Tài liệu Nghiên cứu phương pháp sản xuất và tính năng của fpi (fish protein isolate) từ phụ phẩm cá tra

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CAO XUÂN THỦY NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ TÍNH NĂNG CỦA FPI (FISH PROTEIN ISOLATE) TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CAO XUÂN THỦY NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ TÍNH NĂNG CỦA FPI (FISH PROTEIN ISOLATE)TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm và đồ uống Mã số chuyên ngành: 62540201 Phản biện độc lập 1: GS.TS. Trần Thị Luyến Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm Phản biện 1: GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Phản biện 2: PGS.TS. Ngô Đại Nghiệp Phản biện 3: PGS.TS. Phạm Văn Hùng NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Trần Bích Lam 2. GS.TS. Hà Thanh Toàn LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất cứ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu. Tác giả luận án Cao Xuân Thủy i TÓM TẮT Với mục tiêu khai thác tính năng công nghệ và giá trị sinh học của protein cá Tra (Pangasius hypophthalmus), luận án “Nghiên cứu phương pháp sản xuất và tính năng của FPI (Fish Protein Isolate) từ phụ phẩm cá Tra” đã khảo sát quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme alcalase 2.4L dưới các điều kiện thủy phân được kiểm soát chặt chẽ; nghiên cứu tính năng công nghệ, hoạt tính sinh học của FPI và ứng dụng công nghệ lọc màng để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi. Luận án đã đạt được một số kết quả chính như sau: (1) Về mặt lý thuyết  Nghiên cứu thành công quá trình thuỷ phân, xác định được quy luật ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra; xác định mối liên hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thủy phân (DH) và tính năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi của FPI.  Xây dựng được phương trình hồi quy thực nghiệm mô tả ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố pH (X1), tỷ lệ enzyme (X2), nhiệt độ (X3) và thời gian (X4) đến quá trình thuỷ phân, tối ưu hóa các điều kiện thủy phân với từng hàm mục tiêu là khả năng tạo bọt, tạo nhũ, cố định canxi. YBọt = 93,39 + 0,33X1 + 1,06X2 + 0,99X4 – 0,51X12 – 1,74 X22 – 0,36X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4 YNhũ = 29,93 + 0,41X1 + 1,05X2 + 1,16X4 – 1,17X12 – 1,07 X22+ 1,27X32 –1,13X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4 YCa = 30,36 + 1,19X2 + 0,76X4 – 0,55X12 – 1,02 X22 – 0,54 X42 + 0,42X1X3 + 0,45X1X4 + 1,27X2X3 – 0,42X2X4 – 1,05X3X4  Xác định được mối tương quan giữa kích thước phân tử của FPI phụ phẩm cá tra với tính năng ứng dụng của nó. Nhóm protein trong FPI có khả năng tạo nhũ tốt có phân tử lượng từ 7 đến 10kDa. Nhóm protein có khả năng tạo bọt tốt có phân tử lượng từ 5 đến 7kDa. Riêng hoạt tính cố định canxi của FPI được xác định bởi các protein có kích thước nhỏ (nhỏ hơn 5 kDa). FPI cá tra có hoạt tính cố định canxi rất tốt, khả năng cố định canxi thực tế của FPI đạt 38,36mg Ca2+/g FPI, trong đó có trên 94% liên kết giữa Ca+2 với FPI tạo được cấu trúc EF-hand. ii (2)Về mặt thực tiễn  Xây dựng được quy trình công nghệ thu nhận các sản phẩm FPI có giá trị cao từ phụ phẩm chế biến cá Tra gồm phương pháp thủy phân giới hạn và phương pháp lọc màng phân riêng các nhóm phân tử.  Đã sử dụng thành công quá trình lọc nano với 2 loại màng là GE-5-DL, 5 kDa và SRM 347, 10 kDa; xác định các điều kiện tối ưu để phân riêng và thu nhận các FPI có khả năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi cao nhất. Hiệu suất thu hồi protein sau lọc màng cao nhất ở màng GE-5-DL (màng 5 kDa) là 76,06% trong điều kiện vận hành: nhiệt độ 450C, lưu lượng 34 L/h, áp suất 25 bar. Hiệu suất thu hồi protein sau lọc màng cao nhất ở màng SRM 347 (màng 10 kDa) khi sử dụng để thu hồi FPI có tính năng tạo bọt là 64,02% trong điều kiện vận hành: nhiệt độ là 350C, lưu lượng 39 L/h, áp suất: 22 bar. Khi sử dụng màng SRM 347 để thu hồi FPI có tính năng tạo nhũ, hiệu suất thu hồi protein cao nhất đạt 65,31% trong điều kiện vận hành: nhiệt độ 400C, lưu lượng 44 L/h, áp suất: 22 bar.  Khả năng tạo bọt của FPI từ phụ phẩm chế biến cá Tra tối đa đạt 112,18%, tương đương với khả năng tạo bọt của WPI và cao hơn SPI. Khả năng tạo nhũ của FPI tối đa đạt 39,88%, cao hơn khả năng tạo nhũ của SPI và WPI. Đặc biệt là khả năng cố định canxi của FPI rất cao. Các khám phá này mở ra nhiều hướng ứng dụng mới của FPI cá tra trong công nghiệp thực phẩm. Những kết quả trên bước đầu tạo tiền đề cho việc triển khai công nghệ, ứng dụng vào thực tế, đồng thời là nguồn tham khảo tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo trong cùng lĩnh vực. iii ABSTRACT As targets of striving towards the technological and the biological values of fish protein; the thesis "Research of features and production technology of FPI (Fish Protein Isolate) from byproducts of Pangasius hypophthalmus" has conducted research on hydrolysis of Pangasius hypophthalmus byproducts by enzymes alcalasa 2.4L under the strictly controlled hydrolysis conditions. To research on technology features, biological activities. Apart from that, membrane technology has been applied for collecting FPI with the emulsifying, foaming, calcium-binding espectively features. The thesis has reached some key results as follows: (1) The theoretical results  Researching successfully the hydrolysis process, identify rules affected by technical parameters during hydrolysis of Pangasius hypophthalmus byproduct; determining the relationship between the degree of hydrolysis (DH) and emulsifying, foaming, calcium binding abilities of FPI  Conducting the optimization, building the empirical regression equation describing the simultaneous influences of pH factor (X1), the E/S ratio (X2), temperature (X3) and time (X4) to the hydrolysis; optimization the hydrolysis conditions for each objective function of foaming, emulsifying, calcium binding: Yfoaming = 93,39 + 0,33X1 + 1,06X2 + 0,99X4 – 0,51X12 – 1,74 X22 – 0,36X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4 Yemulsifying = 29,93 + 0,41X1 + 1,05X2 + 1,16X4 – 1,17X12 – 1,07 X22+ 1,27X32 – 1,13X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4 Ycalcium binding = 30,36 + 1,19X2 + 0,76X4 – 0,55X12 – 1,02 X22 – 0,54 X42 + 0,42X1X3 + 0,45X1X4 + 1,27X2X3 – 0,42X2X4 – 1,05X3X4  Determining the correlation between molecular weight cut-off (MWCO) of protein in FPI with the features of its application. The group of proteins with MWCO from 7 to 10 kDa has good emulsifying ability. The one with MWCO from 5 to 7 kDa has good foaming ability. Particularly, the calcium binding capacity of FPI has been determined by the relatively small proteins (less than 5 kDa). The maximum calcium binding of FPI from Pangasius hypophthalmus is high, reaching 38,36 mg Ca2+/g FPI, iv which has over 94% of the links between Ca+ 2 with FPI by creating structured EF-hand (2) Experimental results • To develop a technological process for producing of high quality FPI from Pangasius hypophthalmus byproducts, including limited hydrolysis process and membrane application for separating protein clusters with different mocular weight. • To use successfully the 5 kDa GE-5-DL and 10 kDa SRM 347 membranes. Thereby, determining the optimum conditions of the membranes filtration process for acquiring FPI with the emulsifying, foaming, calcium binding abilities. The highest proteins yield of membrane GE-5-DL membrane (5 kDa membrane) is 76.06%; in operating conditions: temperature of 450C, flow 34 L/h, pressure: 25 bar. The one of SRM 347 (10 kDa membrane) for colleting FPI with foaming ability is 64.02%; in operating conditions: temperature of 350C, flow 39 L/h, pressure: 22 bar. The highest proteins yield of SRM 347 membrane with emulsifying ability is 65.31% in the operating conditions: temperature 400C, flow 44 L/h, pressure: 22 bar. • The maximum foaming ability of FPI from Pangasius hypophthalmus byproducts reached 112.18%, equivalent to the foaming capability of WPI and higher than the one of SPI. Maximum emulsifying ability of FPI reaches 39.88%, higher than the ones of SPI and WPI. Especially the calcium binding ability of FPI is very high. The discovery opens up many new application directions of FPI fish in food industry The above initial results, on the premise, have been contributed to the application for food production, and considered as a reliable reference source for further studies in the same field. v LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình, sự động viên đúng lúc của TS. Trần Bích Lam. Từ đáy lòng mình, bằng những tình cảm chân thành nhất cùng với sự kính trọng sâu sắc, tôi muốn bày tỏ lời biết ơn của mình đến Cô. Cảm ơn Cô đã cho em nhiều suy nghĩ về sự phấn đấu không ngừng để trở thành một nhà khoa học chân chính. Cảm ơn Cô đã trang bị thêm cho em cách tiếp cận với các phương pháp luận khoa học để em tự tin hơn trên con đường phía trước. Xin cảm ơn GS.TS. Hà Thanh Toàn đã giúp đỡ, góp nhiều ý kiến cho luận án kể từ những ngày đầu tiên xây dựng đề cương nghiên cứu đến nay. Lúc này đây, con xin được nói lời cảm ơn cha; kính cẩn chắp tay và thâm tâm hướng về vong linh của mẹ. Muôn vàn lời cảm ơn cũng không thể nói hết được tình thương của cha mẹ với con. Con cảm ơn cha mẹ đã cho con hình hài này, cảm ơn cha mẹ luôn luôn ở bên con kể cả những hoàn cảnh khó khăn nhất để con thêm vững bước trong cuộc sống. Nhân dịp này, với tư cách là người chồng, người cha, tôi muốn gửi thật nhiều lời cảm ơn sâu sắc, tình cảm yêu thương vô bờ của tôi đến gia đình nhỏ bé, nơi đó có vợ và hai con trai yêu quí - Huy Hoàng, Minh Trí. Tổ ấm ấy đã là điểm tựa tinh thần vững chắc cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu đầy gian nan vừa qua. Cảm ơn vợ và các con đã mang lại năng lượng và niềm vui để bố được yên tâm trong sự nghiệp phấn đấu. Xin bày tỏ niềm tri ân vì những giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban Giám hiệu trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp. Hồ Chí Minh, sự động viên tinh thần của các đồng nghiệp, bạn bè. Tôi cũng xin cảm ơn khoa Kỹ thuật Hóa học - Trường Đại học Bách khoa; các thầy, cô đang công tác tại khoa Công nghệ Thực phẩm; các cán bộ, viên chức phòng Công tác chính trị - Học sinh sinh viên, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và chia sẻ vui - buồn với tôi trong thời gian vừa qua. Cao Xuân Thủy vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN TÓM TẮT ABSTRACT LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN i ii iv vi vii ix xii xiv xv 1 1.1. Cá Tra và phụ phẩm chế biến cá Tra 1 1.2. Các chế phẩm protein thủy sản 4 1.3. Các enzyme sử dụng trong thủy phân protein cá 8 1.4. Sử dụng kỹ thuật membrane trong sản xuất FPI và BP 11 1.5. Tính chất công nghệ của các chế phẩm protein 15 1.6. Hoạt tính sinh học của các chế phẩm protein 19 1.7. Những vấn đề tồn tại trong nghiên cứu thu nhận và tính năng của FPI 25 1.8. Hướng nghiên cứu và nội dung nghiên cứu của luận án 28 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Nguyên liệu 30 2.2. Hóa chất 32 2.3. Màng lọc nano 32 2.4. Thiết bị 34 2.5. Phương pháp nghiên cứu 35 2.6. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 40 2.7. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 42 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 54 3.1. Nghiên cứu quá trình thuỷ phân phụ phẩm cá Tra 54 3.2. Nghiên cứu tính năng công nghệ của FPI từ phụ phẩm cá Tra 65 3.2.1. Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thuỷ phân (DH) và khả năng tạo bọt, tạo nhũ của FPI. vii 66 3.2.2. Nghiên cứu điều kiện tối ưu thu nhận FPI có tính năng tạo bọt 70 3.2.3. Nghiên cứu điều kiện tối ưu thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ 77 3.2.4. So sánh khả năng tạo bọt, tạo nhũ của FPI với các chế phẩm protein 83 thương mại (SPI và WPI) 3.3. Nghiên cứu hoạt tính cố định canxi của FPI từ phụ phẩm cá Tra 3.3.1. Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thuỷ phân (DH) và 88 89 hoạt tính cố định/liên kết canxi của FPI 3.3.2. Nghiên cứu hoạt tính cố định canxi của đạm cá phân lập 3.4. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lọc membrane để phân riêng các nhóm phân tử 91 100 protein trong FPI 3.4.1. Lựa chọn loại membrane 101 3.4.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân riêng các nhóm protein 103 mục tiêu trong FPI bằng kỹ thuật lọc màng 3.4.3. Lựa chọn các thông số công nghệ thích hợp cho quá trình lọc màng để 118 thu nhận các nhóm protein trong FPI có tính năng ứng dụng khác nhau 3.5. Kiểm tra thành phần hóa học và tính năng công nghệ của FPI sau quá trình lọc 125 membrane. 3.5.1. Kiểm tra thành phần hóa học của FPI 126 3.5.2. Kiểm tra khả năng tạo bọt 128 3.5.3. Kiểm tra khả năng tạo nhũ 132 3.6. Kiểm tra hoạt tính cố định canxi của FPI sau quá trình lọc màng. 135 3.7. Đề xuất phương pháp sản xuất các chế phẩm FPI có tính năng công nghệ, hoạt 141 tính sinh học từ phụ phẩm cá Tra 3.7.1. Sơ đồ quy trình 141 3.7.2. Thuyết minh quy trình 142 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT 146 4.1. Kết luận 146 4.2. Đề xuất 146 CÁC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 148 viii 150 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian của Alcalase 9 Hình 1.2. Minh họa 2 giai đoạn tác động của alcalase đến cơ chất 10 Hình 1.3. DH của phản ứng thủy phân bằng alcalase và flavourzyme trên cơ chất là cá 11 chép bạc Hình 1.4. Sử dụng các loại membrane dựa trên khối lượng phân tử các chất trong dòng 13 qua màng (dòng permeate) Hình 1.5. Mô hình cấu trúc EF-Hand 23 Hình 1.6. Mô hình liên kết giữa Ca+2 với axit amin khởi đầu mạch peptid của protein 23 trong FPI Hình 2.1. Phụ phẩm cá Tra 30 Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận, vận chuyển, bảo quản phụ phẩm cá Tra 31 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát quá trình thủy phân 42 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí hệ thống lọc membrane (thu nhận protein ≤ 5 kDa) 43 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí hệ thống lọc membrane (thu nhận protein >5 kDa÷10 kDa) 43 Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát quá trình lọc membrane 44 Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến mức độ thủy phân 56 Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân 58 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân 60 Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất/nước đến mức độ thủy phân 61 Hình 3.5. Đạm cá phân lập (FPI) từ phụ phẩm cá Tra 64 Hình 3.6. Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thủy phân và khả năng tạo 67 bọt của FPI Hình 3.7. Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thủy phân và khả năng tạo 69 nhũ của FPI Hình 3.8. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên khả năng 73 tạo bọt của PI. Hình 3.9. Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong 76 FPI có khả năng tạo bọt tốt nhất Hình 3.10. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên khả năng 79 tạo nhũ của FPI Hình 3.11. Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein ix 82 trong FPI có khả năng tạo nhũ tốt nhất Hình 3.12. Khả năng tạo bọt của WPI, FPI, SPI 84 Hình 3.13. Khả năng tạo nhũ của FPI, SPI, WPI 86 Hình 3.14. Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thủy phân và khả năng 90 cố định canxi của FPI Hình 3.15. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên hoạt tính 93 cố định canxi của FPI. Hình 3.16. Liên kết giữa Ca+2 và các protein trong FPI từ phụ phẩm cá tra 97 Hình 3.17. Kết quả phân tích LC-MS xác định thành phần khối lượng của các phân tử 98 protein trong FPI có khả năng cố định canxi tốt nhất Hình 3.18. Ảnh hưởng của lưu lượng tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng 108 GE-5-DL Hình 3.19. Ảnh hưởng của lưu lượng tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc 109 màng GE-5-DL Hình 3.20. Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua 110 màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*) Hình 3.21. Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua 110 màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**) Hình 3.22. Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi 111 lọc màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*) Hình 3.23. Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi 111 lọc màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**) Hình 3.24. Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng GE- 114 5-DL Hình 3.25. Ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc 114 màng GE-5-DL Hình 3.26. Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng 115 SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*) Hình 3.27. Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng 115 SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**) Hình 3.28. Ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc 116 màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*) Hình 3.29. Ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc 116 màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**) x Hình 3.30. Đường đồng mức thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên hiệu 122 suất thu hồi protein trong FPI ở màng GE-5-DL và màng SRM 347*. Hình 3.31. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm khi lọc màng 124 SRM 347** lên hiệu suất thu hồi protein trong FPI có khả năng tạo nhũ. Hình 3.32. Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein 129 trong FPI có khả năng tạo bọt tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347* Hình 3.33. Khả năng tạo bọt của FPI trước và sau khi lọc membrane và so sánh với 130 khả năng tạo bọt của SPI, WPI. Hình 3.34. Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein 132 trong FPI có khả năng tạo nhũ tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347** Hình 3.35. Khả năng tạo nhũ của FPI trước và sau khi lọc membrane và so sánh với 134 khả năng tạo nhũ của SPI, WPI. Hình 3.36. Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein 137 trong FPI có khả năng cố định canxi cao nhất sau khi lọc màng GE-5-DL Hình 3.37. Kết quả xử lý trong môi trường tia bức xạ đơn sắc để xác định mật độ các 139 liên kết canxi với protein trong FPI sau khi lọc membrane. Hình 3.38. Sơ đồ quy trình sản xuất các loại FPI từ phụ phẩm cá Tra. xi 142 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. So sánh các phương pháp thủy phân để sản xuất chế phẩm protein thuỷ 8 phân và PI Bảng 2.1. Đặc tính kỹ thuật của màng GE-5-DL 33 Bảng 2.2. Đặc tính kỹ thuật của màng G57 33 Bảng 2.3. Đặc tính kỹ thuật của màng SRM347 33 Bảng 2.4. Đặc tính kỹ thuật của màng M-Pr2516A8 34 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc 45 màng GE-5-DL Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc 45 màng SRM 347 Bảng 2.7. Các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu 46 hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo bọt của FPI) Bảng 2.8. Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng 46 đến khả năng tạo bọt của FPI) Bảng 2.9. Các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu 47 hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ của FPI) Bảng 2.10. Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng 48 đến khả năng tạo nhũ của FPI) Bảng 2.11. Các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu 49 hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố định canxi của FPI) Bảng 2.12. Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng 49 đến khả năng cố định canxi của FPI) Bảng 2.13. Mức của các yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu 51 hoá các yếu tố ảnh hưởng đến HSTH protein của FPI khi lọc membrane) Bảng 2.14. Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng 52 đến hiệu suất thu hồi protein của FPI) Bảng 2.15. Các bước chung xây dựng bài toán tối ưu 53 Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của phụ phẩm cá Tra 54 Bảng 3.2. Thành phần hóa học của phụ phẩm cá Tra dùng để thủy phân 54 Bảng 3.3. Thành phần hóa học của chế phẩm protein từ phụ phẩm cá Tra 63 Bảng 3.4. Hàm lượng một số nguyên tố khoáng trong chế phẩm protein từ phụ 63 phẩm cá Tra xii Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy (trong bài 72 toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo bọt của FPI) Bảng 3.6. Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả 77 năng tạo bọt tốt nhất Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy (trong bài 79 toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ của FPI) Bảng 3.8. Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả 81 năng tạo nhũ tốt nhất Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy (trong bài 92 toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến cố định canxi của FPI) Bảng 3.10. Kiểm tra khả năng cố định canxi thực tế của FPI 95 Bảng 3.11. Kết quả phân tích kiểm định liên kết giữa Ca+2 và protein trong FPI 96 Bảng 3.12. Kết quả phân tích tỷ lệ thành phần khối lượng phân tử của FPI có khả 99 năng cố định canxi cao nhất Bảng 3.13. Kết quả khảo sát sơ bộ các loại màng sử dụng trong quá trình phân tách 102 các nhóm protein trong FPI Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lọc của các loại màng 104 Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra tính tương thích của các phương trình hồi quy (trong 121 bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi protein của FPI) Bảng 3.16. Thành phần hoá học của các loại protein isolate 127 Bảng 3.17. Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả 129 năng tạo bọt tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347* Bảng 3.18. Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả 133 năng tạo nhũ tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347** Bảng 3.19. Hàm lượng một số nguyên tố khoáng trong FPI từ phụ phẩm cá Tra sau 135 khi lọc màng có khả năng cố định canxi cao nhất Bảng 3.20. Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả 136 năng cố định canxi cao nhất sau khi lọc màng GE-5-DL Bảng 3.21. Kiểm tra khả năng cố định canxi thực tế của FPI sau khi lọc màng 138 Bảng 3.22. So sánh khả năng cố định canxi thực tế và kiểm định liên kết giữa 138 Ca+2 với protein của FPI trước và sau khi lọc membrane Bảng 3.23. Hiệu suất thu hồi FPI mục tiêu 145 xiii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt tắt ACE Angiotensin Converting Enzyme Enzyme ức chế chuyển hóa angiotensin BP Biopeptide Protein có hoạt tính sinh học CBP Calcium Binding Peptide Protein có hoạt tính liên kết canxi DF Diafiltration Có sử dụng biện pháp pha loãng DH Degree of Hydrolysis Mức độ thủy phân DHA Docosa Hexaenoic Acid A-xít docosa hexaenoic EPA Eicosa Pentaenoic Acid A-xít Eicosa Pentaenoic FBP Fish Biopeptide Đạm cá có hoạt tính sinh học HPLC High Performance Liquid sắc ký lỏng hiệu năng cao/sắc ký Chromatography/High Pressure lỏng cao áp Liquid Chromatography MF Microfiltration Vi lọc NF Nanofiltration Lọc na-nô PC/FPC Protein Concentrate/Fish Protein Đạm cô đặc/Đạm cá cô đặc Concentrate PH/FPH Protein Hydrolysate/Fish Protein Dịch đạm/Dịch đạm cá Hydrolysate PI/FPI Protein Isolate/Fish Protein Isolate Đạm phân lập/Đạm cá phân lập RO Reverse Osmosis Thẩm thấu ngược SPI Soyabean Protein Isolate Đạm đậu tương phân lập UF Ultrafiltration Siêu lọc VASEP Vietnam Association of Seafood Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu Thủy Exporters and Producers sản Việt nam Whey Protein Isolate Đạm sữa phân lập WPI xiv MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp nuôi trồng và chế biến cá Tra (Pangasius hypophthalmus) ở Việt Nam phát triển không ngừng, kỹ thuật quản lý sản xuất ngày một cao. Trong năm 2014, sản lượng nuôi cá Tra của Việt Nam đạt trên 1,22 triệu tấn, tổng giá trị xuất khẩu khoảng 1,8 tỷ USD, chiếm 24,81% tổng giá trị thương mại của ngành thuỷ sản. Với sản lượng cá Tra nuôi như trên thì sau khi chế biến philê sẽ tạo ra lượng phụ phẩm cá Tra khổng lồ (khoảng 0,65÷0,69 triệu tấn). Việc sử dụng hiệu quả nguồn phụ phẩm này để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng vừa mang lại hiệu quả kinh tế, vừa có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Đạm cá phân lập (FPI) là một dạng chế phẩm protein cao cấp từ cá. Ngoài giá trị dinh dưỡng rất cao, FPI còn có nhiều tính năng công nghệ có thể ứng dụng tốt vào công nghiệp thực phẩm như: khả năng hòa tan, tạo màng, tạo nhũ, tạo bọt, tạo gel… Một số sản phẩm FPI còn có các hoạt tính sinh học: hoạt tính cố định canxi, kháng khuẩn, chống đông máu, chống oxy hóa, tác động tích cực gây an thần hoặc hưng phấn hệ thần kinh… Việc nghiên cứu phương pháp sản xuất FPI từ nguồn nguyên liệu trong nước dồi dào như phụ phẩm cá Tra và tìm hiểu các tính năng công nghệ cũng như hoạt tính sinh học của FPI là vấn đề thực sự cần thiết, có ý nghĩa khoa học, có giá trị thực tiễn và tính xã hội cao. Mục tiêu của luận án: Khai thác giá trị sử dụng mới của phụ phẩm cá Tra để làm cơ sở ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm. Nội dung nghiên cứu tổng quát của luận án (1) Nghiên cứu quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme alcalase 2.4L nhằm thu nhận các sản phẩm đạm cá phân lập có tính năng công nghệ và hoạt tính sinh học. Nghiên cứu tập trung vào khai thác tính năng tạo bọt, tạo nhũ và hoạt tính cố định canxi của các sản phẩm FPI từ phụ phẩm cá Tra. Thông qua các mô hình tối ưu hóa xác định các thông số kỹ thuật thích hợp nhất cho quá trình thủy phân với các hàm mục tiêu là khả năng tạo nhũ, tạo bọt và hoạt tính cố định canxi. (2) Xác định kiểu liên kết giữa ion canxi với các peptide trong FPI từ phụ phẩm cá Tra xv (3) Nghiên cứu ứng dụng công nghệ lọc màng để phân riêng các nhóm protein có khối lượng phân tử khác nhau trong FPI theo tính năng công nghệ (tạo nhũ, tạo bọt) và hoạt tính sinh học (khả năng cố định canxi) đã được xác định. Tính mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án (1) Đã xác định được quy luật của mối quan hệ giữa khối lượng phân tử của các protein trong FPI với khả năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi của FPI theo thời gian thủy phân. Trong đó, lần đầu tiên đã xác định và chứng minh được FPI từ phụ phẩm cá Tra có hoạt tính cố định canxi. Đây là nội dung mang tính mới trong các nghiên cứu của luận án, có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn. Các kết quả nói trên sẽ được sử dụng cho việc tham khảo của các nhà khoa học khi nghiên cứu về ứng dụng của FPI. (2) Đã nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme alcalase 2.4L để thu nhận FPI; chứng minh rằng mỗi một tính năng công nghệ hay hoạt tính sinh học của FPI phụ thuộc vào mức độ thủy phân (DH) và phải kiểm soát được các thông số của quá trình thủy phân nhằm thu được FPI có tính năng công nghệ và hoạt tính sinh học phù hợp. Điều này sẽ là cơ sở quan trọng cho việc chủ động trong sản xuất FPI, hướng tới quy mô công nghiệp. (3) Đã có các khảo sát, đánh giá và so sánh khả năng tạo nhũ, tạo bọt của FPI từ phụ phẩm chế biến cá Tra với các sản phẩm tương đương đang được sử dụng trong sản xuất thực phẩm. Điều này mở ra các hướng ứng dụng thực tiễn của FPI sau khi được sản xuất. (4) Đã xác lập được chế độ lọc màng (membrane) thích hợp để phân riêng các phân tử protein nhằm thu được FPI có khả năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi cao nhất. (5) Đã nghiên cứu thành công phương pháp sản xuất chế phẩm FPI từ phụ phẩm cá Tra có hoạt tính cố định canxi cao (38,36 mg Ca+2/g FPI); mở ra triển vọng sản xuất các sản phẩm mới giúp tăng cường hấp thu can-xi cho con người. Luận án được trình bày trong 162 trang, bao gồm:  Phần mở đầu (16 trang).  Chương 1: Tổng quan (29 trang).  Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (23 trang).  Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận (92 trang).  Chương 4: Kết luận và kiến nghị (2 trang). xvi CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Cá Tra và phụ phẩm chế biến cá Tra 1.1.1. Nguồn lợi và tình hình nuôi, chế biến, xuất khẩu cá Tra của Việt Nam Cá Tra là loài cá da trơn rất quan trọng trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến thủy sản xuất khẩu ở nước ta [1], [2]. Nghề nuôi cá Tra đã và đang phát triển nhanh chóng. Từ năm 2006 đến năm 2013, sản lượng nuôi cá Tra của Việt Nam tăng khoảng 3,5 lần. Hiện nay, sản lượng cá Tra hàng năm ổn định và đạt khoảng trên dưới 1,22 triệu tấn [3] [4], [5], [6]. . Diện tích nuôi cá Tra tập trung chủ yếu tại các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, cao nhất là Đồng Tháp (1.489 ha, chiếm 28,9%), Cần Thơ (1.110 ha, chiếm 21,5%), An Giang (1.023 ha, chiếm 19,9%). Chỉ riêng 3 tỉnh trên đã chiếm khoảng 70,3% diện tích nuôi và hơn 80% sản lượng cá Tra toàn vùng [7], [8], [9], [10], [11]. Theo VASEP (2014), cả nước có 281 doanh nghiệp xuất khẩu cá Tra, trong đó chỉ khoảng 100 doanh nghiệp có nhà máy chế biến. Hầu hết cá Tra đến tay người tiêu dùng dưới dạng các sản phẩm đông lạnh như: cá nguyên con, cá cắt khúc, xiên que, cá philê…[12]. Trong đó sản phẩm philê là mặt hàng chủ lực và giá trị lớn nhất. Giá trị xuất khẩu cá Tra đóng góp rất lớn vào sự tăng trưởng xuất khẩu thủy sản của Việt Nam [13], [14], [15]. 1.1.2. Sản lượng phụ phẩm cá Tra Cùng với sự phát triển của ngành chế biến cá Tra, theo VASEP (2014), lượng phế phụ liệu (gọi chung là phụ phẩm) cá Tra hiện nay khoảng 645.000÷685.000 tấn/năm và sẽ ổn định vào khoảng năm 2020 ở mức 720.000 tấn. Từ 685.000 tấn phụ phẩm thô hiện nay, có thể tạo ra khoảng 137.000 tấn bột cá và khoảng 177.000 tấn mỡ [8], [12], [16], [17], [18]. 1.1.3. Thành phần khối lượng và thành phần hóa học của phụ phẩm cá Tra. Thành phần khối lượng của phụ phẩm chế biến cá Tra thông thường được chia ra 4 phần: Đầu - xương - vây - thịt bám, mỡ bụng, nội tạng, mỡ lá. Khi phân tích tỷ lệ khối lượng của phụ phẩm cá Tra: đầu - xương - vây - thịt bám chiếm tỷ lệ lớn nhất (64,23%). Đây cũng là phần phụ phẩm quan trọng nhất do giàu protein, phải được tận dụng để sản 1 xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng khác. Tỷ lệ các phần khác: mỡ bụng 18,71%, nội tạng 10,97%, mỡ lá 6,1% [18]. Theo kết quả của một số nghiên cứu (Trần Thị Hồng Nghi và cộng sự (2012); Nguyễn Duy Tân và cộng sự (2009): thành phần hóa học của phụ phẩm cá Tra sau khi tách philê có hàm lượng protein tương đối cao (10,32±1,85%); khoáng (8,35±0,83); lipid (23,80±1,48); hàm ẩm (57,37±2,25) [18], [19]. Với thành phần hóa học như trên, phụ phẩm cá Tra có thể được chế biến thành các sản phẩm riêng rẽ, có giá trị sử dụng khác nhau như FPI, mỡ cá, bột xương cá…[8], [9]. 1.1.4. Tình hình sử dụng phụ phẩm cá Tra Với lượng phụ phẩm cá Tra ở Việt Nam hiện nay từ 645.000 đến 685.000 tấn [8], [12], [16], nếu được tận dụng tối đa để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị sẽ đem lại nguồn lợi to lớn cho người nuôi trồng và chế biến thủy sản. 1.1.4.1. Tận dụng phụ phẩm cá Tra cho tiêu dùng con người Về mặt cơ sở khoa học và thực tiễn thì hầu hết các thành phần của phụ phẩm chế biến cá Tra có thể tận dụng cho nhu cầu của con người: ức, bong bóng, bao tử cá Tra sử dụng làm thực phẩm; gan có thể đóng hộp hoặc chế biến thành dầu cá - một sản phẩm được sử dụng ngày càng phổ biến do những lợi ích về sức khỏe của Omega-3 đã được công nhận gần đây [14], [20], [21]. Mỡ cá Tra là sản phẩm có giá trị cao dành cho con người do chứa nhiều axit béo không no thiết yếu cho cơ thể, nhất là EPA, DHA. DHA, EPA là những axit béo đặc biệt quan trọng đối với não người và không tìm thấy trong dầu thực vật. Cả DHA và EPA thường được bổ sung trong các thực phẩm như bánh mì, sữa chua, sữa và sữa công thức cho trẻ sơ sinh. Ngoài ra, mỡ cá Tra còn chứa nhiều Vitamin A, D, E… [9], [20]. Da cá Tra có thể tận dụng để sản xuất các sản phẩm cao cấp dùng trong dược phẩm hoặc mỹ phẩm như collagen, gelatine, thực phẩm chức năng chứa vi chất. Ruột và nội tạng cá Tra có thể được tận dụng để sản xuất enzyme protease, lipase... Tuy nhiên, việc sử dụng phụ phẩm chế biến cá Tra phổ biến hiện nay ở Việt Nam chủ yếu mới chỉ tập trung tận dụng thịt vụn hay phần thịt màu sẫm để làm chả cá hoặc xúc xích. Một số phần khác sử dụng làm thực phẩm trực tiếp cho con người. Tận dụng phụ phẩm cá Tra để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị cao hầu như chưa được nghiên cứu và áp dụng [20], [21]. 2