Tài liệu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Thị Luyến NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE TÍCH HỢP HỆ VI LƯU LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Thị Luyến NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE TÍCH HỢP HỆ VI LƯU Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 62520301 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. MAI ANH TUẤN 2. PGS.TS. HUỲNH ĐĂNG CHÍNH HÀ NỘI - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của tập thể giáo viên hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tập thể hướng dẫn PGS. TS. Mai Anh Tuấn PGS.TS. Huỳnh Đăng Chính Tác giả luận án Trần Thị Luyến LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các Thầy, PGS.TS. Mai Anh Tuấn và PGS.TS. Huỳnh Đăng Chính, những người Thầy tâm huyết, yêu nghề đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn tôi, động viên, khích lệ và hết lòng giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ về mặt kinh phí từ nguồn kinh phí đào tạo nghiên cứu sinh của Bộ Giáo dục và Đào tạo (đề án 911 trong nước), đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ (mã số: B2015-01-102) và Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia thông qua đề tài mã số 103.99-2013.58. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các lãnh đạo và các Thầy Cô, đồng nghiệp của tôi trong Bộ môn Hóa Vô cơ - Đại cương, Viện Kỹ thuật Hóa học, Viện ITIMS, Viện Đào tạo sau Đại học và Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo tất cả những điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị, em đã và đang là học viên cao học và nghiên cứu sinh tại PTN Vật liệu sinh học và Khoa học sự sống, Viện ITIMS, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội vì sự hỗ trợ nhiệt tình trong thời gian tôi thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Đỗ Phúc Quân, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội; TS. Phạm Đức Thành, TS. Chu Thị Xuân, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; GS. Hiroaki Suzuki, Trường Đại học Tsukuba (Nhật Bản) vì sự giúp đỡ nhiệt tình và những đóng góp chuyên môn quý báu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Công ty CP công nghệ sinh học thú y BTV (Biotech-Vet) đã cho phép tôi tiếp cận nguồn mẫu tại nhà máy trong quá trình thực hiện chương trình nghiên cứu sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn người thân và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi. Tôi cũng xin được dành những lời cảm ơn sâu nặng đến gia đình tôi: bố, mẹ, chồng, con đã yêu thương, cảm thông và chia sẻ với tôi công việc nhà, để tôi có thể tập trung học tập và nghiên cứu trong suốt những năm tháng gian khổ này. Nghiên cứu sinh Trần Thị Luyến MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. i DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .............................................................................. iv MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. TỔNG QUAN ................................................................................................................... 6 1.1. Cảm biến sinh học điện hóa .................................................................................... 6 1.1.1. Phân tích điện hóa ............................................................................................ 6 1.1.2. Cảm biến sinh học điện hóa............................................................................. 7 1.1.2.1 Nhu cầu phát triển cảm biến sinh học .............................................................. 7 1.1.2.2 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa.......................... 8 1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa trong và ngoài nước.......... 9 1.1.2.4 Tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa ............................................. 11 1.2. Biến tính bề mặt cảm biến sinh học điện hóa sử dụng vật liệu polime dẫn polypyrrole .................................................................................................................... 12 1.2.1. Vật liệu polime dẫn polypyrrole ứng dụng trong chế tạo cảm biến DNA điện hóa ..................................................................................................................... 12 1.2.2. Tổng hợp vật liệu polime dẫn polypyrrole sử dụng kỹ thuật điện hóa ..... 13 1.2.2.1. Cơ chế của quá trình polime hóa pyrrole sử dụng kỹ thuật điện hóa ...... 13 1.2.2.2. Một số kỹ thuật điện hóa được sử dụng để tổng hợp polime dẫn ............. 14 1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình polime hóa điện hóa pyrrole .......... 16 1.2.2.4. Quá trình doping polypyrrole .................................................................. 17 1.2.2.5. Vai trò của gelatin trong tổng hợp dây nano polypyrrole ........................ 20 1.3. Cố định phần tử cảm nhận sinh học lên cảm biến sinh học điện hóa ............... 21 1.3.1. DNA và kháng nguyên, kháng thể ................................................................ 21 1.3.1.1. DNA .......................................................................................................... 21 1.3.1.2. Kháng nguyên, kháng thể ......................................................................... 22 1.3.2. Các phương pháp cố định phần tử cảm nhận sinh học .............................. 24 1.3.2.1. Hấp phụ vật lý .......................................................................................... 24 1.3.2.2. Liên kết cộng hóa trị ................................................................................. 26 1.3.2.3. Ái lực sinh học .......................................................................................... 28 1.4. Tích hợp cảm biến sinh học điện hóa và bình phản ứng mini ........................... 32 1.5. Kỹ thuật điện hóa trong nhận biết các thành phần sinh học ............................. 34 1.5.1. Phương pháp phổ tổng trở điện hóa ............................................................. 34 1.5.1.1. Nguyên lý của phổ tổng trở điện hóa ....................................................... 34 1.5.1.2. Biểu diễn tổng trở trên mặt phẳng phức.................................................. 35 1.5.1.3. Mạch điện tương đương trong phổ tổng trở ............................................. 37 1.5.2. Phương pháp đo vi sai .................................................................................... 39 1.5.3. Phương pháp quét thế vòng (Cyclic Voltammetry - CV) ........................... 41 1.5.3.1. Nguyên lý của phương pháp CV ............................................................... 41 1.5.3.2. Quét thế vòng trên điện cực phẳng ........................................................... 42 2. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE ................................................................................................................ 45 2.1. Mở đầu .................................................................................................................... 45 2.2. Thực nghiệm ........................................................................................................... 45 2.2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 45 2.2.2. Điện cực tích hợp ............................................................................................ 46 2.2.3. Tổng hợp dây nano PPy sử dụng kỹ thuật điện hóa ................................... 46 2.2.4. Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs ............................................... 47 2.2.5. Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò ...................... 47 2.3. Kết quả và thảo luận .............................................................................................. 48 2.3.1. Tổng hợp dây nano PPy trên điện cực Pt..................................................... 48 2.3.1.1. Đặc tuyến điện hóa của hệ điện cực Pt tích hợp ...................................... 48 2.3.1.2. Giá trị điện thế trong phản ứng polyme hóa pyrrole ............................... 48 2.3.1.3. Ảnh hưởng của gelatin – khuôn nano trong chế tạo dây polyme ............. 50 2.3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ monome pyrrole ................................................ 51 2.3.1.5. Thời gian polime hóa ................................................................................ 53 2.3.1.6. Phổ FT-IR ................................................................................................. 54 2.3.1.7. Phổ Raman ............................................................................................... 55 2.3.2. Đặc trưng tín hiệu cố định DNA dò .............................................................. 56 2.3.3. Đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dò- DNA đích ............................................ 57 2.4. Kết luận ................................................................................................................... 60 3. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TÍCH HỢP HỆ VI LƯU ... 61 3.1. Mở đầu .................................................................................................................... 61 3.2. Thực nghiệm ........................................................................................................... 62 3.2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 62 3.2.2. Hệ ba điện cực tích hợp kết nối với bình phản ứng mini ........................... 62 3.2.3. Tổng hợp dây nano PPy trong vi bin ̀ h phản ứng ........................................ 65 3.2.4. Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs ............................................... 66 3.2.5. Phát hiêṇ tín hiêụ lai hóa DNA sử du ̣ng Lock-in Amplifier ....................... 66 3.3. Kết quả và thảo luâ ̣n .............................................................................................. 66 3.3.1. Kế t quả chế ta ̣o hê ̣vi kênh tích hơ ̣p với điêṇ cực ........................................ 66 3.3.1.1. Kế t quả đo bề dày vi kênh PDMS ............................................................. 67 3.3.1.2. Kế t quả gắ n kế t vi kênh PDMS và điê ̣n cực ............................................. 68 3.3.2. Đặc tuyến điện hóa của hệ ba điện cực tích hợp trong vi bin ̀ h phản ứng . 70 3.3.3. Tổ ng hơ ̣p PPy NWs trong vi bin ̀ h phản ứng ............................................... 71 3.3.4. Phát hiện hiện tượng lai hóa DNA ................................................................ 74 3.4. Kết luận ................................................................................................................... 77 4. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA TÍCH HỢP BÌNH PHẢN ỨNG MINI ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN VIRUS NEWCASTLE ............. 78 4.1. Mở đầu .................................................................................................................... 78 4.2. Thực nghiệm ........................................................................................................... 80 4.2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 80 4.2.2. Thiết kế và chế tạo hệ điện cực tích hợp bình phản ứng mini ................... 81 4.2.3. Cố định kháng thể trên bề mặt cảm biến ..................................................... 82 4.2.4. Phát hiện virus (bất hoạt) sử dụng cảm biến miễn dịch điện hóa .............. 83 4.2.5. Thống kê và xử lý số liệu ............................................................................... 83 4.3. Kết quả và thảo luâ ̣n .............................................................................................. 84 4.3.1. Đặc tuyến điện hóa của hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế đã chế tạo................................................................................................................... 84 4.3.2. Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể ........................................................... 87 4.3.3. Đặc trưng tín hiệu tương tác virus - kháng thể ........................................... 91 4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu ra của cảm biến miễn dịch ................. 92 4.3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể ............................................................ 92 4.3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp kháng thể - virus .................................. 95 4.3.5. Độ nhạy của cảm biến miễn dịch .................................................................. 97 4.4 Kết luận .................................................................................................................. 100 KẾT LUẬN CHUNG ........................................................................................................ 101 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ..................................... 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 104 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt 1 Ab Antibody Kháng thể 2 DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic 3 Ag Antigen Kháng nguyên 4 AO Atomic Orbital Obitan nguyên tử 5 APTES 3-aminopropyl–triethoxysilane 3-aminopropyl–triethoxy-silan 6 BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò 7 CE Counter Electrode Điện cực đối 8 CV Cyclic Voltammetry Phương pháp Von-Ampe vòng 9 DPV Diffirential Pulse Voltammetry Vi sai xung Voltammetry 10 EID50 50 % Empryo infective dose Liều nhiễm trùng trên phôi (gà) 11 EIS Electrochemical impedance spectroscopy Phổ tổng trở điện hóa 12 FE-SEM Field Emision Scanning Electron Microscope Hiển vi điện tử quét phát xạ trường 13 ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn men 14 FTIR Fourier transform infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 15 GA Glutaraldehyde Glutaraldehyde 16 GS Galvanostatic Phương pháp dòng không đổi 17 HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch cho người 18 HPV Human papillomavirus Virus gây ung thư cổ tử cung 19 IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Hiệp hội Hóa Tinh khiết và Ứng dụng Quốc tế 20 ISFET Ion sensitive field effect transistor Transistor hiệu ứng trường nhạy ion 21 ITO Indium tin oxide Oxit thiếc - Indi 22 MO Molecular Orbital Obitan phân tử 23 MPTMS (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane 24 NHS N-Hydroxysuccinimide N-Hydroxysuccinimide 25 PANi Polyaniline Polyaniline 26 PBS Phosphate buffered saline Dung dịch đệm phosphate TT i 27 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase 28 PDMS Polydimethylsiloxane Polydimethylsiloxane 29 PPy Polypyrrole Polypyrrole 30 PrA Protein A Protein A 31 PRE Psuedo reference electrode Điện cực so sánh thay thế 32 RE Reference electrode Điện cực so sánh 33 SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng hô hấp cấp tính nặng 34 SEM Scanning electron microscopy Hiển vi điện tử quét 35 SERS Surface Enhanced Raman Phổ Raman Tăng cường bề mặt Spectroscopy 36 SWV Square Wave Voltammetry Von-ampe sóng vuông 37 UV Ultraviolet Tử ngoại 38 WE Working Electrode Điện cực làm việc 39 WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số kết quả nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa trên thế giới ............. 9 Bảng 1.2: Một số kết quả nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa tại Việt Nam ........... 10 Bảng 1.3: Sự phụ thuộc của ∆Ep vào ψ tại nhiệt độ 25 ᵒC khi Eλ = Ep – 112,5/n mV và α = 0,5 ....................................................................................................................... 43 Bảng 2.1: Trình tự chuỗi đơn DNA ..................................................................................... 45 Bảng 2.2: Các thông số tổng trở mô phỏng theo mạch tương đương Randles .................... 59 Bảng 2.3: So sánh cảm biến DNA đã chế tạo với một số cảm biến DNA trong những công bố khác ................................................................................................................ 59 Bảng 3.1: So sánh cảm biến DNA tích hợp vi kênh PDMS chế tạo được với một số cảm biến DNA trong những công bố khác ......................................................................... 76 Bảng 4.1: Số lượng gia súc, gia cầm 01.10.2014 ................................................................ 78 Bảng 4.2: Qui trình chế tạo điện cực vàng WE và CE tích hợp .......................................... 81 Bảng 4.3: Các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo CV sử dụng hệ ba điện cực với điện cực so sánh tự chế tạo và điện cực so sánh thương mại...................................... 85 Bảng 4.4: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với điện cực vàng (WE) sau mỗi bước cố định kháng thể ......................................................................... 89 Bảng 4.5: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak và ∆Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với các điện cực cảm biến miễn dịch và cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi nồng độ kháng thể được cố định trên bề mặt cảm biến .................................................... 93 Bảng 4.6: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak và ∆Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với các điện cực cảm biến miễn dịch và cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi thời gian bắt cặp kháng thể - virus ..................................................................................... 96 Bảng 4.7: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak và ∆Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với các điện cực cảm biến miễn dịch và cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi hàm lượng virus Newcastle......................................................................................... 98 Bảng 4.8: So sánh kết quả dò tìm virus gây bệnh của một số loại cảm biến miễn dịch ...... 99 iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: a) Thống kê công bố khoa học sử dụng kỹ thuật “phân tích điện hóa”; (b) Thống kê công bố theo thời gian. Nguồn www.sciendirect.com ..................................... 6 Hình 1.2: Thống kê công trình công bố về “phân tích điện hóa ứng dụng trong y sinh” từ năm 2010 trở lại đây. Nguồn www.sciencedirect.com ......................................... 7 Hình 1.3: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học ......................................................... 8 Hình 1.4: Đường chronoamperometric của quá trình tổng hợp dây nano PPy trên điện cực Ni (−) và điện cực ITO (---) ................................................................................ 15 Hình 1.5: Polaron, bipolaron và sự hình thành các dải năng lượng tương ứng ................... 19 Hình 1.6: Cấu trúc của chuỗi geletin ................................................................................... 20 Hình 1.7: Cấu trúc và sự lai hóa của phân tử DNA ............................................................. 22 Hình 1.8: (a) Cấu trúc kháng thể IgG;(b) tương tác kháng nguyên - kháng thể .................. 23 Hình 1.9: Tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của PPy và điện tích âm của DNA… 25 Hình 1.10: Gắn kết kháng thể trên nền Si/SiO2 .................................................................. 26 Hình 1.11: Cố định DNA trên nền CS/Fe3O4/SPE .............................................................. 27 Hình 1.12: Quy trình chế tạo điện cực dC-PPy-PVS/Pt ..................................................... 28 Hình 1.13: a) Công thức hóa học của biotin; b) Sơ đồ cấu trúc liên kết giữa biotin – avidin .......................................................................................................................... 29 Hình 1.14: Quy trình chế tạo điện cực BdC-avidin-PPy-PVS/Pt ....................................... 29 Hình 1.15: Quy trình cố định kháng thể lên điện cực vàng và phát hiện kháng nguyên virus cúm A H5N1 .................................................................................................... 30 Hình 1.16: Quy trình cố định kháng thể cho cảm biến miễn dịch điện hóa nhằm phát hiện kháng nguyên Carcinoembryonic (CEA) ........................................................ 31 Hình 1.17: (A): điện cực vàng tích hợp; (B): vi kênh ........................................................ 32 Hình 1.18: (A): cảm biến điện hóa ba điện cực trên PDMS sau khi AgCl (màu đen) hình thành; (B): hệ lab-on-a-chip tích hợp với cảm biến điện hóa ba điện cực ....... 33 Hình 1.19: Sơ đồ khối mô phỏng nguyên lý đo tổng trở ..................................................... 34 Hình 1.20: Biểu diễn vector Fresnel trong mặt phẳng phức ................................................ 35 Hình 1.21: Tập hợp các điểm M vẽ nên một đường phổ tổng trở (dạng Nyquist) đặc trưng cho hệ khảo sát.................................................................................................. 35 Hình 1.22: Đồ thị tổng trở ở vùng tần số thấp ..................................................................... 36 Hình 1.23: Đồ thị tổng trở ở vùng tần số cao ...................................................................... 37 Hình 1.24: Sơ đồ biểu diễn tổng trở trên mặt phẳng phức .................................................. 37 Hình 1.25: Mạch điện tương đương Randles ...................................................................... 38 Hình 1.26: Hê ̣ đo vi sai sử du ̣ng Lock-in Amplifier SR830 DSP ....................................... 39 Hình 1.27: Da ̣ng sóng từ bô ̣ khuế ch đa ̣i Lock-in ................................................................ 39 Hình 1.28: Sơ đồ mạch tương đương của hệ đo vi sai ........................................................ 40 Hình 1.29: (a). Quét thế tuyến tính; (b). Quan hệ dòng thế trong phương pháp quét thế tuyến tính .................................................................................................................... 41 iv Hình 1.30: Thời điểm và điện thế bắt đầu quét thế ngược lại (λ và Eλ) .............................. 42 Hình 1.31: Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong quét thế vòng tuần hoàn ................. 42 Hình 2.1: (A): quy trình chế tạo rút gọn; (B): điện cực dùng làm cảm biến ....................... 46 Hình 2.2: Sơ đồ hệ điện hóa ba điện cực ............................................................................. 47 Hình 2.3: Quy trình cố định trực tiếp DNA dò lên cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano polypyrrole và phát hiện hiện tượng lai hóa DNA .............................................. 47 Hình 2.4: Đường CV khảo sát đặc tuyến điện hóa của hệ điện cực Pt tích hợp trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mV/s .............. 48 Hình 2.5: Đường CV tổng hợp PPy trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M ............................................................................................................................. 49 Hình 2.6: Đường chronoamperometric tổng hợp PPy trong Py 0,1 M, LiClO4 0,1 M, PBS và: (a) 0 %wt gelatin; (b): 0,08 %wt gelatin ....................................................... 50 Hình 2.7: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong pyrrole 0,1 M, LiClO4 0,1 M, PBS và:(a) 0 %wt gelatin; (b): 0,08 %wt gelatin. Thời gian tổng hợp PPy là 300s.... 51 Hình 2.8: Đường chronoamperometric tổng hợp PPy trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py: (a): 0,05 M; (b): 0,1 M và (c): 0.15 M ......................................... 51 Hình 2.9: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py: (a): 0,05 M; (b): 0,1 M và (c): 0.15 M. Thời gian tổng hợp PPy là 300s.. 52 Hình 2.10: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M: (a): 150 s; (b): 200 s; (c): 300 s; (d): 400 s .................................... 53 Hình 2.11: Phổ FT-IR của dây nano PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M ............................................................................................. 54 Hình 2.12: Phổ Raman tăng cường bề mặt của dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt. 55 Hình 2.13: Phổ tổng trở của điện cực: (a) Pt- PPy NWs; (b): Pt-PPy NWs-DNA dò..........56 Hình 2.14: Phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò tại các nồng độ DNA đích khác nhau ..................................................................................................................... 57 Hình 2.15: Mô hình mạch tương đương Randles được sử dụng trong luận án ................... 58 Hình 3.1: (a): mặt nạ cho chế tạo hệ ba điện cực tích hợp (Mask 1); (b): mặt nạ cho chế tạo khuôn SU-8 (Mask 2); ........................................................................................ 63 Hình 3.2: Polydimethylsiloxane .......................................................................................... 63 Hình 3.3: Quy triǹ h chế ta ̣o khuôn SU-8 ............................................................................. 64 Hình 3.4: Quy trình gắ n kế t sử du ̣ng chấ t làm đông............................................................ 65 Hình 3.5: Quy triǹ h gắ n kế t sử du ̣ng băng diń h .................................................................. 65 Hình 3.6: Hê ̣ đo vi sai sử du ̣ng Lock-in Amplifier SR830 DSP ......................................... 66 Hình 3.7: Cảm biến ba điện tích hợp sử dụng PRE Pt trong bình phản ứng mini. Kích thước của chip là 12 x 15 mm. ...................................................................................... 67 Hình 3.8: Kế t quả đo bề dày vi kênh PDMS phu ̣ thuô ̣c vào tố c đô ̣ quay phủ SU-8 3050 .. 67 Hình 3.9: Kiể m tra kế t quả gắ n kế t vi kênh PDMS và điê ̣n cực sử du ̣ng dung dich ̣ xanh metilen................................................................................................................. 68 v Hình 3.10: Kiể m tra chấ t lươ ̣ng gắ n kế t vi kênh PDMS và điê ̣n cực bằ ng lực cơ ho ̣c: (a)phương pháp plasma oxi và phương pháp sử du ̣ng chấ t đóng rắn; (b)-phương pháp sử du ̣ng băng dính ............................................................................................... 69 Hình 3.11: Sự hình thành nhóm –OH trên bề mặt vi kênh PDMS sau khi được xử lý trong buồng plasma oxy ............................................................................................... 69 Hình 3.12: Đường CV đo trong dung dịch: (a): K3Fe(CN)6 0,03 M; (b): K4Fe(CN)6 0,03 M; (c): K3Fe(CN)6 /K4Fe(CN)6 0,03 M, trong KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s của hê ̣ ba điê ̣n cực Pt tić h hơ ̣p trong vi bình phản ứng .................................................. 70 Hình 3.13: Ảnh FE-SEM của dây nano PPy đươ ̣c tổng hợp trong vi bình phản ứng sử dụng kỹ thuâ ̣t điê ̣n hoá: (a) phân cực thế tiñ h (0,5 V, 1200 s);(b) quét thế vòng tuầ n hoàn (0-0,6V, 6 vòng, tố c đô ̣ quét 25 mV/s) ...................................................... 71 Hình 3.14: Ảnh FE-SEM của các sản phẩm được tổng hợp điện hóa sử dụng kỹ thuật phân cực thế tĩnh (0,5 V, 150 s), dung dịch điện li gồm LiClO4 0,1 M, PBS, gelatin 0,08 % wt và: (a) không có Py; (b) Py 0.1 M trong vi bình phản ứng ........................ 72 Hình 3.15: Liên kết hidro giữa monome Py và gelatin ....................................................... 73 Hình 3.16: Đường CV của hệ ba điện tích hợp được đo trong vi bình phản ứng chứa dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M và KCl 0,1 M, tố c đô ̣ quét 25 mV/s: (a) trước và (b) sau khi tổng hợp điện hóa PPy NWs trên điện cực làm việc .................... 73 Hình 3.17: Phổ FT-IR của dây nano PPy được tổng hợp trong vi bình phản ứng, dung dịch điện li gồm LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 % wt gelatin và Py 0,1 M ........................ 74 Hình 3.18: Tín hiệu lai hóa DNA, CDNA dò = 10 μM, T = 298K: (a) Chuỗi DNA đích 2 nM; (b) Chuỗi DNA đích không kết cặp 2 nM ........................................................... 75 Hình 3.19: Tín hiệu lai hóa DNA tương ứng với các giá trị nồng độ DNA đích khác nhau76 Hình 4.1: Mô phỏng sơ lược hệ điện hóa mini đi kèm bình phản ứng mini và đầu đo tích hợp ............................................................................................................................................. 80 Hình 4.2: Hai điện cực vàng tích hợp (WE và CE) ............................................................. 81 Hình 4.3: Bình phản ứng mini kết nối với hệ điện cực ....................................................... 82 Hình 4.4: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ ba điện cực: WE Au, CE Au (tích hợp trên một chip) và điện cực so sánh thay thế (Ag/AgCl) tự chế tạo bằng cách nhúng dây Ag vào dung dịch FeCl3 0,1 M trong các khoảng thời gian: (a): 1 phút; (b): 3 phút; và (c): 5 phút. ...................................................................................................... 84 Hình 4.5: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ ba điện cực: WE Au, CE Au (tích hợp trên một chip) và (a): điện cực so sánh thay thế (Ag/AgCl) tự chế tạo;(b): điện cực so sánh thương mại (Ag/AgCl trong dung dịch KCl bão hòa) ................................ 85 Hình 4.6: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl và một chíp tích hợp (WE và CE) trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s, thực hiện lặp lại 10 vòng quét. ....................................................................................................... 86 vi Hình 4.7: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ một điện cực so sánh Ag/AgCl và sáu chíp tích hợp (WE và CE) trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s. ........................................................................................... 87 Hình 4.8: Qui trình cố định kháng thể IgY từ trứng gà lên trên bề mặt cảm biến miễn dịch ...................................................................................................................... 88 Hình 4.9: Sự hấp phụ của protein trên vàng ........................................................................ 88 Hình 4.10: Đường CV của điện cực: (a): Au; (b): Au/PrA; (c): Au/PrA/GA/Ab và (d): Au/PrA/GA/Ab/BSA (cảm biến miễn dịch) trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s ...................... 89 Hình 4.11: Đường CV của các điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA (cảm biến miễn dịch) khác nhau (cùng sử dụng một qui trình cố định kháng thể) trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s ...................... 90 Hình 4.12: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s ............................................................................................................... 91 Hình 4.13: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch; (b): cảm biến miễn dịch/virus VNNB trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s .................................................................................................................... 92 Hình 4.14: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi nồng độ kháng thể được cố định trên bề mặt cảm biến: (A): 20 µg/ml, (B): 30 µg/ml, (C): 40 µg/ml, (D): 50 µg/ml và (E): 60 µg/ml .......... 93 Hình 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể (được cố định trên bề mặt cảm biến) đến giá trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch ........................................................................ 94 Hình 4.16: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi thời gian bắt cặp kháng thể - virus: (b): 15 phút, (c): 30 phút, (d): 45 phút, (e): 90 phút và (f): 60 phút ........................................ 95 Hình 4.17: Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp kháng thể - virus (trên bề mặt cảm biến) đến giá trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch ........................................................................ 96 Hình 4.18: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi hàm lượng virus Newcastle: (b):102 EID50/ml, (c):103 EID50/ml, (d):104 EID50/ml, (e):105 EID50/ml và (f):106 EID50/ml ... 97 Hình 4.19: Sự thay đổi tín hiệu đầu ra của cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) phụ thuộc vào hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml) ............................................................... 98 vii MỞ ĐẦU Hiện nay, các phương pháp phân tích sinh học phân tử truyề n thố ng (PCR, ELISA…) đang được sử dụng phổ biến, cho kết quả tốt và độ chính xác cao. Dẫu vậy, mọi kỹ thuật phân tích tiên tiến đều có những điểm còn chưa hoàn thiện [8,47] cần có hoạt động R&D để nâng cấp hoặc thậm chí thay thế. Các phương pháp trên đều phức tạp, yêu cầu kỹ thuật viên có tay nghề cao, yêu cầu phòng thí nghiệm hiện đại tại những trung tâm nghiên cứu, phân tích trung ương hoặc các thành phố lớn, trong quá trình thực hiện cần phải sử dụng các sinh phẩm và hóa chất đặc hiệu. Các phương pháp trên đều cần hàng giờ đến hàng ngày để thực hiện và đặc biệt, các thiết bị phân tích, chẩn đoán không thể dịch chuyển ra khỏi nơi lắp đặt ban đầu [123]. Đây cũng là một trong những điểm tồn tại cần được giải quyết khi thực hiện các chiến dịch phân tích lưu động. Việc nghiên cứu và phát triển những kỹ thuật phân tích có khả năng bổ sung, thậm chí thay thế một phần những kỹ thuật phân tích truyền thống là thực sự cần thiết. Trong số đó cảm biến sinh học là một trong những thiết bị được kỳ vọng thay thế một phần các kỹ thuật phân tích truyền thống nhờ khả năng ứng dụng rộng rãi trong phát hiện virus gây bệnh, chẩn đoán lâm sàng, giám sát môi trường, phân tích độc học trong thực phẩm…[60,92]. Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi (transducer). Phần tử nhận biết sinh học có thể là DNA, tế bào, enzyme..., giữ vai trò dò tìm đối tượng đích trong mẫu phân tích. Mẫu phân tích có thể là mẫu máu, mẫu nước tiểu hay vi khuẩn, virus... Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên- kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym- cơ chất (cảm biến enzym)… Khi diễn ra tương tác sinh học đặc hiệu giữa phần tử nhận biết sinh học và đối tượng đích, phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo. Có nhiều dạng chuyển đổi như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt … Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có khả năng ứng dụng lớn trong phân tích các đối tượng y sinh vì những ưu điểm nổi bật như thời gian phân tích nhanh, độ nhạy và độ chọn lọc cao, thiết bị nhỏ gọn, sử dụng đơn giản, chi phí thấp. Cảm biến sinh học điện hóa hoạt động dựa trên kết quả khảo sát những thay đổi về đặc tính điện hóa khi diễn ra tương tác sinh học giữa phần tử dò và phần tử đích trên bề mặt cảm biến. Tuy nhiên, khi nồng độ phần tử đích rất nhỏ, tương tác sinh học chỉ làm thay đổi một phần rất nhỏ tín hiệu điện hóa trên bề mặt của màng sinh học (nơi gắn kết phần tử dò). Vì vậy, để phát triển thành công một bộ cảm biến sinh học điện hóa không những phụ thuộc vào việc nghiên cứu thiết kế và chế tạo điện cực, phương pháp biến tính bề mặt điện cực 1 nhằm nâng cao hiệu quả của qui trình cố định phần tử cảm nhận sinh học lên trên bề mặt điện cực mà còn phụ thuộc vào việc xây dựng các qui trình đo lường điện hóa nhằm phát hiện phần tử đích trong mẫu phân tích. Để có thể thực hiện được những nhiệm vụ trên, đòi hỏi sự kết hợp đa ngành giữa hóa học, sinh học, vật lý, khoa học vật liệu, điện tử và y sinh...Trong các nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng trong phân tích y sinh, vấn đề giảm thể tích mẫu phân tích, đồng thời cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu luôn là thách thức đặt ra cho các nhóm nghiên cứu. Cảm biến sinh học điện hóa được tích hợp với hệ vi lưu hay một vi bình phản ứng sẽ giúp thu nhỏ hệ thống phân tích. Hơn nữa, cảm biến sinh học điện hóa tích hợp với bình phản ứng mini còn là bước khởi đầu quan trọng trong mục tiêu hướng tới chế tạo và phát triển một hệ thống phân tích điện hóa cầm tay, sẽ giúp giải quyết những nhược điểm của các phương pháp phân tích y sinh truyền thống và giữ vai trò quan trọng trong việc thực hiện các nhiệm vụ phân tích lưu động. Đây là vấn đề nghiên cứu còn mới và đang thu hút được sự quan tâm của các nhóm nghiên cứu tại Việt Nam. Vì những lí do trên, chúng tôi quyết định thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu”. Mục tiêu của luận án: Mục tiêu của luận án là nghiên cứu chế tạo và tích hợp cảm biến sinh học điện hóa và vi bình phản ứng ứng dụng trong phát hiện các thành phần sinh học, bao gồm: 01) biến tính bề mặt cảm biến sử dụng vật liệu có cấu trúc nano nhằm nâng cao hiệu quả cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến; 02) tích hợp hệ điện cực với vi bình phản ứng nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu thụ và 03) phát triển và tùy biến qui trình đo lường điện hóa sử dụng cảm biến sinh học không đánh dấu nhằm phát hiện các thành phần sinh học. Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu của luận án là nghiên cứu thực nghiệm. Cách tiếp cận trong quá trình nghiên cứu là từ các kết quả thực nghiệm, kết hợp với lý thuyết và các tài liệu tham khảo, giải thích, so sánh, đánh giá và tối ưu qui trình thực nghiệm. Nội dung của luận án: Để giải quyết được mục tiêu của đề tài, luận án tập trung nghiên cứu 3 nội dung: Nội dung nghiên cứu 1: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole. Trong nội dung nghiên cứu 1, mục tiêu của NCS là làm quen với các kỹ thuật điện hóa được thực hiện trong một hệ đo mở, các phép đo điện hóa không sử dụng các điện cực thương mại mà trên cơ sở các điện cực tự thiết kế và phát triển, vật liệu thể mềm cấu trúc nano (dạng dây) được chế tạo giữ vai trò làm lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt cảm biến và bộ chuyển đổi, giúp nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, DNA được lựa chọn làm đối tượng đo nhờ độ bền, độ ổn định cao và dễ đặt mua. Nội dung nghiên cứu 1 bao gồm: nghiên cứu tổng hợp dây nano polypyrrole trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa nhằm biến tính bề mặt cảm biến; nghiên cứu cố định DNA 2 dò lên bề mặt cảm biến trên cơ sở dây nano polypyrrole; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dò – DNA đích của cảm biến DNA điện hóa đã chế tạo. Nội dung nghiên cứu 2: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu. Phát triển từ các kết quả đã đạt được trong nội dung nghiên cứu 1 với các phép đo điện hóa được thực hiện trong hệ đo mở, đối với nội dung nghiên cứu 2, luận án tập trung nghiên cứu các tính chất điện hóa diễn ra khi thu nhỏ bình điện hóa. Việc thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng mẫu tiêu thụ có ý nghĩa quan trọng trong phân tích y sinh vì các mẫu phân tích có thể là mẫu máu, vi khuẩn, virus… Nội dung nghiên cứu 2 bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo và gắn kết hệ ba điện cực tích hợp Pt và vi kênh PDMS; nghiên cứu tổng hợp điện hóa dây nano polypyrrole bên trong vi bình phản ứng nhằm cố định DNA trong chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp với hệ vi lưu; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dò – DNA đích của cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu đã chế tạo với các phép đo điện hóa được thực hiện trong hệ đóng. Nội dung nghiên cứu 3: Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle. Sau khi hoàn thành nội dung nghiên cứu 2 với các qui trình đo lường điện hóa được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ, trong nội dung nghiên cứu 3 luận án sẽ tiến gần thêm một bước đến ứng dụng thực tiễn. Các kết quả đạt được của luận án dự kiến sẽ không chỉ dừng lại ở các bài báo khoa học mà còn có khả năng hướng đến sự hợp tác với các công ty, các nhà sản xuất. Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử dụng DNA làm phần tử dò cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, đòi hỏi chi phí cao và thời gian dài, luận án sẽ sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà – một sản phẩm đã được bán trên thị trường do công ty cổ phần công nghệ sinh học thú y BTV (Biotech-Vet) cung cấp, tương lai hướng đến việc đánh giá chất lượng kháng thể theo đơn đặt hàng. Nội dung nghiên cứu 3 bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo và ghép nối hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl và một bình phản ứng mini; nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà lên trên bề mặt cảm biến sinh học; nghiên cứu ứng dụng cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini đã chế tạo trong phát hiện virus Newcastle. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án: Nhận thấy các phương pháp phân tích truyền thống đang được áp dụng rộng rãi, có phổ kết quả rộng, độ chính xác cao nhưng đồng thời cũng có nhiều bất cập khi triển khai sử dụng như đòi hỏi đội ngũ kỹ thuật viên có tay nghề cao, thiết bị và sinh phẩm, hóa chất đắt tiền, chỉ tập trung ở các cơ sở phân tích tại các thành phố lớn, trung ương..., luận án hướng tới việc phát triển một kỹ thuật phân tích mới trong đó tập trung vào việc làm tăng độ nhạy, độ chọn lọc, làm giảm lượng mẫu phân tích và thời gian phân tích. Luận án tập trung vào phát triển cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thông tin di truyền (DNA) và kháng thể của vật chủ, sử dụng kỹ thuật đo lường điện hóa. Để phát triển cảm biến sinh học điện hóa, trước tiên, luận án đã tập trung nghiên cứu thiết kế và chế tạo các điện 3 cực khác với điện cực truyền thống. Bề mặt điện cực sau đó được biến tính trên cơ sở lớp vật liệu trung gian với cấu trúc nano. Trên bề mặt phân cách giữa dung dịch chứa mẫu phân tích và màng sinh học có cấu trúc nano, các tính chất hóa lý diễn ra có phần khác so với những tính chất đó ở các điện cực truyền thống. Các kỹ thuật quét thế vòng, thế không đổi, tổng trở và kỹ thuật đo vi sai đã được triển khai để nghiên cứu các tính chất điện hóa tại đây. Đối với việc phát triển cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng trong phát hiện các thành phần sinh học, vấn đề giảm thể tích mẫu phân tích, thu nhỏ hệ thống phân tích có ý nghĩa quan trọng. Luận án đã tập trung nghiên cứu các kỹ thuật đo lường điện hóa trong một vi bình phản ứng có thể tích rất nhỏ thay vì thực hiện các phép đo trong hệ mở. Những đóng góp mới của luận án: Một trong những đóng góp mới của luận án là đã tổng hợp được vật liệu polime dẫn polypyrrole (PPy) với cấu trúc dây nano nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm biến, nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học. Dây nano PPy được tổng hợp trực tiếp trên điện cực làm việc (WE), sử dụng kỹ thuật polime hóa điện hóa, khắc phục được tình trạng vật liệu PPy được tạo thành dưới dạng đảo, có cấu trúc hoa súp lơ. Đặc biệt, việc tổng hợp thành công vật liệu PPy có cấu trúc nano tại chính xác một vị trí mong muốn bên trong vi bình phản ứng (thể tích 4 µl) là một thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm được. Hiện nay, số lượng công trình công bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp cấu trúc nano bên trong hệ tích hợp vẫn còn rất hạn chế. Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch cũng là một trong những đóng góp mới của luận án. Luận án cũng đã góp phần quan trọng trong việc thiết kế, chế tạo và gắn kết bình phản ứng kích thước nhỏ tích hợp hệ điện cực có khả năng ghép nối với mạch đo, trên cơ sở đó làm giảm lượng mẫu phân tích, làm tăng tỷ lệ tín hiệu/nhiễu khi đo lường. Hiện tại, đây là vấn đề nghiên cứu còn mới tại Việt Nam. Thêm một đóng góp mới của luận án, đó là việc phát triển và tùy biến các qui trình đo lường điện hóa được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ sử dụng cảm biến sinh học không đánh dấu nhằm phát hiện các phần tử sinh học: DNA và virus Newcastle. Ngoài ra, việc làm chủ công nghệ chế tạo cảm biến điện hóa ba điện cực theo phương pháp planar với chất lượng tương đương sản phẩm thương mại hiện nay cũng là một trong những đóng góp thuyết phục của luận án. Bố cục của luận án: Luận án được trình bày trong 103 trang (không kể phần mục lục và danh mục các tài liệu tham khảo). Cấu trúc của luận án gồm: Mở đầu 1. Tổng quan 2. Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole 3. Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu 4 4. Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle Kết luận Các kết quả chính của luận án đã được công bố trong 09 công trình khoa học, trong đó có 02 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành quốc tế ISI, 04 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành trong nước và 03 báo cáo tại các hội nghị trong nước và quốc tế. 5 1. TỔNG QUAN 1.1. Cảm biến sinh học điện hóa 1.1.1. Phân tích điện hóa Đứng trước nhu cầu rất cao của xã hội, việc phát triển một hệ thống phân tích đáp ứng được đầy đủ các yêu cầu như thời gian phân tích nhanh, độ chính xác, độ chọn lọc, độ nhạy cao, thiết bị đơn giản, chi phí thấp là hết sức cần thiết. Các phương pháp phân tích truyền thống như phân tích thể tích, phân tích khối lượng sử dụng thiết bị đơn giản, có sẵn ở các phòng thí nghiệm, chi phí phân tích hợp lý nhưng hạn chế của các phương pháp trên là chỉ áp dụng được với hàm lượng mẫu lớn, thời gian phân tích kéo dài, độ nhạy, độ chọn lọc không cao, nhiều yếu tố gây nhiễu, sai số [3]. Một bước tiến quan trọng của các phương pháp phân tích hiện đại như phương pháp quang phổ [4], phương pháp sắc kí [3], phương pháp phân tích điện hóa (độ dẫn điện, điện thế, cực phổ, điện lượng, vol ampe…) [11] là cho phép phân tích những lượng mẫu nhỏ với độ nhạy, độ lặp, độ chọn lọc, độ chính xác, độ tin cậy cao và thời gian phân tích nhanh [3]. Trong các phương pháp phân tích hiện đại, phân tích điện hóa luôn là đề tài hấp dẫn các nhà khoa học trong nhiều thập kỷ liên tiếp. Phương pháp phân tích điện hóa đã được hình thành từ thế kỉ 19 và cho đến nay vẫn không ngừng phát triển và hoàn thiện. Ưu điểm lớn của phương pháp là ở chỗ khi hệ đo chịu tác động điện (dòng, thế) thì đáp ứng nhận được cũng là tín hiệu điện. Đặc điểm nổi bật của phương pháp phân tích điện hóa là độ nhạy và độ chọn lọc cao, không đòi hỏi thể tích dung dịch lớn (nhỏ hơn 1 ml) [11]. Thành công của kỹ thuật điện hóa được thể hiện trong nhiều lĩnh vực như hóa học, sinh học, thực phẩm, dược phẩm, y học, quốc phòng, khoa học vật liệu, hàng không, môi trường [28,127,130]…Đà tăng trưởng trong nghiên cứu cơ bản, nghiên cứu và phát triển các sản phẩm ứng dụng cho phân tích điện hóa đã phản ánh sự quan tâm sâu sắc của các trung tâm nghiên cứu khoa học hàng đầu, các tập đoàn công nghệ quốc tế. (a) (b) Hình 1.1: a) Thống kê công bố khoa học sử dụng kỹ thuật “phân tích điện hóa”; (b) Thống kê công bố theo thời gian. Nguồn www.sciendirect.com Thống kê trên hệ thống sciencedirect.com, hệ thống công bố khoa học lớn nhất hiện nay, với từ khóa “Electrochemical Analysis” (phân tích điện hóa) trong giai đoạn 2010-2016, 6