Tài liệu Nghiên cứu phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp bằng hydro peroxit (h2o2 ) và khảo sát khả năng hấp phụ ion kim loại nặng

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC LÊ THỊ LINH TRANG NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG ĐIỀU CHẾ CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP BẰNG HIDRO PEROXIT (H2O2) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HẤP PHỤ ION KIM LOẠI NẶNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa Công nghệ môi trƣờng HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Lê Cao Khải, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Hóa Học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2, đã tạo điều kiện cho em được tiếp thu những kiến thức chuyên môn về hóa học hữu cơ và công nghệ môi trường. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Ý Nhi - Viện Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em các phương pháp nghiên cứu khoa học và những kinh nghiệm học thuật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị tại Viện Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Sinh viên Lê Thị Linh Trang DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của β-chitin........................................................... 33 Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của β-chitosan ...................................................... 35 Hình 3.3: Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan .............................................. 35 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa /C và C ................................ 36 Hình 3.5: Phổ FT-IR của chitosan khối lượng phân tử thấp .......................... 40 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của chitosan khối lượng phân tử thấp ..................... 41 Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của chitosan khối lượng phân tử thấp .................... 41 Hình 3.8: Phổ nhiễu xạ tia X của Chitosan khối lượng phân tử thấp ............ 42 Hình 3.9: Khả năng hấp phụ Cd2+ của LWC.................................................. 43 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số các kim loại nặng và ảnh hưởng của chúng đến cơ thể sống ... 21 Bảng 2.1: Thành phần chính của một số nguyên liệu chứa chitin ................ 27 Bảng 3.1: Hàm lượng β-chitin trong mai mực ống ........................................ 33 Bảng 3.2: Kết quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan tại các nồng độ khác nhau. ................................................................................................................ 36 Bảng 3.3: Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ H2O2 khác nhau......................................................................................................... 37 Bảng 3.4: Kết quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở nhiệt độ khác nhau .......................................................................................... 38 Bảng 3.5: Mối quan hệ giữa độ tan và khối lượng phân tử trung bình của các mẫu LWC ........................................................................................................ 39 Bảng 3.6: Độ dịch chuyển hóa học của proton (1H) của chitosan.................. 41 Bảng 3.7: Độ dịch chuyển hóa học của cacbon (13C) của chitosan ................ 42 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, chitin, chitosan .......................................... 4 Sơ đồ 1.2: Sơ đồ điều chế chitosan................................................................. 10 Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống ........................... 10 Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan .......................................... 11 Sơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin ........................................................ 11 Sơ đồ 1.6: Sơ đồ cơ chế phản ứng thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan.......... 16 Sơ đồ 1.7: Cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl (phản ứng SN2)..................... 17 Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp ................... 30 Sơ đồ 3.1: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin ........................................................ 34 BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN Ac: CH3CO CTS: Chitosan DDA: Độ đề axetyl hóa DA: Độ axetyl hóa DMAc: N,N-đimetyl axetamit DP: Độ polymer hóa trung bình GlcN: D-glucosamin GlcNAc: N-axetyl-D-glucosamin IR: Hồng ngoại LAB: Lactic axit bacterial M n : Khối lượng phân tử trung bình Me: CH3 NMR: Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân LWC: Chitosan khối lượng phân tử thấp MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3 1. Giới thiệu chung [1,2,4,15,21] .................................................................... 3 1.1. Cấu trúc tinh thể [1,2,4,31] ........................................................................ 4 1.2. Tính tan [22,28] .......................................................................................... 5 1.3. Khối lượng phân tử [22]............................................................................. 5 1.4. Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,14,18] ...................... 6 2. Phƣơng pháp điều chế chitin/chitosan [8,20] ........................................... 8 2.1. Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,19,20] ................................... 8 2.2. Điều chế chitosan [1, 2, 4, 20] ................................................................... 9 3. Tính chất hóa học [1,2,5] .......................................................................... 11 3.1 Phản ứng ở nhóm -OH .............................................................................. 11 3.2. Phản ứng ở nhóm axetamit....................................................................... 11 3.3. Phản ứng ở nhóm -NH2 ............................................................................ 12 3.4. Phản ứng cắt mạch chitosan ..................................................................... 12 3.4.1. Phương pháp chiếu xạ........................................................................... 13 3.4.2. Phương pháp thủy phân bằng enzym .................................................... 14 3.4.3. Phương pháp hóa học ........................................................................... 15 4. Giới thiệu sơ lƣợc về kim loại nặng ......................................................... 18 4.1. Ảnh hưởng của kim loại nặng và hậu quả của chúng .............................. 19 4.2. Giới thiệu về cadimi ................................................................................. 21 5. Một số ứng dụng của chitin/chitosan và dẫn xuất ................................. 22 5.1. Ứng dụng trong xử lý nước thải ............................................................... 23 5.1.1. Hấp phụ ion kim loại nặng [35]............................................................ 23 5.1.2. Hấp phụ thuốc nhuộm hoạt tính [12,21,34] ......................................... 23 5.2. Ứng dụng trong y dược [16,29] ............................................................... 24 5.3. Ứng dụng trong nông nghiệp ................................................................... 24 5.3.1. Chất kích thích sinh trưởng [11,34] ..................................................... 24 5.3.2. Chất bảo quản nông sản [17,25,32,36] ................................................ 25 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 26 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ....................... 26 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất............................................................................ 26 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ................................................................. 26 2.2. Thực nghiệm: .......................................................................................... 27 2.2.1. Điều chế Chitin/chitosan: ...................................................................... 27 2.2.1.1. Điều chế chitin: .................................................................................. 27 2.2.1.2. Điều chế chitosan: .............................................................................. 28 2.2.1.3. Xác định độ axetyl hóa /deaxetyl hóa: ............................................... 29 2.2.1.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình số của chitosan .................. 29 2.2.2. Điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) .............................. 30 2.2.2.1. Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp ....................... 30 2.2.2.2. Khảo sát phản ứng với điều kiện thí nghiệm khác nhau .................... 30 2.2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến khối lượng phân tử   trung bình M n của chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) ..................... 30 2.2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử trung bình ( M n ) của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC)................... 31 2.2.2.2.3. Khảo sát tính tan trong nước của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC) ......................................................................................................................... 31 2.2.3. Thăm dò khả năng hấp phụ ion kim loại nặng của chitosan khối lượng phân tử thấp. .................................................................................................... 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33 3.1. Điều chế chitin/chitosan ......................................................................... 33 3.1.1. Điều chế chitin ...................................................................................... 33 3.1.2. Điều chế chitosan từ chitin theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt độ cao. ............................................................................................................. 34 3.1.2.1. Phổ hồng ngoại .................................................................................. 34 3.1.2.2. Phổ X-Ray .......................................................................................... 35 3.1.2.3. Khối lượng phân tử ............................................................................ 36 3.2. Khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng đến phản ứng điều chế chitosan khối lƣợng phân tử thấp ............................................................................... 37 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử trung bình ( Mn ) sản phẩm phản ứng đề polyme hoá chitosan................................................... 37 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng phân tử trung bình ( Mn ) sản phẩm phản ứng đề polyme hoá chitosan ........................................................ 37 3.2.3. Đánh giá độ tan trong nước của các mẫu chitosan trọng lượng phân tử thấp .................................................................................................................. 39 3.3. Xác định cấu trúc của chitosan khối lƣợng phân tử thấp .................. 39 3.4. Nghiên cứu sơ bộ khả năng hấp phụ Cd2+ của sản phẩm phản ứng . 42 KẾT LUẬN CHUNG .................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Chitin [poly-β-(1→4)-2-axetamiđo-2-đeoxy-D-glucopyranozơ], một polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau xenlulozơ, là thành phần chính của vỏ các loài động vật giáp xác như: vỏ tôm, mai cua, mai mực… Chitin/chitosan là một polyme có nhiều tính chất đặc biệt: Tính hòa hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống độc… Do đó được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, dược phẩm, nông nghiệp, mỹ phẩm, công nghệ môi trường… Ở Việt Nam, giáp xác là nguồn nguyên liệu dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy hải sản. Trong công nghiệp chế biến thủy hải sản xuất khẩu chiếm đến 70% - 80% công suất chế biến. Hằng năm, các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm, chính lượng phế thải này đã gây ra hiện tượng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, gây ảnh hưởng lớn đến cuộc sống và sức khỏe của người dân. Vấn đề ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm và có tính toàn cầu. Sự bùng nổ dân số cùng với tốc độ đô thị hóa, công nghiệp hóa nhanh chóng đó tạo ra một sức ép lớn tới môi trường sống ở Việt Nam, đặc biệt là với việc nguồn nước sinh hoạt ngày càng trở nên thiếu hụt và ô nhiễm. Một trong số những tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước chính là ion kim loại nặng. Ở nồng độ thấp, các nguyên tố như Fe (II, III), Cu (II), Mn (II, VII)… là những nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho cơ thể. Nhưng khi ở nồng độ cao, chúng tích lũy theo chuỗi thức ăn gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Một số nguyên tố như: Cr (VI), Cd (II), As (III,V)… còn được biết đến như tác nhân gây ung thư. Đã có nhiều loại vật liệu được sử dụng để loại bỏ ion kim loại ra khỏi nguồn nước như: silicagel, zeolit, ligin, tảo biển, rong biển, chitosan, vật liệu clay, bã mía, than hoạt tính, chất dẻo tổng hợp… Tuy nhiên, trong số vật Lê Thị Linh Trang 1 Lớp: K38A - SP Hóa học liệu hấp phụ có nguồn gốc thiên nhiên thì chitin/chitosan và dẫn xuất của nó được cho là vật liệu có khả năng tạo phức tốt nhất với ion kim loại nặng, ion quý hiếm, thuốc nhuộm và có thể tái sử dụng. Vì vậy, nghiên cứu tổng hợp vật liệu hấp phụ sinh học trên cơ sở chitin/chitosan đã và đang được nhiều tác giả tiếp tục quan tâm và nghiên cứu. Để góp phần mở rộng ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất, góp phần bảo vệ môi trường, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp bằng hydro peroxit (H2O2) và khảo sát khả năng hấp phụ ion kim loại nặng”. 2. Mục đích nghiên cứu Điều chế chitosan khối lượng phân tử <10 000 Da bằng tác nhân oxy hóa (H2O2) và nghiên cứu thăm dò khả năng hấp phụ ion kim loại nặng trong môi trường nước của sản phẩm. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát các điều kiện phản ứng để điều chế oligochitosan: ảnh hưởng của nồng độ H2O2, thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng... để điều chế chitosan khối lượng phân tử <10000 Da - Khảo sát các tính chất hóa lý của sản phẩm. - Khảo sát khả năng hấp phụ của ion kim loại nặng của sản phẩm. Lê Thị Linh Trang 2 Lớp: K38A - SP Hóa học CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu chung [1,2,4,15,21] Trong số các polysaccarit, chitin là nguồn tài nguyên sinh học tự nhiên phong phú chỉ sau xenlulozơ. Chitin có cấu trúc phân tử tương tự như xenlulozơ, mạch phân tử của chitin gồm các mắt xích N-axetyl-D-glucosamin nối với nhau bằng liên kết (14) glycosit hay 2-axetamido-2-deoxy- -Dglucozơ. Chitosan là sản phẩm deaxetyl hoá của chitin có tên gọi là 2-amido2-deoxy - -D-glucozơ. Trong thực tế chitin, chitosan cùng tồn tại trong một phân tử polymer, gồm các mắt xích (14)-N-axetyl-D-glucosamin và mắt xích (14) - D - glucosamin. Khi tỷ lệ (14)-D-glucosamin nhiều hơn thì được gọi là chitosan, ngược lại là chitin. Vì trong mắt xích: (14)-Dglucosamin có nhóm amino (-NH2) nên chitosan dễ tan trong một số dung dịch axit loãng như axit axetic 1%, axit focmic, trong khi đó chitin hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ. Tính tan của chitin - chitosan trong dung dịch axit axetic loãng tăng theo chiều tăng của tần suất xuất hiện nhóm amin trong mắt xích phân tử. Người ta sử dụng đặc điểm này để phân biệt chitin hay chitosan. Nếu tan trong axit axetic loãng thì gọi là chitosan, nếu không tan thì gọi là chitin. Ngoài ra có thể phân biệt bằng giá trị độ axetyl hoá (DA), hay độ deaxetyl hoá (DDA), DA=(1-DDA), nếu DA>50% được gọi là chitin, nếu DA<50% thì được gọi là chitosan. Chitin-chitosan là polysacarit duy nhất có chứa nhóm chức amin nên được đánh giá là vật liệu có tiềm năng hơn xenlulozơ trong nhiều lĩnh vực với nhiều tính chất quý như có khả năng phân hủy sinh học, có khả năng tương hợp sinh học và đặc biệt là có hoạt tính sinh học. Chính vì vậy, ngày nay chitin-chitosan và các dẫn xuất vẫn đang được quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong nhiều các lĩnh vực khác nhau như y dược, công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, công nghệ môi trường…vv. Lê Thị Linh Trang 3 Lớp: K38A - SP Hóa học OH 6 4 HO 1 3 OH OH O 5 2 HO O O OH O HO HO O OH OH OH OH O O OH O O HO HO O OH OH O O OH Xenluloz¬ OH NHCOCH3 O HO O O HO O NHCOCH3 HO OH HO O NHCOCH3 OH OH NHCOCH3 O HO O O NHCOCH3 O O O HO O NHCOCH3 OH OH Chitin OH O HO OH NH2 HO O NH2 O O HO OH OH NH2 O HO O NH2 O O HO O NH2 HO O NH2 OH O O OH Chitosan Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, chitin, chitosan 1.1. Cấu trúc tinh thể [1,2,4,31] Chitin là một loại polisaccarit mạch thẳng với khối lượng phân tử lớn được tạo bới mắt xích N-axetyl-D-glucozamin theo liên kết β(1→4)glucozit như kiểu liên kết các mắt xích D-glucozo ở xenlulozo. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đã phát hiện chitin có 3 kiểu đa hình là: α, β, γ-chitin được mô tả theo hình sau: Chitin Chitin Chitin - α-chitin: cấu trúc tinh thể mạng ghép đôi song song (một mạng lên một mạng xuống liền nhau), α-chitin thường được tách từ vỏ cua. - β-chitin: các mạch ghép trong tinh thể theo cách ghép song song cùng chiều, β-chitin chủ yếu có trong mai mực nang sừng. - γ-chitin: có mạch ghép trong tinh thể theo 2 cách, cứ 2 mạch song song lại có 1 mạch đối song, γ-chitin được tách từ sợi kén của bọ cánh cứng, dạ dày của mực ống, là loại có trữ lượng ít nhất. Lê Thị Linh Trang 4 Lớp: K38A - SP Hóa học 1.2. Tính tan [22,28] Chitin thể hiện ái lực hạn chế với phần lớn các dung môi vì có liên kết hidro chặt chẽ giữa các phân tử. Chitin thường (α-chitin) không tan và hầu như không trương trong dung môi thông dụng mà chỉ tan trong một số dung môi đặc biệt, ví dụ: N,N-dimetylaxetamit (DMAC) có chứa 5-10% LiCl. Chitosan là một polyamin không tan trong nước cũng như trong dung môi hữu cơ nhưng tan trong môi trường axit loãng. Độ tan của chitosan phụ thuộc vào độ axetyl hóa, loại axit và nồng độ axit trong dung dịch. Khi xử lý chitin/chitosan trong môi trường axit mạnh với nồng độ lớn thường xảy ra phản ứng depolyme hóa (cắt mạch) làm giảm khối lượng phân tử polyme. 1.3. Khối lƣợng phân tử [22] Khối lượng phân tử chitin/chitosan là thông số quan trọng nhưng khó có thể xác định được chính xác do tính tan kém của chúng và sự đa dạng về kiểu phân bố các nhóm axetyl cũng như mức độ axetyl hóa. Khối lượng phân tử của chitin tự nhiên càng khó xác định vì nó tồn tại ở dạng chặt chẽ với protein, muối khoáng cũng như hầu hết các chất màu. Hơn nữa, độ dài mạch chính của chitin/chitosan có thể giảm trong quá trình xử lý với axit và kiềm. Khối lượng phân tử chitin sau khi tách khỏi protein cũng như các chất khác được tính toán theo các phương pháp đo độ nhớt, sắc ký thẩm thấu gel (GPC-Gel Permeation Chromatography) hoặc sắc ký loại trừ theo độ lớn phân tử (SEC -Size Exclusion Chromatography) trong dung môi DMAc/LiCl. Kết hợp các phương pháp SEC, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt thì có thể xác định được chính xác khối lượng phân tử trung bình và độ phân bố của khối lượng phân tử. Từ các số liệu thu được từ phương pháp GPC đã khẳng định các mẫu chitin tách từ mai cua, vỏ tôm và mai mực ống có độ polyme hóa (degree of polymeizaion - DP) nằm trong khoảng 2000 - 4000. Chitosan tan được trong dung dịch axit loãng và khối lượng phân tử có thể Lê Thị Linh Trang 5 Lớp: K38A - SP Hóa học xác định theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép nối với cột loại trừ theo độ lớn phân tử (SE-HPLC-size exlusion high performance liquid chromatography). GPC-HPLC, GPC, phương pháp đo độ nhớt… cũng có thể chuyển hóa chitosan thành chitin qua phản ứng N-axetyl hóa và khối lượng phân tử được tính theo phương pháp GPC trong hệ dung môi DMAc/LiCl. Trong đó phương pháp đơn giản nhất để xác định khối lượng phân tử polyme là xác định theo phương pháp gián tiếp qua phép đo độ nhớt. Phép đo độ nhớt không phải là phương pháp tuyệt đối để xác định khối lượng phân tử mà chỉ là phương pháp tương đối dựa trên cơ sở độ nhớt của dung dịch polyme tăng tỉ lệ với số lượng các phân tử thêm vào. Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật Vant-Hoff. Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thẩm thấu P, thể tích V và nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của dạng khí lí tưởng: PV = nRT = (g/M)RT → P = (g/V)(RT)/M →M = (RTC)/P Trong đó: g: khối lượng của chất hòa tan (g) M: khối lượng phân tử của chất (g/mol) C: nồng độ của dung dịch R: hằng số T: nhiệt độ tuyệt đối 1.4. Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,14,18] Độ axetyl hóa là hàm lượng nhóm (-NHCOCH3) còn độ đeaxetyl hóa là hàm lượng nhóm (-NH2) trong chitin và chitosan. Mắt xích cơ sở của chitin là Lê Thị Linh Trang 6 Lớp: K38A - SP Hóa học N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc). Mặc dù hầu hết các nhóm amino gắn với C2 đã bị axetyl hóa, nhưng trong tự nhiên chitin vẫn tồn tại một số nhóm amino tự do. Hơn nữa, phản ứng đeaxetyl hóa chitin còn xảy ra trong quá trình tách loại protein bằng kiềm. Vì vậy, các mẫu chitin trên thực tế có DDA khác nhau (khoảng 5 - 15%) phụ thuộc vào nguồn gốc và cách điều chế chúng. Để thu được chitin có cấu trúc thuần nhất (chỉ gồm các mắt xích GlcNAc) thì phải tiến hành N-axetyl hóa chọn lọc các nhóm amino tự do. Khi chitin bị đeaxetyl hóa đáng kể thì trở nên tan trong dung dịch axit axetic loãng và được gọi là chitosan. OH OH O O O OH NH2 OH O NHCOCH3 DDA DA Trong đó, DDA = 100-DA. Đối với chitin thì DA > DDA, đối với chitosan thì DA < DDA. Khi DA = DDA thì có chitin tan trong nước. Tính chất của chitin cũng như chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ đeaxetyl hóa (DDA) - một thông số quan trọng nhất để chỉ ra là chitin hay chitosan. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp xác định DDA (hay DA) một cách chính xác và đơn giản là vấn đề rất quan trọng và cần thiết. Có rất nhiều phương pháp đã được áp dụng để xác định DDA của chitin/chitosan như: phân tích nguyên tố, các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NRM): 1H-NRM, 15 13 C-NRM, và N-NRM ở trạng thái rắn, cho phép đo lưỡng sắc cầu, phổ khối, chuẩn độ điện thế, chuẩn độ nitrat (phương pháp chuẩn độ sử dụng bạc nitrat), chuẩn độ với axit picric, chuẩn độ độ dẫn, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí - lỏng, sắc ký thẩm thấu gel, nhiệt phân - sắc ký khí, sắc ký khí. Trong các phương pháp xác định DA đã được áp dụng thì phổ IR là phương pháp thuận tiện đặc biệt trong trường hợp mẫu ở trạng thái rắn, không Lê Thị Linh Trang 7 Lớp: K38A - SP Hóa học hòa tan trong các dung môi. Đối với chitosan (tan trong môi trường axit loãng) thì phổ 1H-NRM là phương pháp nhanh, chính xác và có độ nhạy cao. Đo trong dung môi D2O, CD3COOD/D2O hoặc DCl/D2O. 2. Phƣơng pháp điều chế chitin/chitosan [8,20] Chitin có ở nhiều loài khác nhau, từ các loài nấm đến các động vật bậc thấp. Vỏ của các loài động vật chân đốt là nguồn nguyên liệu chính để điều chế chitin, trong thành phần của vỏ các loài động vật này có chứa 20 - 50% chitin tính theo khối lượng khô. Vỏ tôm, mai cua là nguồn nguyên liệu phế thải từ công nghiệp chế biến thủy sản, hải sản được sử dụng để sản xuất chitin thương mại. Các nguồn nguyên liệu khác để sản xuất chitin là: mai mực, sâu bọ, tảo, nấm… Thành tế bào một số loại nấm chứa cả chitin cũng như chitosan và được coi là nguồn chitosan tự nhiên. Chitosan được điều chế bằng cách thực hiện phản ứng deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm. 2.1. Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,19,20] Nguyên tắc chung để điều chế chitin là loại bỏ muối khoáng (chủ yếu là canxicacbonat), protein và các chất màu khỏi phế liệu thủy, hải sản. Hai phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chitin/chitosan là phương pháp hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật. Theo phương pháp hóa học: Quá trình điều chế chitin được thực hiện theo các bước: tách khoáng - tách protein - khử màu. Muối khoáng thường được tách ra bằng cách xử lý nguyên liệu với dung dịch axit HCl, protein bị thủy phân trong môi trường kiềm, chất màu được loại bỏ bằng dung môi hoặc tác nhân oxi hóa. Trong quá trình xử lý, một số nhóm axetamit trong các mạch đại phân tử chitin bị thay thế bởi nhóm amino do phản ứng deaxetyl hóa. Điều chế chitin theo phương pháp hóa học có một số mặt hạn chế như phải sử dụng một lượng lớn kiềm, axit, nước rửa do đó chi phí lớn và gây ô nhiễm môi trường. Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt giảm mạch chitin tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau. Lê Thị Linh Trang 8 Lớp: K38A - SP Hóa học Theo phương pháp xử lý vi sinh vật: Protein được tách khỏi vỏ các loài giáp xác bằng cách xử lý với enzim hay vi sinh vật theo nguyên tắc: vi khuẩn sinh ra lactic (LAB: lactic acid bacterial) tự có trong phủ tạng của vỏ phế thải (vỏ tôm, cua, mai mực…) với một lượng rất nhỏ cùng với nguồn LAB thuần chủng được bổ sung có tác dụng bảo quản và thủy phân phế thải. Hỗn hợp lên men bao gồm: vỏ phế thải, LAB, dung dịch glucozo. Trong quá trình lên men, LAB sản sinh ra axit lactic làm giảm pH của môi trường, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân protein, thủy phân khoáng tạo thành các lactat canxi, magie…là các muối tan được trong nước. Bằng phương pháp ly tâm, phần dung dịch lỏng chứa protein và các muối khoáng hòa tan được loại bỏ thu được phần chitin không hòa tan. Để có chitin sạch, có thể xử lý tiếp bằng dung dịch axit và kiềm loãng. Phương pháp điều chế chitin bằng phương pháp lên men vi sinh vật có một số ưu điểm như chi phí thấp, cấu trúc sản phẩm không bị thay đổi nhiều và đặc biệt là ít gây ô nhiễm môi trường. β-chitin được sản xuất chủ yếu từ mai mực ống theo cách đơn giản hơn vì thành phần của mai mực ống chủ yếu là chitin, hàm lượng protein và muối khoáng thường rất thấp. Hơn nữa, do sự sắp xếp các mạch đại phân tử trong β-chitin khác hẳn với α-chitin nên α-chitin có các liên kết hidro chặt chẽ hơn, vì vậy khi xử lý mai mực ống với axit và kiềm thường ở điều kiện êm dịu hơn nhiều so với xử lý vỏ tôm để thu được β-chitin 2.2. Điều chế chitosan [1, 2, 4, 20] Chitosan là sản phẩm deaxetyl hóa của chitin. Chitosan thương mại có nhiều loại với độ deaxetyl hóa khác nhau nhưng thường được điều chế bằng cách deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm nồng độ 40 - 50% ở 100 130oC trong 24 giờ. Phản ứng deaxetyl hóa xảy ra như sau: Lê Thị Linh Trang 9 Lớp: K38A - SP Hóa học OH OH O dd NaOH, to O OH NHCOCH3 OH O OH O O OH NH2 n O NHCOCH3 x y Sơ đồ 1.2: Điều chế chitosan Chitosan thu được theo phương pháp này có DDA lên tới 90%. Để thu được chitosan có độ deaxetyl hóa cao hơn phải tiến hành phản ứng lặp đi lặp lại nhiều lần. Phản ứng deaxetyl hóa β-chitin diễn ra dễ dàng hơn nhiều so với α-chitin: Từ các mẫu α-chitin, β-chitin có DDA tương đương nhau tiến hành phản ứng deaxetyl hóa trong NaOH 30% ở 100oC với thời gian như nhau (2 giờ) thu được β-chitosan với DDA ≈ 70% trong khi đó đối với α-chitin giá trị đó là ≈20%. Tuy nhiên khi sử dụng dung dịch kiềm đặc thì bên cạnh phản ứng deaxetyl hóa còn xảy ra phản ứng thủy phân mạch chitin/chitosan làm giảm đáng kể khối lượng phân tử của chitin/chitosan. Ta có thể mô tả quá trình điều chế chitosan từ vỏ mai mực ống qua sơ đồ 1.3: Vỏ phế thải thủy hải sản ↓ Xay nghiền ↓ Khử khoáng bằng axit loãng (axit HCl) ↓ Tách loại protein bằng kiềm loãng (NaOH loãng) ↓ Chitin ↓ Deaxetyl hóa (bằng NaOH 50%, trong vòng 2h ở 100oC) ↓ Chitosan Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống Lê Thị Linh Trang 10 Lớp: K38A - SP Hóa học 3. Tính chất hóa học [1,2,5] Công thức tổng quát của chitin là: (C8H13NO5)n OH OH O O O OH NHAc O OH NH2 n m Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan Ta thấy trong mỗi mắt xích của chitin/chitosan vừa có nhóm chức (OH) vừa có nhóm chức amin (-NHCOCH3/NH2) nên có ba trung tâm phản ứng chính, vì vậy nó vừa có tính chất của ancol lại vừa có tính chất của amin. 3.1 Phản ứng ở nhóm -OH Phản ứng với axit, anhidric axetic hay HCl thu được sản phẩm ở dạng este. [Chit(OH)2]n + 2nHCl → [Chit(OCl)2]n + 2nH2O Phản ứng với ankyl sunfat trong ankyl halogenua thu được các este. Phản ứng với các hợp chất vinyl tạo este Trong mỗi mắt xích của chitin có 2 nhóm (-OH) ở C3 và C6, đều có khả năng tham gia phản ứng. Do cấu trúc phân tử, nhóm (-OH) bậc 2 ở C3 bị án ngữ không gian nên phản ứng kém hơn nhóm (-OH) bậc 1 ở C6. 3.2. Phản ứng ở nhóm axetamit Chitin có khả năng tham gia phản ứng thể hiện tính chất của amin bậc 2 như phản ứng đeaxetyl hóa tạo thành chitosan. OH OH O dd NaOH, to O OH NHCOCH3 O OH O NH2 n Chitin m Chitosan M = (203)n M = (161)m Sơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin Lê Thị Linh Trang 11 Lớp: K38A - SP Hóa học