Nghiên cứu Proteinaza và chất ức chế Proteinaza ở sâu xanh (Heliothis Armigera)

  • Số trang: 138 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 30 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

ì i V / f i . ;>i DAI HOC QUÓC GIÀ HA NÓI Tnròng Dai hoc Khoa hoc Tìi nhien Trình Hong Thài NGHIÈN CÙU PROTEINAZA VA CHAT ÙC CHE PROTEINAZA Ò SAU XANH (Heliothis armigera) Chuyèn ngành : Sinh ly hoc dòng vàt Ma sé : 10516 LUAN AN PHO TIEN SY KHOA HOC SINH HOC Ngiròi hifóng dàn khoa hoc: 1. GS.TS. niam TM Tran Chàu (hiTÓng din chinh) 2. PGS.PTS* Trinh Hflù Hang (hiróng dàn phu) 3. PTS, Nguyln Yèn (hiTÓng dàn phu) f!^';':0<'^' Ha noi -1995 BANG CÀc CHU VIET TAT VA KI HIEU ATEE : N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester BApNA: N-benzoy1-DL-arginine p-nitroani 1ide BI: ch^t ÙC che' bromelain DC: dich chié't DCN: dich chié't nhóng DMTN: dich màu tién nhóng HaP6-I; HaP6-Il: proteinaza cùa sàu xanh tuoi 6 HaP5-I; HaP5-II: proteinaza cùa sàu xanh tu^i 5 HBR: ho9t dò riéng lU; ddn vi ùc che enzim KI: chat ùc che kimotripxin KIA: ho^t dò ùc che kimotripxin PA: hogit dò proteolitic PAGE : dién di trèn gel poliacrilamit PI : chat ùc che proteinaza PIA: ho^t dò ùc che proteinaza PMSF: PhenyImethane sulfony1fluoride PPI: protein ùc che proteinaza PSI: ch^t ùc che' proteinaza cùa sàu TIA: ho^t dò ùc che' tripxin TI: ch^t ùc che' tripxin TECK: Na-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone TPCK: N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone U: ddn vi enz im M V C L V C trang MÒ dàu 1 Phàn I , Tò'ng quan tal li^u I. Proteinaza 3 3 1 . B$ii ciidng ve proteinaza 3 2.ProteinazaÒcòntrùng 7 2.1. Proteinaza tièu hoà 7 2.1.1. He thò'ng òng tièu hoà Ò con trùng 7 2.1.2. Proteinaza ruòt giùa cùa con trùng 9 2.1.3. Kièm soàt sU tièt càc proteinaza tièu hoà 17 2.2. Proteinaza trong sV phàt trièn cùa con trùng 19 2.2.1. S\l tàng trUÒng va phàt triè'n Ò con trùng 19 2.2.2.Proteinazalysosom 20 II. Ch^t ùc che' proteinaza 23 1. B^ì 23 cUdng ve chat ùc che proteinaza 1.1. Mot s6 tinh ch^t va eà'u trùe cùa phàn tù PPI 24 1.2. Cd che tiidng tàc giùa chat ùc che Proteinaza va prote inaza 26 2. Ch^t ùc che' proteinaza b con trùng 27 2.1. Sarcocystatin 28 2.2. Ch^t ùc che' proteinaza xerin 29 2.2.1. Ch^t ùc che' lo^i Kunitz 29 2.2.2. Ch^t ùc che' Serpin 29 2.3. Vai trò cùa chélt ùc che' proteinaza 32 3. Ung d\ing cùa ch^t ùc che proteinaza 33 Phàn II. Nguyèn li^u va phUdng phàp 35 I. Nguyèn 1iéu 35 II. Hoà chà't va thiét bi thi nghi^m 36 III. PhUdng phàp 36 I. Biéu che' thuó'c thù Fo 1 in-Ciocal teau 2.Xàcdinhho9tdòenzim 36 37 2.1. Xàe dinh ho^t dò proteolitic theo phUdng phàp Anson cài tié'n 37 2.2. xàe djnh ho^t dò phàn giài BApNA theo phUdng phàp Erlanger 38 2.3. xàe djnh ho^t dò proteolitic b^ng phUdng phàp khuyè'chtàndiath^ch 3. X à c d j n h d ò b é n v ó i n h i ^ t 38 eùaenzim 39 4. X à c d j n h n h i ò t dò t h i c h h p p c ù a e n z i m 39 5. Xàe dinh pH thich h0p 39 6. Xàe dinh dò ben vói pH 40 7. xàe dinh ành hUÒng cùa càc ion kim lo^i va càc chat klm hàm d^e hiéu nhóm 40 8. xàe dinh ho§it dò ùc che' enim 40 9. xàe dinh protein theo phUdng phàp Lowry 40 10. Biòn di trèn gel poliacrilamit 41 II. Biòn di trèn gel poliacrilamit 7,5%, pH8,3 co ed chà't theo phUdng phàp Hanspal cài tièn 44 12. Xàe dinh proteinaza bÈng. dién di SDS-PAGE co ed chKt 44 13. Tinh s^ch proteinaza va eh^t ùc che' proteinaza 45 Phéìn III. Ké't qua va bàn lu^n 47 1. S\l bièn dòi cùa proteinaza va chStt ùc che' proteinaza trong qua trình bièn thài tù àu trùng dèn con trUÒng thành 47 1.1. Ho§it dò proteolitic va antiproteolitic trong giai doginàutrùngvàtiénnhòng 47 1.2. Ho§it dò proteolitic va antiproteolitic trong giai do^innhòngvàcontrUÒngthành 1.2.1. Hàm lU0ng protein, TIA, 51 KIA trong qua trình bièn thài tù nhòng dèn con trUÒng thành 51 1.2.2. Ho^it dò proteolitic trong qua trình bièn thài tùnhòngdè'ncontrUÒngthành 57 2. Tinh sg-ch va nghièn eùu mot so tinh chat cùa proteinaza Ò sàu xanh 63 2.1. Anh hUÒng cùa mot so yèu tò dèn ho§it dò proteolitic cùa dich chié't sàu tuò'i 5 63 2.1.1. Ành hUÒng cùa pH va nhi^t dò dè'n ho^t dò proteoii t ic 63 2.1.2. Bò ben vói nhi^t 65 2.1.3. Bò ben vói pH 66 2.1.4. Anh hUÒng cùa mot so ion kim lo^i hoà tri 2 mot so' chat khàc dèn ho?it dò enzim 2.2. Tinh s^ch proteinaza va nghièn eùu mot so cùa ehùng 2.2.1. Tinh S9ch proteinaza cùa sàu xanh va 67 tinh chÉlt 70 70 2.2.2. p H t h i c h h 0 p c ù a e n z i m 76 2.2.3- Anh hUÒng cùa ion kim lo^i va mot so chat khàc dénho§itdòenzim 76 2.2.4. Tinh d^c hi^u ed eh^t cùa HaP6-I va HaP6-II 3. Sy phàn b^ cùa ch^t ùc che' proteinaza Ò 77 càc phàn khàc nhau cùa ed thè' tién nhòng sàu xanh 85 4. Phò dién di càc PI trong dich chièt tù nhòng va càc phàn khàc nhau cùa ed thè' tién nhòng sàu xanh 87 5. Tinh S9ch chat ùc che' tripxin tù tién nhòng va nhòng sàu xanh 89 Phàn IV. Kè't luàn va de nghi 102 A. Kè't luàn 102 B. Bé nghi 104 Phàn V. Tài liòu tham khào 106 l^JKXJ MCJ (Heliothis Sàu xanh armigera) là thuòc bò Lepidoptera, tUdng dòi phd thè giói. O nuóc ta, sàu xanh là sàu vi vày nò là d6i tU0ng phòng trong bòng. Ngoài biè'n Ò nhiéu sàu nUÒc trèn h^i bòng nghièm trpng, trù dàng cày bòng, con trùng gay h^i luu y xanh con trong càc vùng gay h^i càc cày tróng khàc nhU thàu dàu, thu6c là, cà chua, dàu d6, cày ngò... Trong nhùng nàm gàn day, h^i ngUdi ta dà sù dyng thuòc hoà hpc ngày thành di eh mòi de' kié'm nhiéu lo^i thuòc càng nhiéu, càng nghièm khòng soàt con trùng gay hoà hpc. Vi^c h0p ly trpng hdn. dùng làm phàt s inh Ngoài viéc dùng thuòc qua nhiéu gay khà nàng khàng thuòc cùa sàu, thi thuòc hoà hpc dà phà vd ckn bang cùa ky sinh thién djch va sàu h^i trong t\l nhièn, làm cho sàu h^i co diéu kién phàt trièn tu do vi màt yèu t6 kim hàm [11]. Vi^c dùng thuòc hoà hpc con gay nèn nhùng vlLn de nghièm trpng ve mòi trUÒng, dèn sue khoè con nguòi. Vi vày» phàp mòi co hiéu qua hdn va diéu này co ành hUÒng x^u nguói ta dà di tim nhùng bi^n it gay h$ii dèn mòi trUÒng nhU sÙ dyng càc che' phàm sinh hpc de trù sàu h^ii cày trÒng: che' phàm virus Nuclea Polyhydrosis virus (NPV) dà dU0e Vi^n bào v^ th^c vàt nghièn eùu va àp dyng co hi^u qua. . . Nàm 1973, Ryan [145] dà phàt hién ra cùa thUc vàt nhd chat ùc che proteinaza, khà nàng bào ve sau dò là nghièn eùu cùa nhiéu tàc già khàc [38,70] dà thùc d^y tim kiè'm mot phUdng phàp mòi de kiè'm soàt con trùng gay h^i dila trèn khà nàng ùc che proteinaza bòi càc eh^t ùc che' cùa ehùng. vi vày» nghièn eùu ed bàn ve sàu khòng ehi eó y nhùng nghia khoa hpc ma con co y nghia th^c ti^n. Hién nay, trèn thè' giòi cùng nhu ò dang là d6i tU0ng dU0e quan cày tróng cùa ehùng tàm nhiéu do cùng nhU khà nàng phòng thi nghièm de sÙ dyng cho nhùng nUòe ta sàu xanh tinh chlit phà nuòi thuàn ve màt sinh hoà nói proteinaza va chat ùc che proteinaza cùa này t^o diéu kién cho vi^c proteinaza tù thUc vàt co trùng. Màt khàc, tim chung càn phài eó cùng nhU càc sàu. Nhùng hièu blè't kiè'm càc tàc dyng ùc cliè chÉit ùc che' proteinaza cùa con nhùng phàt hién ve ch^t ùc che' proteinaza Ò con trùng con bò sung cho càc nghièn eùu ùc che proteinaza l0i trong thù nghièm ve thu6c trù sàu. 9é co Cd sò phòng trù mot càch eó hi^u qua, nhùng hièu bièt ho^i làm ed sÒ cho diéu tra ve càc chllt nhùng nghièn eùu ùng dyng ehùng. ehùng tòi nhàn de va chat ùc che proteinaza tài luàn àn "Nghièn Ò sàu eùu proteinaza (Hel iothis xanh armigera)'* nh^m gòp phàn nghièn eùu ed bàn ve sàuxanh vói m\ic dich sau: - Nghièn eùu proteinaza va ch?lt ùc che' proteinaza trong qua trinh phàt trièn va bièn thài cùa sàu xanh. - Tim hièu proteinaza va ch^t ùc che' proteinaza Ò sàu xanh làm co sÒ cho nhùng thù nghièm ve thuòc trù sàu. Phàn I éO TONG QUAN TAI LI^U I. Proteinaza 1. Bai cUdng ve proteinaza Proteinaza là enzim xùc tàc cho càc lién ké't peptit trong càc qua trinh thu^ peptìt hoàc trong phàn protein theo phàn ùng: -CH-C-N-CH- + H2O I II I I R O H R' > -CH-C-OH + HN-CHI II II R O H R' Trong càc proteinaza, enzim tièu hoà dU0c nghièn eùu som hdn cà. Ngay tù thè' k^^ 18, nhà tU nhièn hpc ngUÒi Phàp là Reomur dà phàt hién ra trong dich d^ day cùa chim tàc dung tièu hoà dò nhiéu thit. Sau àn thit co proteinaza Ò dòng vàt, thUc vàt va vi sinh vàt dà dL(0c phàt hié-n. Viéc phàn lo^i va gpi tèn càc enzim xùc tàc ùng thui^ phàn protein cùng thay dòi qua càc thòi - Theo Grassmann va Dyekerhoff (1928), cho phàn ky [24]: càc enzim nhóm này dU0e chia ra nhu sau: Pròteaza 1 Proteinaza Peptidaza - Theo Bergmann va chia thành 2 nhóm: . , Endopeptidaza Ross (1936), peptidaza I51Ì dU0c Pept idaza ^ ' , Exopeptidaza - 4 - Theo Barrett va Donald (1986): Peptidaza (Pròteaza) [ I 1 Endopept idaza Exopeptidaza (Proteinaza) Nàm 1960, Hartley [83] phàn chia proteinaza thành nhóm theo ed che' xùc tàc. NhUng do nhùng hoà hpc trung tàm xùc tàc cùa nhóm 4 hiè'u bié't mòi ve màt này nèn Barrett [24] da thay dòi cho phù h0p va dU0c u5^ ban danh phàp hoà sinh quo e tè' còng nhàn ( 1984). Theo Barrett [24], nhóm nhò. Tèn càc nhóm trpng nh^t co vai trò proteinaza dU0c phàn chia thành 4 này xùc bao tàc gòm tèn cùa axit amin quan trong (TTHB): proteinaza xerin (EC.3.4.21); trung tàm ho$it dòng proteinaza xistein (EC. 3.4.22); proteinaza aspartic (EC.3.4.23); proteinaza kim lo^ii (EC. 3.4.24). * Proteinaza xerin: cùa gdc axit amin xerin trong trpng óéì vói ho$it dóng xùc là nhùng proteinaza eó nhóm -OH TTHB co vai trò dàc bi^t quan tàc cùa enzim. Thuòc nhóm này co càc enzim nhU tripxin, kimotripxin,... Tripxin, kimotripxin bi ùc che' m^nh duòi tàc dyng cùa DFP (diizopropy1f1uorophosphate) va nhiéu protein dàc hiéu khàc nhu ch^t ùc che' tripxin dàu tUdng. càc proteinaza kiém va co tinh xerin dàc hiéu thuòng tUdng dò'i ho^it dòng róng. Tinh m^tnh b vùng dàc hiéu cùa ehùng thè' hi^n ve phia gó'c kè't bi phàn giài. peptit chùa nhóm Vi dy -CO- axit amin chùa nhóm -CO- nhU tripxin cùa càc thuj^ phàn cùa lién càc lièn k^t axit amin kiém (Lys, Arg), kimotripxin xùc tàc phàn ùng thu^ phàn lièn kèt peptit co nhóm -CO- cùa càc axit amin thdm, * Proteinaza xistein: càc proteinaza thuòc co nhóm -SH trong trung tàm ho$it dòng. Nhóm bièt trong chùc nàng cùa phàn tÙ enzim vi -SH co vi tri dàc nò eó khà nàng phàn ùng cao, tham già nhiéu lo^i bièn dòi hoà photphoril hoà, ankyl hoà. Vai ò xi hoà, trong phàn tÙ enzim th^ hi^n Ò nhiéu màt: trung gian enzim-cd chat, nhóm này hpc nhU axit hoà, trò cùa nhóm -SH t^o thành phùc chat s\l kèt h0p vói ed chat va cofaetor, duy tri càc càu d^ing ho^t dòng cùa enzim. càc proteinaza trung tinh, co xistein tinh dàc hi^u ròng. dU0c khi nhóm -SH trong TTHB cùa càc eh^t nhu xistein, thUÒng ho^t dòng m^inh Ò pH Proteinaza ehi ho^-t dòng nò khòng bi bao vày. Do dò axit ascorbie b nÒng dò xàe dinh thUÒng eó tàc dyng làm ben, ho^it ho a enzim này. Mot SÒ mu6i kim lo^i nàng, dàc bi^t là càc mu6i thuj- ngàn nhu p-chloromercuribenzoate (PCMB) va càc eh^t iodoaxetamit eó tàc dyng ùc che khàc nhU càc proteinaza xistein. Chung bj ò xi hoà duòi tàc dyng cùa càc ch^t ò xi hoà nhU iot, H3O2. .. EDTA co khà nàng kè't h0p vói càc ion kim lo^i trong dung dich, vi vày thuòng làm tàng dò ben cùa proteinaza xistein. * Proteinaza aspartic: cacboxyl trong TTHB. càc là nhùng proteinaza chùa nhóm nhóm eacboxyl này thuftc m^ch R cùa Asp, giù ho^e cùng co thè' polipeptit. Chung dóng vai càc proteinaza là nhóm cacboxyl dàu trò xùc tàc aspartic C cùa chu6i trong TTHB cùa enzim. thUdng ho^it dòng m^inh Ò pH axit. Chung bi ùc che' bòi diazoacetylnorleucine methyl (DNME). Chung eó tinh dàc hiéu é6ì phia cùa lièn kè't peptit bi vói càc phàn ester axit amin Ò cà hai giài. Càe axit amin này thuòng là axit amin thdm hoàc là axit amin ky nUÓe. * Proteinaza kim logii: là nhùng proteinaza càn lo^i cho ho^t dòng xùc tàc cùa ehùng. Nói chung, klm càc kim lo^i co thè tham già trong ho^t dòng xùc tàc cùa càc enzim theo càc càch khàc nhau: là thành phàn eà'u t^o cùa coenzim (eatalaza, peroxidaza. . . ) hoàc t^io thành l ièn kèt gò'c axit amin trong phàn tÙ enzim. Ngoài lo^ii, dàc biét là ion Ca còng hoà tri ra, vói càe mot s6 ion kim thUÒng eó tàc dyng làm ben càu trùc khòng gian cùa phàn tù enzim, do dò ànti hUÒng dèn ho^it dòng xùc tàc cùa ehùng. càc proteinaza kim lo^i thUÒng ho^t dòng m^nh vùng pH trung tinh va eó tinh dàc hi^u ve phia g^c chùa nhóm -NH- cùa peptit lièn kè't (1974) con gpi là aminoendopeptidaza). (vi vày, kè't peptit chùa axit amin ky nUÓc eó kieh thUÒc lòn hoàc càc kim lo^i bi giàm ho^t d^ng axit amin nèn Morihara Càc proteinaza này thè' tàc dyng Ièn càc lièn dU0c t^o thành tù càe axit amin phàn nh^t Ò nhóm -NH- cùa co càc H è n kè't peptit tù th^p. Càc proteinaza m?inh duòi tàc dyng cùa EDTA, O. phenanthrolin, càc proteinaza tham già trong hàu hè't càc qua trình quan trpng xày ra trong he th6ng s6ng. vai trò chia khoà trong vi^c diéu hoà qua trinh protein trong tè' bào ma con khàc nhu tièu hoà, Chùng khòng chi dóng song dòi mòi tham già nhiéu qua trinh sinh ly hình thành bào tÙ Ò vi sinh vàt, qua trinh dòng màu, này màm, làm chin qua,.. 2, Proteinaza Ò con trùng 2.1. Proteinaza tièu hoà 2.1.1. He thdng ^ng tièu hóa Ò con trùng MÒ tà chi tièt ve hoà con trùng eó thè giài phSu va tim thày 6ng sinh ly cùa trong càc còng trinh tièu cùa Wigglesworth [182] va House [86]. He th6ng tièu hoà cùa con trùng gÒm 6ng tièu hoà va càc tuyè'n lièn quan (hinh 1 ) . Giài phSu rà't biè'n d^i de' thich h0p vói nhùng yèu càu riéng cùa m5i nhóm còti trùng 66i vói càch sù dyng thùc àn va sU thich ùng thi r^t da d?ing. Ruòt truv^c ^''^^ tit Hàu mòn Wi^ng Tuyé'n Diéu nUtyc bpt '^'^'Ot g i ùa Ruòt Ong sau Ma1p i gh i Hinh 1. Sd dò chung ve 6ng tièu hoà cùa con trùng Ong tièu hoà là mot òng nói giùa 3 vùng: ruòt trUÒc, ruót giùa, ru$t sau eó nguÒn g^c ngo^i bi , mi^ng va hàu mòn. Ce va ruòt sau. Ruòt truòc ve va lòp tè' bào biè'u mò cùa càc - 8 ed quan này nàm dpc theo lòp biè'u bi- lòp hình thành nèn bò xUdng thuc hién chùc nàng du cùa con trù thùc protein cùng- kltin trùng, Ru^t trUÒc chù yè'u àn thò va dung tich cùa nò thuòng tàng Ièn theo mùa. TÙ ruòt trUòe càc gòi thùc àn rièng biét di vào ruòt giùa qua khoang trUÒc- mot vai eó thè eó phàn nghièn de' làm giàm kieh thuòe ndi tièu hoà va hà'p thu cùa mành thùc àn. thùc àn. Ruòt bi, khàc vói ruòt trUÒc va ruòt tè' bào hinh try kèm theo Ruòt giùa là giùa eó nguÒn g6c nói sau. Nó dU0e lót bòi mot lòp càc té bào goblet. Càc té bào hinh trv eó chùc nàng tiè't enzim tièu hoà va hStp thy càc chgft trao d^i hoà tan. Khòng co qua trinh thUc bào càc mành nhò thùc àn va vi vày tà't cà thùc àn phài dU0e tièu hoà dèn phàn nhò hoà tan eó thè di qua dU0c màng té bào. Dién tich bé màt cùa ruòt giùa thuóng dU0c tàng t^i dàu trUÒc bòi su lÒn ngU0e ra dU0c gpi là ruòt vùng khàc nhau giùa eó cùa ruòt tri pH cùa khoang, già tri này thè dupe Ièn tit. Càc dàc trUng bòi già co thè bièn dòi ro ràng dpc theo khoang ruòt giùa. Biéu này eó thè tUdng ùng vói nhùng sU khàc nhau ve chùc nàng cùa ve sU thu, cùng nhu càc qua trinh tièu hoà rdi ruòt giùa di cùa nó càe chat thài ruòt giùa Phàn vào ruòt sau, chùa Malpighi. Chùc nàng chù khàc. nitd hoà yèu cùa ruòt tièu hoà va h^p thùc àn khòng dU0c ndi ma tan di Ò dàu truóc vào sau là h^p càc 6ng thu nUÓe va chuàn bi bài t ièt. Vé pH cùa òng tièu dU0c nghièn eùu bòi nhiéu hoà cùa ^u trùng Lepidoptera dà tàc già. Waterhouse [178] dà phàt - 9 - hién thlly pH cao Ò àu trùng nhUng \^i, trUÒng thành. Trai màu eó trò nèn pH luòn Berenbaum [28] dà chi ra ràng pH cao quan dén thùc àn thUc vàt va eó màt trung tInh. cùa òng tièu hoà co lièn de' bào vé càc loài vói hàm [46] dà SÙ dyng vi dién cUc gàn co thè vói mùc tanin àn. pH cao dupc giài thich là khòi càc ch^t dòc trung tinh Ò con lii0ng cao trong thùc àn thUc vàt Ò thUc vàt. Dow do pH dà tim thà'y già tri pH cao hdn 12 Ò ruòt giùa va pH biè'n dò'i dpc theo 6ng tièu hoà. Trong khi màu, thùc àn, ruòt sau va phàn luòn luòn eó pH trung tinh hoàc axit thi già tri pH tàng Ièn rat nhanh Ò phàn trUÒe va phàn giùa cùa ruòt giùa, rtìi ngà vé phia trung tinh Ò phàn sau cùa ruòt giùa. 2.1.2. Proteinaza ruòt giùa cùa con trùng Nghièn eùu nhàm xàe dinh tinh chat cùa proteinaza tièu hoà dà dU0c thUc hién vói dich thò hoàc nghièn ruòt giùa hoàc phàn chùa trong ruòt giùa. h0p nghièn toàn bò ed thè. Proteinaza bòi ho^^t dòng cùa nó trèn mot sÒ ed Trong mot sò trUdng thUÒng dU0c xàe dinh chat protein nhU gelatin, cazein va hemoglobin hoàc bòi thu^ phàn càc nhu càc ester màu cùa càc dSn xuàt axit dàc hiéu proteinaza xerin, dóng thè mò ed eh^t dàc hiéu, amin. Càc ch^t ùc che' proteinaza kim lo^i va proteinaza sulfhydryl dà dU0c kièm tra cùng nhU càc chat ùc che' t^ng h0p TECK va TPCK. Nhiéu nghièn eùu dà vói djch chi^t thò, gap phài khó khan khi nghièn eùu dàc bi?!t là khòng thè' phàn biét dU0c càc enzim dàc hi^u rièng vói enzim eó tinh dàc hiéu róng. Trong 10 - mot s6 trUÒng h0p enzim dà dU0c tàch ra, va trong rat it trUÒng h0p enzim tinh s^eh dà dU0c xàe dinh tinh chat, Nhiéu già thiè't va thUc nghièm dà chat ùc che enzim tièu hoà di cùng vói thùc àn. Khi chat vói hàm lU0ng tUdng dU0e dUa ra vói càc vào òng tièu hoà cùa ùc che dòi cao proteinaza co (>5% protein gay dòc dò'i vói con trùng [145]. Vi du, che tripxin d$c hiéu, nèn Gooding [73] dà nhàn enzim trùng àn càc thùc àn nhu vày dU0c lUa enzim tièu hoà con trùng khòng thè phàt càc enzim proteolitic dà proteolitic cùa con chpn de nghièn eùu. Nàm tièn hành nghièn eùu càc bòt ( T e n e b r i o cùa mpt morsi tans) , dàu tUdng) eó chùa chat ùc càc 1964, Applebaum va tàp thè [19] moli tor) trièn dU0e trèn dà dU0c Ò thUc vàt hoà tan) thi chùng thày su ùc che' tripxin Ò rutìi Tése (Glossina Vi nhiéu lo^i h^t (vi dy, con trùng vi bièt ràng thùc àn dàu chùng minh khoang ruòt giùa àu trùng. SÙ dyng chat ùc là rat tUdng. glàu trong che' va ed chl[t dàc hi^u eó thè phàt hién dU0e ho^t tinh cùa cacboxypeptidaza B va aminopeptidaza, cùng nhu enzim tUdng tu tripxin. Enzim dà dU0c tinh sgeh tùng phàn nhò phUdng phàp sac ky trao d^i ion, eó khà nàng thuj^ phàn càe va polilizin. ester axit amin kiém NÓ bi ùc che bòi chat ùc che tripxin h0p dU0c hinh thành co hàng dàu tUdng, s6 phàn ly màc dù phùc cao hdn hàng s6 phàn ly cùa phùc h0p chat ùc chè'-tripxin bò. Proteinaza tièu hoà cùa Tenebrio dà dU0c Pfleiderer va Zwilling [137,186] tiép tyc nghièn eùu. Càe tàc già dà tàch dU0c 2 proteinaza tù con trUÒng thành, Enzim dàu tièn trong so' 11 này ('*proteinaza-a" ) co khò'i lU0ng phàn tù bòi PMSF, nhUng khòng thùy phàn càc dàn d^n xuàt cùa tyrozin hUÒng bòi TECK khò'i va (BAEE hoàc TPCK. Enzim lU0ng phàn tù 60000, tripxin dàc thù. Nò bi 24000 va bi ùc che' xuàt cùa arginin hoàc ATEE), NÓ thù cùng khòng bj ành hai ("proteinaza-3") co nhUng mang tàt cà càe dàc diè'm cùa ùc che' bòi tripxin va bòi TECK va PMSF, mot s^ protein ùc che' nhUng khòng bi ùc che' bòi TPCK. Proteinaza-p eó ho$it tinh dò'i vói ed chfiit BAEE, nhUng khòng co ho^t tinh dò'i vói ATEE, tàc già dà kè't luàn va nó thujr phàn polilizin. Vl vày càc rSng nó co thè' gi6ng vói "tripxin Tenebrio" cùa Applebaum va tàP thè' [19]. Tripxin nhiéu, va ho^it tièu hoà tinh cùa cùa con càc trùng dà dU0c nghièn eùu enzim kimotripxin, cacboxypeptidaza va aminopeptidaza cùng dà dU0e xàe dinh Ò mot s6 loài con trùng. s§ich va nghièn Mot trong eùu khà vàng, Vespa orientaiis chi tièt trèn dà dU0c tinh là kimotripxin cùa ong bau dòi ion va sac ky ài lUc dà tinh [ 102]. Kè't h0p sac ky trao s^ich dU0e kimotripxin nhùng enzim tù ruòt giùa àu Enzim co khò'i lU0ng phàn tù 13000-14000, trùng V,orientai is » nhò hdn nhiéu so vói hàu hè't kimotripxin dà biét [102]. Kh6i lU0ng phàn tù dà dU0c xàe dinh bòi mot s^ phUdng phàp nhU: skc sièu ly tàm, ky Ipc gel, di^n di trèn gel poliacrilamit co va khòng eó SDS- tàt cà r^t phù h0p vói nhau. d Tineola enzim tUdng tu bissel tripxin, 1 iel la, enzim Ward [174] dà phàt hi^n thÈly tUdng tu kimotripxin, hp 12 aminopeptidaza, cacboxypeptidaza va hai metalloendopept idaza. Bang lUu y trong loài này là khà nàng thu5^ phàn keratin- mot protein chiù nhiét va khòng hoà tan. Càc còng trình nghièn eùu dàu tièn vé con trùng tièu hoà long dà dU0c tò'ng kè't bòi Waterhouse [179]. Con trùng àn long duy tri diéu ki^n khù m^nh trong ruòt giùa àu trùng (Eh=-190 dén -280 mV) va do dò eó khà nàng khù lién ké't disulfit là yéu t6 t^o nèn tinh ben vùng cùa keratin. vi vày, sau khi lièn két này bi khù, keratin eó thè' bi thujr phàn bòi enzim proteolitic. Aminopeptidaza cùa T,bisse11ie1 s?ich va ehùng là mot nhóm phàn tù va dò tich phùc t^p dién [175]. metal loproteinaza khò'i lU0ng bi ùc che bòi càc liei vSn chUa dU0c khàc nhau Bang chat t^io phùc càng chù y cua vói hdn nhàt [177]. Dùng phUdng phàp là 2 Cà hai déu kim lo^i. Hai chié't tù dich chiét toàn la va d^ng chù yéu dà tinh vé khò'i lU0ng phàn tù 24000 [176], caeboxipept idaza dà dU0c tàch thè' T.bissel la bò ed dU0c tinh s«ich dèn dÓng Ipc gel dà xàe dinh dU0c nó eó khò'i lU0ng phàn tù bang 72000 (so sành vói 34000 cùa càc enzim tyy). cùng nhU vói enzim tyy, nó eó cùng tinh chÉlt bi ùc che bòi càe chà't ùc che thiol va 1, 10-phenanthro 1 in, cùng bi ùc che' bòi DFP nhU là enzim n^m men. Càc enzim này co tinh dàc hiéu ed chat vói dipeptit va tripeptit tUdng càc enzim tyy. Chùng co khà arginin, lyzin ò dàu N tàn prolin thi khòng bi phàn nàng cùng, ci^t, nhUng nò tU vói phàn giài càc peptit vói con peptit trong Leu-Gly-Leu l^i bi thu^' phàn rat nhanh. khi vói dàu N là Z-Glu-Leu hoàc - 13 - Proteinaza cùa con trùng protein thùc àn thành càc axit chà't dinh duòng càn thiè't xùc tàc cho sU phàn giài amin tU do va vi vày cung cÉtp cho sU tàng trUÒng va phàt trièn bình thuòng. CÓ 4 lo^i proteinaza: proteinaza aspartic (con gpi là proteinaza axit), proteinaza xistein (con gpi la proteinaza thiol), proteinaza xerin va meta Iloproteinaza [24]. Nàm 1985, Applebaum [18] dà cho r^ng hàu hét con trùng sÙ dyng proteinaza xerin vói tinh dàc hiéu tUdng tu tripxin hoàc tUdng tu kimotripxin de' thuìr phàn nhièn, nhùng nghièn eùu sau protein thùc àn cùa minh. Tuy này dà-cho thày khòng phài trUÒng h0p nào cùng nhu vày [134]. càc còng trình nghièn Lepidoptera dà cho théy vói nhin chung ehùng co tripxin" vói pH t6i ho^t Uu Ò eùu vé proteinaza Ò tinh ch^t pH kiém cùa tinh proteinaza àu trùng ruòt giùa, xerin "tUdng tU vùng kiém [16,17,100,131,141,155]. Phàn lòn àu trùng Coleoptera eó pH cùa ruòt giùa axit yèu, ho^t tinh proteolitic chù yèu thuóc vé proteinaza xistein Coleoptera là Costelytra cùa ruòt giùa dU0c [134,168,183]. zealandica [123] cùng co hoeit tinh proteinaza kiém. Ong tièu hoà cùa proteinaza thiol-cathepsin 94]. Nhu vày rò ràng là con [41] Hai va Tenebrio Hemiptera va Proteinaza ho^t tinh xàe dinh là xerin va pH t6i trùng va co ^u trùng moli tor Uu Ò vùng chùa càc aspartic [89,90,92, proteolitic cùa ruót giùa con trùng biè'n dòi tù loài này dè'n loài khàc vói t^t cà 4 Io?ii proteinaza dà dU0c tim th^y [167,183], Gàn day 6 loài con trùng quan trpng dà dU0c nghièn eùu - 14 vé ho^t tinh proteolitic Lepidoptera (Agrotis viiescens) cùa dich ipsilon, va. mot loài ruòt giua [142]. Ba loaì Heliothis zea Coleoptera (Anthonomus va Mei grandis) iothis co pH thich h0p t^i pHlO-11 va ho^t tinh enzim bi ùc che' bòi ch^t ùc che' tripxin dàu tUdng tù 63-72%, cùa chùng là càe proteinaza ica undecimpuncta t§ii pH6-7. E-64, "tUdng ta) eó ho§it tU tr ipxin". Tuy decemlineata va tinh proteolitic cUc d§ii mot ché[t ùc che' dàc hi^u proteinaza xistein dà ùc che' ho^t (Lept inotarsa xerin {Leptinotarsa nhièn 2 loài Coleoptera Diobrot ehùng tò proteinaza chù yè'u dò proteolitic decemlineata) undecimpunctata) chùng cùa va tò dich (Diobrot 69% ho^t tinh ruòt chù giùa 100% ica yèu cùa chùng là proteinaza xistein. Nhùng thu ho^ch gàn day vé nghièn eùu proteinaza tièu hoà cùa con trùng càng cùng c6 nhàn dinh vé sU co màt cùa cà 4 lo§ii proteinaza. Bang lUu y còng trình nghièn eùu cùa Gillikin va tàp thè [72]. It nhàt 15 proteinaza dà dU0c xàe djnh tù òng tièu hoà cùa àu Diabrotica trùng dyng cùa càc chat ùc che virgifera, dàc hiéu Nghièn eùu tàc dà ehùng tò co cà 4 lo^i proteinaza, trong dò chù yèu là proteinaza xistein. Ho?it tinh tripxin, tUdng proteolitic, tu kimotripxin, cacboxypeptidaza A va B, nghièn eùu Ò nhiéu Khòi lU0ng phàn trùng biè'n dò'i tù bao gÓm Idxin va cathepsin B ho§it tinh tUdng tU aminopeptidaza, hoàc D cùng dà dU0c loài con trùng [42,67,75,91,93,120,148]. cùa càc enzim tù 13000-53000 tUdng tu tripxin cùa con [17,42,57,71,88,112,131]. Kh6i
- Xem thêm -