Tài liệu Nghiên cứu nhân giống và khảo nghiệm một số dòng keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------------- PHẠM VĂN HẢI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÀ KHẢO NGHIỆM MỘT SỐ DÒNG KEO LAI BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIÊU GIẤY Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60 62 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Dương Văn Thảo Thái Nguyên - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số liệu trong công trình này là hoàn toàn trung thực, chính xác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những kết quả này. Tác giả Phạm Văn Hải ii LỜI CẢM ƠN Để có được kết quả này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành đến thầy giáo - TS Dương Văn Thảo đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn các cán bộ, kỹ thuật viên phòng nghiên cứu và thực nghiệm sản xuất giống cây lâm nghiệp – Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo khoa Lâm nghiệp và khoa Sau đại học trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của gia đình và các bạn bè đồng nghiệp. Mặc dù có nhiều cố gắng, song không tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các quý thầy cô và các bạn. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014 Tác giả Phạm Văn Hải iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................... 1 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ............................................................... 2 2.1. Mục tiêu của đề tài ............................................................................. 2 2.2. Yêu cầu của đề tài ............................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................... 3 3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................ 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................ 3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài .......................................... 3 4.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 3 4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài ............................................................ 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 5 1.1.Những nét chung về các dòng keo lai .................................................. 5 1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .............................. 6 Chương 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 18 2.1. Nội dung nghiên cứu ........................................................................ 18 2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ nẩy chồi , hệ số nhân chồi và tỷ lệ nẩy chồi hữu hiệu của mẫu thí nghiệm. ............................................................................. 18 2.1.2. Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu. 18 2.1.3 Bước đầu đánh giá tình hình sinh trưởng của 3 dòng keo lai KL2, KLTA3 và KL20 nghiên cứu. ............................................................... 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu: .................................................................. 18 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................... 18 iv 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ nẩy chồi , hệ số nhân chồi và tỷ lệ nẩy chồi hữu hiệu của mẫu thí nghiệm ............................................................... 19 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu ......................................................................... 21 2.2.4. Bước đầu đánh giá tình hình sinh trưởng của 3 dòng keo lai KL2, KLTA3 và KL20 nghiên cứu. ............................................................... 24 Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................... 30 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ nẩy chồi , hệ số nhân chồi và tỷ lệ nẩy chồi hữu hiệu của mẫu thí nghiệm ........................................................................................ 30 3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng keo lai KL2. ........................................................... 30 3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL20. ..................................................................... 33 3.1.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KLTA3 ................................................................... 36 3.2. Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu .................................................................................................... 39 3.2.1.Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu đối với dòng KL2 ....................................................... 39 3.2.2. Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu đối với dòng keo lai KL20 .......................................... 41 3.2.3. Kết quả nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu đối với dòng keo lai KLTA3 ....................................... 42 v 3.2.4. So sánh về hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu giữa các dòng nghiên cứu ............................................................................................ 46 3.3. Bước đầu đánh giá tình hình sinh trưởng của 3 dòng keo lai KL2, KLTA3 và KL20 nghiên cứu. .................................................................. 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................... 53 1. Kết luận................................................................................................ 54 2. Kiến nghị ............................................................................................. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 55 vi DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ĐC : Đối chứng. ĐDSH : Đa dạng sinh học. GPA : Global Plant of Action. MS : Murashige & Skoog. SH : Schenk & Hildebrandt. TNDTTV : Tài nguyên di truyền thực vật. WPM : McCOWN’s Woody Plant. vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu cấy....................................................... 20 Bảng 2.2. Thành phần các môi trường cơ bản đề tài đã thử nghiệm.............. 21 Bảng 2.3. Công thức thí nghiệm xác định môi trường tái sinh chồi. ............. 22 Bảng 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng keo lai KL2. .........................................31 Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KL20.................................................... 34 Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đối với dòng KLTA3 ................................................ 37 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng KL2 ......................................................................................... 40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng keo lai KL20 ............................................................................ 41 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hiệu quả nhân chồi dòng keo lai KLTA3.........................................................................43 Bảng 3.7: Sơ đồ trồng thí nghiệm.................................................................47 Bảng 3.8: Tỷ lệ sống và chất lượng 3 dòng keo lai KL2, KLTA3 và KL20 nghiên cứu và 11 dòng keo lai đối chứng thời điểm 6 tháng tuổi.......................................................................................... 49 Bảng 3.9. Tình hình sinh trưởng 3 dòng keo lai KL2, KLTA3 và KL20 nghiên cứu và 11 dòng keo lai đối chứng thời điểm 6 tháng tuổi.......................................................................................... 50 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Hỉnh ảnh khử trùng mẫu dòng keo lai KL2................................... 33 Hình 3.2: Hình ảnh khử trùng mẫu dòng keo lai KL20................................. 36 Hình 3.3: Hình ảnh khử trùng mẫu dòng keo lai KLTA3.............................. 39 Hình 3.4: Một số hình ảnh kết quả thử nghiệm môi trường cơ bản .............. 46 Hình 3.5: Hình ảnh vườn thí nghiệm các dòng keo lai 4 tháng tuổi ............. 51 Hình 3.6: Hình ảnh vườn thí nghiệm các dòng keo lai 6 tháng tuổi .............. 51 1 MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài: Hiện nay, gỗ là nguồn nguyên liệu chính phục vụ cho sản xuất của Tổng công ty giấy Việt Nam. Nhu cầu nguyên liệu hàng năm của Tổng công ty là khoảng 500.000m3, trong khi đó các công ty lâm nghiệp mới chỉ cung cấp được khoảng 60% nhu cầu trên. Thêm vào đó diện tích đất trồng các loài cây nguyên liệu giấy ngày càng bị thu hẹp do nhu cầu trồng các loài cây công nghiệp và nông nghiệp khác. Vì vậy việc nghiên cứu nâng cao năng suất và chất lượng rừng ngày càng cấp thiết. Trong khi đó nhiều diện tích rừng trồng trong Tổng công ty giấy còn thấp và không đạt yêu cầu, một trong những nguyên nhân chính là giống đưa vào trồng rừng sản xuất có chất lượng không cao. Do đó việc tăng năng suất rừng trồng bằng sử dụng nguồn giống có chất lượng là việc làm cần thiết. Phú Thọ là tỉnh miền núi, trung du, tổng diện tích tự nhiên của Phú Thọ là 3.519,56 km2, đất đai của Phú Thọ được chia theo các nhóm sau: đất feralít đỏ vàng phát triển trên phiến thạch sét, diện tích 116.266,27 ha chiếm tới 66,79% (diện tích điều tra). Đất thường có độ cao trên 100 m, độ dốc lớn, tầng đất khá dày, thành phần cơ giới nặng, mùn khá. Loại đất này thường sử dụng trồng rừng, một số nơi độ dốc dưới 25o có thể sử dụng trồng cây công nghiệp. Hiện nay, Phú Thọ mới sử dụng được khoảng 54,8% tiềm năng đất nông – lâm nghiệp; đất chưa sử dụng còn 81,2 nghìn ha, trong đó đồi núi có 57,86 nghìn ha. Diện tích rừng hiện nay của Phú Thọ có độ che phủ rừng lớn (42% diện tích tự nhiên). Với diện tích rừng hiện có 144.256 ha, trong đó có 69.547 ha rừng tự nhiên, 74.704 ha rừng trồng, cung cấp hàng vạn tấn gỗ cho công nghiệp chế biến hàng năm. Các loại cây chủ yếu như bạch đàn, mỡ, keo, bồ đề và một số loài cây bản địa đang trong phát triển (đáng chú ý nhất vẫn là những cây phục vụ cho ngành công nghiệp sản xuất giấy).Tỉnh phú Thọ là 2 tỉnh có tiềm năng phát triển ngành công nghiệp sản xuất giấy. Đóng trên địa bàn tỉnh gồm có Tổng Công ty giấy Việt nam , 5 công ty lâm nghiệp, 2 nhà máy giấy và bột giấy, 1 Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy. Trong những năm gần đây, bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã công nhận ba giống keo lai KL2, KL20 và KLTA3 do tập thể cán bộ Trung tâm nghiên cứu cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy chọn tạo là giống tiến bộ kỹ thuật. Đây là những giống rất thích hợp cho trồng rừng vùng Trung tâm Bắc Bộ và các vùng có điều kiện sinh thái tương tự. Thực tế cho thấy rừng trồng các dòng keo lai nêu trên tại vùng Trung tâm Bắc Bộ cho năng suất cao, chất lượng rừng đồng đều và ổn định hơn tương đối nhiều so với các loài khác. Khi đã có giống năng suất cao thì việc nhân nhanh và đưa các giống đã được chọn lọc và trồng rừng sản xuất là vô cùng quan trọng. Trong các kỹ thuật nhân giống hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cho hiệu qua cao nhất, đặc biệt là chất lượng di truyền của cây giống được đảm bảo và khả năng cung cấp số lượng lớn cây giống ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, ba giống keo lai nêu trên chưa được tiến hành nghiên cứu bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để góp phần nâng cao năng suất và duy trì tính ổn định của rừng trồng thì việc làm chủ công nghệ nuôi cấy mô ba dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 là cần thiết. Do vậy thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống và khảo nghiệm một số dòng keo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy” là cần thiết. 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2.1. Mục tiêu của đề tài Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô invitro để nhân nhanh và tạo thành công cây mầm mô 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen cây nguyên liệu giấy. 3 * Mục tiêu cụ thể: - Xác định môi trường dinh dưỡng và điều kiện vật lý thích hợp cho nhân giống in vitro 3 dòng keo lai nói trên. - Tạo cây mầm mô keo lai 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 chất lượng cao phục vụ trồng mô hình. - Bước đầu đánh giá tình hình sinh trưởng 3 dòng keo lai nghiên cứu. 2.2. Yêu cầu của đề tài - Xác định được kỹ thuật , điều kiện khử trùng mẫu thích hợp đối với giai đoạn tạo chồi nuôi cấy mô invitro cho 3 dòng keo lại KL2, KL20 và KLTA3 nhằm đạt tỷ lệ mẫu nảy chồi từ 5-7%. - Xác định được môi trường tái sinh chồi và tạo nguồn vật liệu ban đầu. - Trồng khảo nghiệm trên thực địa 3 dòng keo lai nghiên cứu 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả đề tài cung cấp thêm thông tin cho các nhà khoa học trong các lĩnh vực nghiên cứu về cây nguyên liệu giấy: chọn vật liệu trong lai tạo giống; chọn lọc giống mới, là cơ sở để lưu giữ an toàn các nguồn gen hiện có - Kết quả về đánh giá nguồn gen cây nguyên liệu giấy là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng phương hướng trong bảo tồn và khai thác sử dụng quỹ gen cây nguyên liệu giấy hiệu quả. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả nghiên cứu, đánh giá có cơ sở khoa học để cải thiện phương pháp lưu giữ bảo tồn và giới thiệu các nguồn gen cây nguyên liệu giấy có đặc tính tốt như là nguồn vật liệu di truyền mới phục vụ cho công tác chọn tạo giống 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu Cây nguyên liệu giấy bao gồm nhiều loài cây như bồ đề, mỡ, các loài tre luồng, thông, hông, các loài keo và bạch đàn. Tuy nhiên, trong những năm 4 gần đây các loài cây keo (keo tai tượng - Acacia mangium, keo lai - Acacia hybrid) và bạch đàn (Eucalyptus urophylla) đã cho thấy ưu thế hơn hẳn về cung cấp nguồn nguyên liệu giấy và đem lại hiệu quả kinh tế cho người trồng rừng. Đồng thời nguồn cung cấp cây nguyên liệu giấy cho sản xuất giấy hiện tại cơ bản gồm 2 loài keo và bạch đàn. Vì vậy, trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi thực hiện nghiên cứu với 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 hiện có tại Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy. - Các môi trường nuôi cây; một số hóa chất. 4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài Nội dung nghiên cứu của đề tài chỉ giới hạn nghiên cứu nhân giống và khảo nghiệm bằng phương pháp nuôi cây mô tế bào 3 dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 và trồng khảo nghiệm trên thực địa. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Những nét chung về các dòng keo lai Keo lai là tên gọi tắt để chỉ giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis), giống lai này được Messrs Herburn và Shim phát hiện lần đầu tiên vào năm 1972 trong số những cây Keo tai tượng được trồng ven đường ở Sook Telupid thuộc bang Sabah của Malaysia. Đến tháng 7 năm 1978, sau khi xem xét các mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản thực vật ở Queensland (Australia) được gửi đến từ tháng 1 năm 1977 Pedgley đã xác nhận đó là giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm. Việt Nam giống keo lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm (Acacia mangium x Acacia auriculiformis) được phát hiện từ năm 19911992. Những cây lai này (gọi tắt là Keo lai) được phát hiện ở các vùng như Tân Tạo, Sông Mây, Trị An, Trảng Bom ở Đông Nam Bộ và Ba Vì (Hà Tây), Phú Thọ, Hoà Bình, Tuyên Quang vv.. ở Bắc Bộ. Keo lai là một dạng lai tự nhiên giữa Keo tai tượng với Keo lá tràm, có tỷ trọng gỗ và nhiều đặc điểm hình thái trung gian giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm. Keo lai có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với Keo tai tượng và Keo lá tràm. Cây keo lai được xác định là một trong những loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng hiện nay ở Việt Nam. Hiện nay, có rất nhiều dòng keo lai đã được công nhận giống quốc gia là BV10, BV16, BV32, các dòng được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật là BV5, BV29, BV33, TB6, TB12, KL2, KL20 và KLTA3. Trong đó, có 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 là 3 dòng được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy tuyển chọn và nhân giống đưa vào sản xuất phục vụ trồng rừng. 6 Các dòng keo lai KL2, KL20 và KLTA3 được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật theo Quyết định số 2722 QĐ/BNN-KHCN, ngày 07/09/2004; Quyết định số 1773 QĐ/ BNN-KHCN, ngày 17/07/2005 và Quyết định số 1686 QĐ/BNN-KHCN, ngày 09/06/2006. 1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam * Trên thế giới Keo lai Acacia hybrid là tên gọi của giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Keo lai là cây gỗ thường xanh, cao 25 - 30 m, đường kính 30 - 40 cm. Thân thẳng, cành nhánh nhỏ, đoạn thân dưới cành lớn. Vỏ màu xám, hơi nứt dọc. Lá, hoa, quả và hạt đều có tính trung gian giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm. Lá (giả) đơn, mọc cách 3 - 4 gân song song xuất phát từ gốc lá. Hoa tự bông đuôi sóc nhỏ, màu trắng vàng. Quả đậu, mặt cắt ngang hình bầu dục. Quả chín tự khai. Hạt đen, hình elip, dài 4 - 5 mm, rộng 2.5 - 3.5 mm. Sinh trưởng nhanh hơn Keo tai tượng và Keo lá tràm. Gỗ giác màu xám trắng, gỗ lõi màu nâu nhạt, tỷ trọng gỗ khô tự nhiên 0.56 - 0.63, tỷ trọng gỗ khô kiệt 0.48 - 0.54, hiệu suất bột giấy 0.49 - 0.52. Gỗ keo lai rất thích hợp để làm giấy, làm ván dăm và ván MDF, có thể làm gỗ xẻ và đồ mộc. Rễ có nhiều nốt sần rất thích hợp để cải tạo đất, hoa dùng để nuôi ong. Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) v.v. Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng. 7 Hiện nay, đã có rất nhiều các loài cây lâm nghiệp được nhân giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào như các loài Acacia, các loài Eucalyptus, ... Trong đó, cây keo lai Acacia hybrid là một trong những đối tượng chính, được nhân giống thành công ở nhiều nước như Malaysia, Ấn Độ .... R .Yasodha (2004)[23], đã nghiên cứu tái sinh cây keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào cho kết quả sử dụng chất khử trùng HgCl2, mùa tốt nhất để vào mẫu là tháng 5 và tháng 8, sử dụng môi trường MS bổ sung IBA 3.0-5.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 3.0 mg/l là tốt nhất với dòng No.10; sử dụng môi trường MS bổ sung IBA 2.0-4.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và IAA 2.0 3.0 mg/l là tốt nhất với dòng No.32. Christine Le Roux (2009)[21], đã lựa chọn chồi nách từ cây mẹ 1.5 năm tuổi, các chồi được khử trùng và vào mẫu thành công. Đầu tiên tác giả sử dụng Tween 20 để rửa mẫu, khử trùng trong cồn 700 trong 30s để khử trùng bề mặt. Sau đó tiến hành khử trùng sâu với HgCl2 0.1% trong 1-2 phút. Các chồi in vitro được ra rễ thành công trên môi trường MS giảm ½ nồng độ muối đa lượng, bổ sung với 0.1 mM NaFe-EDTA, 1.03 µM NAA và 58.4 µM succharose, pH của môi trường được điều chỉnh ở mức 5.7 và môi trường được ổn định bằng Phytagel 0.3%. Điều kiện vật lý trong quá trình nuôi cấy là 280C, 16h chiếu sáng ở cường độ 60 µmol.m2.s1. Nguyên lý cơ bản của nhân giống in vitro là tính toàn năng của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom). Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có 8 thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định là nhờ vào sự phân hoá. Phân hoá tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân hoá có thể biểu diễn như sau: Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng. Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hóa, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào. Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong AND của tế bào. Tài nguyên di truyền cây nông nghiệp tức là quỹ gen cây nông nghiệp, được FAO gọi là tài nguyên di truyền thực vật vì mục tiêu lương thực và nông nghiệp (TNDTTVLN), lại là phần có trọng số lớn nhất của toàn bộ tài nguyên 9 di truyền thực vật. Sự xói mòn nguồn gen cây trồng trong nông nghiệp gây ra bởi nhiều nguyên nhân hiện nay đang là vấn đề nghiêm trọng, Để có thể bảo tồn và sử dụng hiệu quả đa dạng sinh học nông, lâm nghiệp trong đó tài nguyên di truyền thực vật là hạt nhân, Hội nghị Thượng đỉnh lần thứ nhất về môi trường họp tại Stockholme, Thụy Điển năm 1972 đã kêu gọi khẩn cấp nhiệm vụ bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật. Hai mươi năm sau, Hội nghị Thượng đỉnh lần thứ hai họp tại Río de Janero, Brazin năm 1992 đã thoả thuận Công ước đa dạng sinh học. Hội nghị Kỹ thuật quốc tế lần thứ tư về tài nguyên di truyền thực vật phục vụ mục tiêu lương nông do FAO triệu tập năm 1996 tại Cộng hòa liên bang Đức đã thống nhất Kế hoạch hành động toàn cầu (Global Plant of Action, GPA) về bảo tồn quỹ gen cây nông nghiệp. Gần đây, tháng 11 năm 2001 Đại hội đồng FAO đã thông qua Hiệp ước về Tài nguyên di truyền thực vật phục vụ mục tiêu lương nông nhằm thiết lập một hệ thống tiếp cận tài nguyên cây trồng và chia sẻ lợi ích đa phương phục vụ lương thực và nông nghiệp[5]. Việc lưu giữ và bảo tồn nguồn gen quý hiếm của các loài cây nguyên liệu giấy nói riêng và các cây thân gỗ nói chung là việc làm rất cần thiết đã, đang được nhiều nước trên thế giới chú ý: - Năm 1850 ở Châu Âu người ta đã bắt đầu nhận thức được vấn đề cần bảo tồn. - Năm 1985 bảo tồn đa dạng sinh học được bắt đầu và đến năm 1992 các hoạt động này được triển khai. Đây chính là nền móng cho sự bảo tồn đa dạng sinh học. - Năm 1991 có rất nhiều nước tham gia hội thảo quốc tế về bảo tồn đa dạng sinh học tại Rio de Janero, Brazil và đã ký công ước đa dạng sinh vật Quốc tế, đánh dấu bước khởi đầu thúc đẩy tiến trình bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật. 10 - Năm 1972 CGIAR thành lập Viện tài nguyên di truyền thực vật Quốc tế để làm tư vấn kỹ thuật cho các quốc gia thực hiện nhiệm vụ bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật. - Hiện nay, các ngân hàng gen cây trồng trên thế giới đang lưu giữ 6.5 triệu mẫu giống, trong đó 87% ở ngân hàng gen quốc gia và 11% ở các ngân hàng gen của các cơ quan nghiên cứu do CGIAR quản lý. - Khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, Đài Loan và Hàn Quốc mới xúc tiến nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen cây trồng năm 1980, nhưng là một trong số mười quốc gia có ngân hàng gen cây trồng lớn nhất thế giới, đang bảo tồn trên 100.000 mẫu giống. Trên thế giới, hoạt động bảo tồn nguồn gen cây nguyên liệu giấy chủ yếu là theo phương pháp in situ. Từ năm 1970, tổ chức Nông lâm của Liên hợp quốc (FAO) đã thực hiện dự án đầu tư xây dựng các khu bảo tồn ex situ cho bạch đàn ở một số nước như Thái Lan, ấn Độ, Nigiêria, Băng-la-đét... - Australia, năm 1972 đã tiến hành xây dựng các khu bảo tồn gen insitu cho bạch đàn với mục tiêu bảo tồn nguồn gen hơn là bảo tồn các cây cá thể. Yêu cầu cơ bản là duy trì các quần thể bằng cách tái sinh tự nhiên hoặc nhân tạo từ nguồn hạt giống thu hái trong khu bảo tồn và tái tạo thế hệ mới từ nhiều cây cá thể. - Ở Trung Quốc, từ những năm 1978 Viện nghiên cứu lâm nghiệp Khâm Châu tỉnh Quảng Tây đã tiến hành bảo tồn nguồn gen bạch đàn bằng in vitro. Sau đó hình thức bảo tồn này được áp dụng rộng rãi ở nhiều nơi (Viện khoa học lâm nghiệp Quảng Tây, Viện khoa học lâm nghiệp Quảng Đông...) cho các đối tượng: Bạch đàn, thông, keo và một số loài cây khác [10]. - Công ty Aracruz (Braxin), ngay từ những năm 1984 đã chọn 5.000 cây trội từ 36.000 ha rừng trồng bạch đàn. Từ đó đã chọn ra 150 dòng phù hợp nhưng chỉ sử dụng 31 dòng tốt nhất vào chương trình trồng rừng. Năm 11 1989, vốn gen của họ có 2.000 xuất xứ của 56 loài bạch đàn, trên 7.000 cây đã được kiểm tra đánh giá và 100 cây chứng tỏ có triển vọng cao. - FAO đã đầu tư cho xây dựng một số khu bảo tồn ex situ cho bạch đàn ở một số nước như Thái Lan, ấn Độ, Nigiêria, Băng-la-đét... Nhìn chung, tất cả các nghiên cứu và đầu tư trên đều tập trung vào tầm quan trọng của công tác bảo tồn nguồn gen, nó có vai trò rất quan trọng trong công tác giống, một số thàng tựu đã đạt được và các nghiên cứu vẫn đang được thực hiện trên thế giới. * Ở Việt Nam Cây keo lai tự nhiên đã được phát hiện tại Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Australia, nam Trung Quốc và một số nước khác ở vùng Châu Á - Thái Bình Dương, ở vĩ độ 8 - 22o Bắc, độ cao 5 - 300 m trên mặt biển, nơi có lượng mưa hàng năm 1500 - 2500 mm/năm, nhiệt độ trung bình năm 23 - 27o C, nhiệt độ tối cao trung bình tháng nóng nhất 31 - 34o C, nhiệt độ tối thấp trung bình tháng lạnh nhất 15 - 22o C. Vùng trồng Keo lai thích hợp là các tỉnh từ Bắc Trung Bộ đến Nam Bộ (đặc biệt là các tỉnh Nam Bộ) và Tây Nguyên. Keo lai cũng sinh trưởng tốt ở vùng thấp các tỉnh Bắc Bộ. Ở những nơi đất tốt và trồng thâm canh có thể đạt năng suất 25- 35 m3/ha/năm. Cây keo lai được xác định là một trong những loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng hiện nay ở Việt Nam (Cẩm nang lâm nghiệp, Chương: Chọn loài cây ưu tiên cho các chương trình trồng rừng ở Việt Nam, 2004). Hiện nay, có rất nhiều dòng keo lai đã được công nhận giống quốc gia là BV10, BV16, BV32, các dòng được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật là BV5, BV29, BV33, TB6, TB12, KL2, KL20 và KLTA3. Trong đó, có 3 dòng KL2, KL20 và KLTA3 là 3 dòng được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy tuyển chọn và nhân giống đưa vào sản xuất phục vụ trồng rừng.