượt quá lượng oxy hiện có trong bình lên men, làm giảm sản lượng. Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung giúp giữ hàm lượng cơ chất ở mức dưới ngưỡng ức chế để cấp cho vi sinh vật trong quá trình sinh tổng hợp. Lên men theo mẻ có bổ sung giúp giảm được vấn đề về nhiễm và đột biến so với lên men liên tục, đạt năng suất cao hơn so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất. Có nhiều nghiên cứu sản xuất amino acid được tiến hành bằng hình thức lên men vi sinh 11 vật theo mẻ có bổ sung. Kết quả cho thấy, lượng amino acid thu được bằng hình thức này cao hơn nhiều so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất [12]. Tuy nhiên, lên men fed-batch dạng liên tục đòi hỏi phải có thiết bị để kiểm soát các yếu tố trong quá trình lên men, đồng thời đòi hỏi kỹ năng vận hành thiết bị lên men, điều khiển quá trình. Các yếu tố cần được kiểm soát trong khi vận hành hệ thống là: tạp nhiễm, sự tăng trưởng tế bào, pH, nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan, kiểm soát bọt, tốc độ nạp liệu. Có thể nói, hình thức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) đã khắc phục được một số nhược điểm của lên men dạng mẻ và lên men liên tục. Bên cạnh đó, qua tổng quan tài liệu, chúng tôi nhận thấy hình thức này phù hợp với mục đích thu nhận amino acid L-lysine từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum. Vì vậy, chúng tôi chọn hình thức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) để nâng cao năng suất thu nhận L-lysine trong đề tài này. 1.2. Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum được biết đến đầu tiên với vai trò là chủng chuyên sản xuất acid glutamic, được phát hiện bởi một nhóm các nhà nghiên cứu người Nhật vào giữa những năm 1950. Đầu tiên, Corynebacterium glutamicum có tên gọi Micrococcus glutamicus No.534, sau này đổi thành Corynebacterium glutamicum [9]. Nghiên cứu sâu hơn về Corynebacterium glutamicum, các nhà khoa học đã khám phá ra rằng, ngoài khả năng tiết acid glutamic, Corynebacterium glutamicum còn tiết nhiều loại amino acid khác vào môi trường nuôi cấy như: lysine, methionine, arginine, threonine… Ngày nay, Corynebacterium glutamicum là một trong những vi khuẩn quan trọng trong công nghiệp, sản xuất 2 triệu tấn amino acid mỗi năm, trong đó có khoảng 0,6 triệu tấn L-lysine [9]. Các nghiên cứu về Corynebacterium glutamicum vẫn đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước thực hiện với mục đích nâng cao năng suất thu nhận amino acid, chủ yếu dựa trên kỹ thuật di truyền. 12 1.2.1. Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại Dưới kính hiển vi phóng đại 400-1000 lần, tế bào Corynebacterium glutamicum có dạng hình que ngắn điển hình, không đều. Tế bào sắp xếp dạng hình chữ V, một số xếp song song, không di động, không hình thành bào tử [9]. Tế bào bắt màu tím khi nhuộm Gram và cho hiện tượng kéo sợi khi phản ứng với dung dịch KOH 3%, chứng tỏ Corynebacterium glutamicum thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+). Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch có dạng tròn đầy, trơn bóng, màu vàng nhạt, kích thước 1-1,5 mm (sau một ngày nuôi cấy). (a) (b) Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên môi trường phức hợp. (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét [9]. Cấu tạo tế bào vi khuẩn có một lớp peptidoglycan dày, vách tế bào chứa arabino galactan và acid mycolic có 26-36 carbon. Hàm lượng G:C là 54,1% [12]. Vị trí trong hệ thống phân loại của Corynebacterium glutamicum [37]: Giới (kingdom): Bacteria Ngành (phylum): Actinobacteria Lớp (class): Actinobacteria Bộ (order): Actinomycetales Họ (family): Corynebacteriaceae Chi (genus): Corynebacterium Loài (species): Corynebacterium glutamicum