Tài liệu Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo (solanum hainanense hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐOÀN NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY CALLUS CÀ GAI LEO (SOLANUM HAINANENSE HANCE) VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH ỨNG ĐẾN SỰ TÍCH LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG CALLUS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đoàn Ngọc Hân ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, cán bộ kĩ thuật, bạn bè và người thân. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô, cán bộ nhân viên Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương - cán bộ của Viện Sinh học Nông nghiệp, người đã luôn sát cánh bên tôi, nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập trên Viện. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh – Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp tận tình hướng dẫn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đoàn Ngọc Hân iii MỤC LỤC Lời cam đoan .................................................................................................................... ii Lời cảm ơn ....................................................................................................................... iii Mục lục ........................................................................................................................... iv Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vii Danh mục bảng .............................................................................................................. viii Danh mục hình .................................................................................................................. x Trích yếu luận văn .......................................................................................................... xii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................ 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3 2.1. Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................... 3 2.1.1. Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật .............................................................. 3 2.1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất các hợp chất thứ cấp ......................................................................................................... 3 2.1.3. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp................... 4 2.1.4. Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................................................................................................... 6 2.2. Ứng dụng chất kích ứng để cải thiện tích lũy hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật .............................................................................................. 8 2.2.1. Giới thiệu về chất kích ứng................................................................................. 8 2.2.2. Cơ chế tác động .................................................................................................. 8 2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng trong nuôi cấy tế bào thực vật..... 10 2.3. Cây cà gai leo ................................................................................................... 11 2.3.1. Giới thiệu chung về cây cà gai leo.................................................................... 11 2.3.2. Một số nghiên cứu khác trên cà gai leo ............................................................ 13 2.4. Đánh giá sự tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học của chiết xuất dược liệu .................................................................................... 14 iv 2.4.1. Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột ........................................................................................ 14 2.4.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất dược liệu trên chuột bị nhiễm độc CCl4 in vivo ..................................................................................... 15 2.4.3. Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các chiết xuất cây dược liệu ....... 15 Phần 3. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu ....................................... 17 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................... 17 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 17 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 17 3.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 17 3.2.1. Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo ................. 17 3.2.2. Nhân sinh khối callus ....................................................................................... 18 3.2.3. Đánh giá sự tích lũy các hoạt chất thứ cấp thông qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên .................... 20 3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 22 3.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro.......................................................................... 22 3.3.2. Nuôi cấy cây in vitro ........................................................................................ 22 3.3.3. Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus ............................................................. 23 3.3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus ................................................... 23 3.3.5. Xử lý số liệu...................................................................................................... 24 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 25 4.1. Kết quả .............................................................................................................. 25 4.1.1. Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo ................. 25 4.1.2. Nhân sinh khối callus ....................................................................................... 33 4.1.3. Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên ......................................... 45 4.2. Thảo luận .......................................................................................................... 49 4.2.1. Cảm ứng tạo callus ........................................................................................... 49 4.2.2. Nhân sinh khối callus ....................................................................................... 50 4.2.3. Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus ......................................................................................... 52 v Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 54 5.1. Kết luận............................................................................................................. 54 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 54 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 55 Phụ lục .......................................................................................................................... 59 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt αNAA α- naphtyl axetic acid BA Benzyl adenine CT Công thức DAM Dialdehyt malonyl ĐC Đối chứng HCTC Hợp chất thứ cấp HTCO Hoạt tính chống oxy hóa LED Light emitting diode LSD5% Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MS Murashige and Skoog NADCC Sodium dichloroisocyanurate POL Quá trình peroxyd hóa lipit TB Trung bình TN Thí nghiệm YE Yeast extract 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyscetic acid vii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo .............................................................................................. 25 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo ........................................................................................ 26 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo .............................................................................................. 28 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo .................................................................................................. 29 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo .............................................................................................. 30 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo .................................................................................................. 31 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà gai leo .......................................................................................................... 33 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ mảnh lá cà gai leo .......................................................................................................... 34 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà gai leo .............................................................................................. 35 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ mảnh lá cà gai leo ........................................................................................ 36 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối callus từ đoạn thân ....................................................................................... 37 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối callus từ mảnh lá.......................................................................................... 38 Bảng 4.13. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối........................ 40 Bảng 4.14. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus trên môi trường A2 .............................................................................................. 41 Bảng 4.15. Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên môi trường A1 ............................................................................ 42 Bảng 4.16. Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên môi trường A2 ........................................................................... 43 viii Bảng 4.17. Tổng hợp kết quả các yếu tố ảnh hưởng đến nhân sinh khối callus .......... 45 Bảng 4.18. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cà gai leo ...................................... 46 Bảng 4.19. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi trường A2 ..................................................................................................... 46 Bảng 4.20. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi trường A2 + 3 g/l nấm men .......................................................................... 47 Bảng 4.21. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi trường A2 + 100µM acid salisylic ............................................................... 48 Bảng 4.22. So sánh hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên ............................................................................................ 49 ix DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo................................................................................... 26 Hình 4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo...................................................................................... 27 Hình 4.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo ........................................................................................... 28 Hình 4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo ............................................................................................... 29 Hình 4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn thân cà gai leo ........................................................................................... 31 Hình 4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh lá cà gai leo...................................................................................... 32 Hình 4.7. Ảnh hưởng của môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà gai leo .............................................................................. 33 Hình 4.8. Ảnh hưởng của môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) đến nhân sinh khối callus từ mảnh lá cà gai leo ................................................................................. 34 Hình 4.9. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus có nguồn gốc đoạn thân cà gai leo ................................................................. 35 Hình 4.10. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus có nguồn gốc mảnh lá cà gai leo .................................................................... 36 Hình 4.11. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối callus từ đoạn thân .................................................................................... 38 Hình 4.12. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối callus có nguồn gốc mảnh lá ..................................................................... 39 Hình 4.13. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus trên môi trường A1 .................................................................................... 40 Hình 4.14. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus trên môi trường A2 .................................................................................... 41 x Hình 4.15. Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên môi trường A1 ........................................................................................... 43 Hình 4.16. Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên môi trường A2 ........................................................................................... 44 xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đoàn Ngọc Hân Tên luận văn: "Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus" Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tìm được môi trường nuôi cấy thích hợp và nhân nhanh sinh khối callus cà gai leo. Đánh giá được sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết callus cà gai leo. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm cảm ứng tạo callus cà gai leo được thực hiện trên đối tượng là đoạn thân và mảnh lá cà gai leo in vitro. Môi trường nuôi cấy sử dụng là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng . Các tổ hợp BA + α-NAA và BA + 2,4-D được sử dụng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus. Callus có nguồn gốc đoạn thân và mảnh lá sau 4 tuần tuổi được sử dụng cho các thí nghiệm nhân sinh khối callus, các nhân tố: môi trường nuôi cấy, chế độ chiếu sáng, các elicitor được đánh giá ảnh hưởng đến khả năng nhân sinh khối callus. Callus được nhân sinh khối trên các môi trường cho khả năng nhân callus tốt nhất sau 3 tuần tuổi được sấy khô đến khối lượng không đổi, sau đó chiết bằng dung môi cồn 700 và được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cùng với dịch chiết của cây cà gai leo trồng tự nhiên thông qua quá trình peoxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987). Kết quả chính và kết luận 1. Môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) là thích hợp để cảm ứng tạo callus. 2. Khi chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, môi trường nuôi cấy A2 ưu thế hơn khi nhân sinh khối callus mô thân và mô lá so với môi trường A1. 3. Chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối thích hợp để nhân nhanh callus hơn chế độ không chiếu sáng. Dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED, tỉ lệ B/R: 30/70 thích hợp nhất với nhân callus nguồn gốc từ mảnh lá trên môi trường A2. Đối với callus nguồn gốc từ đoạn thân tỉ lệ B/R : 40/60 thích hợp hơn để nhân callus trên môi trường A1. 4. Môi trường A1 và A2 bổ sung 100 µM acid salisylic; môi trường A1 và A2 bổ sung 3 g/l nấm men kích thích sự tăng trưởng khối lượng khô TB callus từ 1,81đến 3,35 xii lần so với đối chứng không bổ sung elicitor. 5. Nồng độ 20 mg/100 ml dịch chiết callus có hiệu quả chống oxy hóa cao nhất so với các nồng độ thử nghiệm khác. Ở nồng độ này HTCO của dịch chiết callus cao gấp 1,83 lần so với dịch chiết của cây trồng tự nhiên. 6.Bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus từ 1,26-1,49 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor; tăng từ 2,312,73 lần so với dịch chiết cây tự nhiên. xiii THESIS ABSTRACT Master candidate: Doan Ngoc Han Thesis title: “Study on callus culture on Solanum hainanense Hance and effect of some elicitors on generating secondary compounds in callus” Major: Biotechnology Code: 60 42 02 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives To find a suitable culture medium, to multiply callus of Solanum hainanense Hance and to analysis the generation of sencondary compounds by testing biological activation of extracted callus from Solanum hainanense Hance. Materials and Methods Callus induction experiments are carried out on in vitro cells extracted from leaf part and body part of Solanum hainanense Hance. The culture medium used in the research is MS medium (Murashige and Skoog, 1962) which is provided growth accomodating elements. The BA + α-NAA and BA + 2,4-D combinations are used to analysis the callus induction. 4-week old callus cells from body and leaf part are used for experiments. Culture medium, light regimen and elicitors affect the ability to multiply living mass of callus. The best results are obtained after 3 weeks, which after that is dried to fixed weight then extract with 70% alcohol liquid. They later are analysised the antioxidant quality, which is compared to normal Solanum hainanense Hance extracts by the Blagodorov method (1987). Main findings and conclusions 1. A1 medium (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) and A2 medium (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) are suitable for the callus induction process. 2. When being lightened by fluorescent light, the A2 medium is more predominant in multiplying living mass of leaf tissues and body tissues than the A1 medium. 3. In the 16-hour bright, 8-hour dark light regimen, the callus stem happens faster than in normal condition. When being lightened by LED light, the 30/70 B/R ratio is the best rate for multiplying callus from leaf part while 40/60 ratio is more suitable for multiplying callus from body part. 4. Providing 100 µM acid salisylic into A1and A2 medium and 3 g/L yeast extract into A1 and A2 medium help stimulate the dry weight of callus to increase from 1,81 to 3,35 times in comparision to not providing elicitors. xiv 5. 20mg/100ml is the best callus extract concentration to be antioxidant. At this concentration, the HTCO of callus extracts is 1,83 time higher than natural ones. 6. Providing elicitors into culture medium help increase the antioxidant quality of callus extracts from 1,26 to 1,49 time compared to not providing elicitors and from 2.31 to 2.73 time compared to natural ones. xv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cà gai leo còn có tên khác là cà gai dây, cà vạnh, cà quýnh, cà lù, gai cườm,... tên khoa học là Solanum hainanense Hance. Cà gai leo phân bố ở các tỉnh miền Bắc cho đến Huế tại Việt Nam và một số nước như Lào, Campuchia, Trung Quốc (Viện Dược liệu, 1993). Cà gai leo được đánh giá cao về tác dụng giải độc gan. Theo kinh nghiệm từ dân gian, cây cà gai leo có tác dụng hiệu quả đối với người bệnh mắc các bệnh lý về gan như: vàng da, vàng mắt, mụn nhọt, mẩn ngứa... Trong cây cà gai leo có chứa các chất alkaloid, glycoalkaloid có tác dụng ức chế sự sao chép và làm âm tính virus viêm gan B, chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan hiệu quả (Nguyễn Bích Thu và cs., 2000). Cà gai leo là cây thuốc quý có tiềm năng lớn cho việc sản xuất dược phẩm chữa bệnh. Tuy nhiên, hiện nay cà gai leo chủ yếu được khai thác từ nguồn tự nhiên có chất lượng không đồng đều. Cà gai leo có thể được nhân giống bằng hạt nhưng hệ số nhân giống không cao do cây ít quả, quả nhỏ và ít hạt. Hơn nữa, cây nhân giống bằng hạt có chất lượng không đồng đều, gây khó khăn cho việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật với những ưu điểm vượt trội và ứng dụng để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, hàm lượng hợp chất thứ cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo nguồn vật liệu ổn định và tập trung, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên (Misawa, 1994). Chất kích ứng là một chất mà khi đưa với nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào đó (Namdeo, 2007). Chất kích ứng thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung chất kích ứng vào môi trường nuôi cấy là phương thức để thu được các sản phẩm HCTC có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các chất kích ứng sinh học và phi sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong nuôi cấy tế bào vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao (Discosmo et al., 1995). Hiện nay đã có một số nghiên cứu về sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus cà gai leo. Các nghiên cứu đều thu được kết quả là hàm lượng glycoalkaloid toàn phần trong callus và tế bào đều cao hơn so với cây tự nhiên, 1 tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao. Sử dụng các chất kích ứng thực vật có thể cải thiện được vấn đề này. Ngoài ra chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp tích lũy trong callus cà gai leo. Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tìm được môi trường nuôi cấy thích hợp và nhân nhanh sinh khối callus cà gai leo. Đánh giá được sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết callus cà gai leo. 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài nghiên cứu đã làm rõ được ảnh hưởng của các nhân tố : loại mô nuôi cấy, chất điều tiết sinh trưởng, chế độ chiếu sáng... đến sự cảm ứng tạo callus và nhân nhanh sinh khối callus cà gai leo. Đặc biệt, đã xác định được tác động của một số chất kích ứng đến sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của callus cà gai leo qua đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus. Các kết quả đạt được sẽ bổ sung thêm nguồn tài liệu khoa học phục vụ công tác nghiên cứu, giảng dạy về sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào thực vật, một lĩnh vực còn chưa được phổ biến ở nước ta. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Đưa ra được giải pháp tạo nguồn dược liệu chủ động, dồi dào, có chất lượng đồng đều, góp phần khắc phục những hạn chế về nguồn dược liệu cà gai leo khai thác trong tự nhiên. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 2.1.1. Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật Ở thực vật, quá trình trao đổi chất tạo ra nhiều loại hợp chất hữu cơ hoặc các chất chuyển hóa, được xếp thành nhóm các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp. Các hợp chất sơ cấp được tìm thấy trong hầu hết các loài trong khi đó các hợp chất thứ cấp tìm thấy chỉ trong một số loài thực vật (Taiz and Zeiger, 2006). Những bằng chứng từ thực nghiệm và thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; kháng nấm, vi khuẩn, virus; chống lại sự cạnh tranh về ánh sáng, nước và chất dinh dưỡng; thu hút các loài động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán hạt; tạo ra các tín hiệu trong giao tiếp giữa thực vật với các loài vi sinh vật cộng sinh; chống lại tia tử ngoại và các tác nhân vật lý bất lợi khác (Wink, 1999). Thực vật sản xuất hơn 80.000 hợp chất khác nhau thông qua con đường trao đổi thứ cấp. Các sản phẩm thứ cấp được dự trữ chủ yếu trong các cấu trúc đặc biệt hoặc các cơ quan dự trữ như rễ, các tế bào dự trữ, không bào, hệ thống màng…(Arnason et al., 1995). Ngày nay các hợp chất thứ cấp ở thực vật được dùng trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu; chúng đã đóng góp giá trị lớn trong sản xuất công nghiệp (Gautam et al., 1998). 2.1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất các hợp chất thứ cấp Nuôi cấy tế bào thực vật đã được ứng dụng thành công để sản xuất lượng lớn HCTC dưới các điều kiện cụ thể (Neumen et al., 2009). So với phương pháp truyền thống sản xuất HCTC bằng nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều ưu việt và thuận lợi hơn như rút ngắn thời gian, giảm chi phí nhân công, giả quyết vấn đề mặt bằng và nhất là có thể thu được một lượng lớn sản phẩm như mong muốn. Ngày nay, phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trên quy mô lớn và ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm để tăng hàm lượng các HCTC tích lũy trong tế bào thực vật được nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó được chiết từ cây ngoài tự nhiên (Mulabagal and Tsay, 2004). 3 Ưu điểm của sản xuất HCTC bằng nuôi cây mô, tế bào in vitro là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở: - Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng. - Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên. - Chọn được cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn. - Với việc tự động hóa, điều khiển sinh trưởng và điều hòa quá trình chuyển hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. - Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm. - Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch nuôi cấy huyền phù có chất lượng cao hơn chiết rút từ cây tự nhiên (Mulabagal and Tsay, 2004). 2.1.3. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp 2.1.3.1. Nuôi cấy callus Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa, được gọi là callus. Các mẫu mô được tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar hình thành nên callus. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất điều hòa sinh trưởng là các chỉ tiêu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của callus. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng (Loyola-Vargas and Vázquez-Flota, 2006). Do trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng soma trong quá trình cấy chuyển nên các dòng tế bào ổn định di truyền được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp. Thông thường, trên cùng một loại môi trường nuôi cấy, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại trong quá trình cấy chuyển (Davey and Anthony, 2010). Bouque et al. (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định. 4 2.1.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào Để nuôi cấy huyền phù tế bào, các khối callus được chuyển vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể phân tán cao nhất thành dịch huyền phù tế bào. So với nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào, có thể dễ dàng chiết tách các chất chuyển hóa thứ cấp (Davey and Anthony, 2010). Trong quá trình nuôi cấy, nhờ những chuyển động xoáy của môi trường, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Dịch huyền phù tốt là dịch huyền phù chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Có thể cải thiện khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy (Misawa, 1994). Sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các tế bào trở nên kết dính với nhau. Để thu được dịch huyền phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng kết khối ban đầu (Misawa, 1994). Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong môi trường lỏng có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Nhìn chung, có ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục. Trong quá trình nuôi cấy, bình nuôi cấy không chỉ thường xuyên có sự tăng lên của các sản phẩm trao đổi chất mà còn luôn luôn diễn ra sự trao đổi không khí với bên ngoài. Nhìn chung, môi trường thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi cao hơn (Davey and Anthony, 2010). Khi các chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị ức chế. Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). 5