Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu nhân giống thông caribe (pinus caribaeca morelet) bằng phương pháp nu...

Tài liệu Nghiên cứu nhân giống thông caribe (pinus caribaeca morelet) bằng phương pháp nuôi cấy invitro

.PDF
70
67
77

Mô tả:

-1- Më ®Çu Mét trong nh÷ng loµi c©y ®· ®-îc dÉn nhËp vµo trång thµnh c«ng ë ViÖt Nam lµ Th«ng caribª (Pinus caribaea Morelet), Th«ng caribª gåm ba biÕn chñng lµ Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis vµ Pinus caribaea var bahamensis ®Òu cã ph©n bè tù nhiªn ë vïng Trung Mü [27]. §©y lµ loµi c©y gç lín, cã thÓ cung cÊp gç lµm nguyªn liÖu ®Ó s¶n xuÊt bét giÊy, v¸n nh©n t¹o vµ ®å gia dông. Lµ loµi c©y cã sinh tr-ëng nhanh, cµnh nh¸nh nhá, th©n th¼ng ®Ñp, tû lÖ lîi dông gç cao… ®¸p øng ®­îc nhiÒu môc tiªu kinh tÕ, nªn ®Õn nay ®· cã trªn 65 n-íc nhËp gièng g©y trång, chñ yÕu lµ c¸c n-íc thuéc vïng nhiÖt ®íi vµ ¸ nhiÖt ®íi [9]. Th«ng caribª ®-îc nhËp vµo trång thö nghiÖm ë n-íc ta n¨m 1963 t¹i L©m §ång [9], qua c¸c kh¶o nghiÖm vµ rõng trång thö nghiÖm cho thÊy Th«ng caribª tá ra lµ loµi c©y cã søc sinh tr-ëng nhanh, thÝch øng réng víi nhiÒu vïng sinh th¸i. KÕt qu¶ nhiÒu n¬i cho thÊy rõng sinh tr-ëng kh¸ tèt vµ Th«ng caribª cã kh¶ n¨ng thÝch øng lín víi m«i tr-êng. §Æc biÖt Th«ng caribª cã thÓ sinh tr-ëng ®-îc trªn c¸c vïng ®Êt trèng, ®åi träc nghÌo dinh d-ìng, mét bé phËn ®Êt ®ai rÊt lín ë n-íc ta [2], [3]. Nh÷ng dÊu hiÖu ®ã cho thÊy Th«ng caribª lµ mét trong sè nh÷ng loµi c©y trång rõng cã triÓn väng cung cÊp gç nhì, gç lín, gç nguyªn liÖu giÊy … cho nÒn kinh tÕ quèc d©n vµ ®ång thêi sím n©ng cao ®é che phñ cña rõng gãp phÇn æn ®Þnh m«i tr-êng sinh th¸i vµ ®ang ®-îc nhiÒu c¬ quan nghiªn cøu, nhiÒu c¬ së s¶n xuÊt hÕt søc quan t©m. ë ViÖt Nam c¸c loµi th«ng ®-îc trång chñ yÕu hiÖn nay lµ Th«ng ba l¸ (Pinus kesiya), Th«ng nhùa (Pinus merkusii), Th«ng ®u«i ngùa (Pinus masoniana) vµ gÇn ®©y lµ Th«ng caribª (Pinus caribaeea) víi c¸c biÕn chñng kh¸c nhau [11]. Nh×n chung trong c¸c loµi th«ng nµy, Th«ng caribª lµ loµi th«ng cã sinh tr-ëng nhanh, th©n c©y th¼ng ®Ñp, cµnh nh¸nh nhá h¬n Th«ng ba l¸ vµ Th«ng ®u«i ngùa, cã tû lÖ gç sö dông cao nªn ®-îc -a thÝch g©y trång. Víi ®Æc ®iÓm sinh lý, sinh th¸i -2- vµ gi¸ trÞ kinh tÕ cña Th«ng caribª, trong ch-¬ng tr×nh trång míi 5 triÖu hecta rõng hiÖn nay, Th«ng caribª ®· ®-îc chän lµ mét trong nh÷ng c©y trång chÝnh quan träng cÇn ®-îc -u tiªn ph¸t triÓn. Tuy nhiªn sù ra hoa kÕt qu¶ cña Th«ng caribª ë ViÖt Nam tõ nhiÒu n¨m tr-íc ®©y cã mét sè vÊn ®Ò. Trªn c¬ së theo dâi vËt hËu c¸c l©m phÇn Th«ng caribª trong c¶ n-íc vµ sè liÖu ®iÒu tra c¸c nguån gièng, cã thÓ thÊy lµ kh¶ n¨ng cung øng gièng Th«ng caribª ë ViÖt Nam ch-a ®ñ ®¸p øng nhu cÇu trång rõng trong n-íc. T×nh tr¹ng thiÕu gièng hiÖn nay lµ do mét sè nguyªn nh©n. Nguyªn nh©n t¹o ra biÕn ®éng vÒ n¨ng suÊt vµ chÊt l-îng h¹t gièng Th«ng caribª ë ViÖt Nam lµ do mét sè l©m phÇn cã diÖn tÝch lín míi b¾t ®Çu ®Õn tuæi thµnh thôc vµ cho h¹t h÷u thô nh- ë U«ng BÝ (Qu¶ng Ninh), H-¬ng S¬n (Hµ TÜnh). Ngoµi ra n¨ng lùc s¶n xuÊt h¹t gièng cña c¸c l©m phÇn Th«ng caribª ë ViÖt Nam ch-a ®-¬c tËn dông hÕt ®Ó ®¸p øng nhu cÇu gièng trong n-íc [1]. NhiÒu khu rõng trång th«ng kh«ng ra hoa kÕt qu¶ hoÆc chØ ra qu¶ mµ kh«ng cã h¹t h÷u thô hoÆc sè h¹t h÷u thô rÊt Ýt, kh«ng ®ñ h¹t gièng cung cÊp cho trång rõng. Trong khi kh¶ n¨ng cung cÊp h¹t cña Th«ng caribª ch-a ®ñ, gi¸ thµnh h¹t nhËp ngo¹i ®¾t, nh©n gièng v« tÝnh th«ng cã vai trß quan träng trong viÖc ph¸t triÓn c©y gièng ®Ó cung cÊp cho trång rõng. Ngµy nay, kü thuËt nh©n gièng c©y trång ®· cã nh÷ng b-íc ph¸t triÓn v-ît bËc, b»ng c«ng nghÖ nh©n gièng v« tÝnh cã thÓ t¹o ra mét sè l-îng lín c©y gièng mang b¶n chÊt di truyÒn gièng hÖt c©y mÑ trong mét thêi gian ng¾n. Trªn thÕ giíi c«ng nghÖ nh©n gièng v« tÝnh th«ng bao gåm kü thuËt nu«i cÊy in vitro (nu«i cÊy m« tÕ bµo) vµ kü thuËt nh©n gièng hom, chiÕt, ghÐp… trong ®ã nu«i cÊy in vitro vµ gi©m hom ngµy cµng ®ãng vai trß chñ ®¹o. LÇn ®Çu tiªn n¨m 1976, nh÷ng thùc nghiÖm vÒ nh©n gièng hom víi mét sè loµi th«ng nhiÖt ®íi ®· ®-îc tiÕn hµnh t¹i Trung t©m nghiªn cøu c©y cã sîi (nay lµ ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy) ë møc lµ nh÷ng nghiªn cøu rÊt s¬ khai vµ ®· ®¹t ®-îc mét sè kÕt qu¶. Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng ( ViÖn KHLN ) còng ®· thö nghiÖm gi©m hom mét sè loµi th«ng vµ ®· thµnh c«ng b-íc ®Çu víi c©y th«ng lai vµ c©y Th«ng Caribª. Tuy nhiªn Th«ng caribª l¹i lµ loµi khi nh©n gièng b»ng ph-¬ng ph¸p gi©m hom trùc tiÕp -3- tõ c©y tréi kh«ng ph¶i lu«n ®¹t ®-îc kÕt qu¶. Khi gi©m hom cho loµi th«ng nµy tõ c©y non ë v-ên cÊp hom th× dÔ thµnh c«ng h¬n [8]. Nh- vËy gi©m hom th«ng ë ViÖt Nam kÕt qu¶ ch-a cao, ch-a thÓ ®-a vµo s¶n xuÊt quy m« lín. HiÖn nay nu«i cÊy in vitro ®· ®-îc ¸p dông trong mét sè n-íc cã nÒn l©m nghiÖp ph¸t triÓn vµ ®· ®-îc thùc hiÖn ë quy m« c«ng nghiÖp. Nu«i cÊy m« tÕ bµo lµ mét kü thuËt tiªn tiÕn trong nh©n gièng c©y trång, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c c©y th©n gç nh- c©y ¨n qu¶ vµ c©y l©m nghiÖp. Nu«i cÊy m« tÕ bµo cã nhiÒu -u viÖt h¬n h¼n c¸c ph-¬ng ph¸p nh©n gièng kh¸c: cho hÖ sè nh©n gièng cao, tõ mét c©y mÑ -u viÖt ban ®Çu cã thÓ t¹o ra hµng triÖu c©y ®· ®-îc lµm trÎ ho¸ vµ s¹ch bÖnh… C©y ­u viÖt ®­îctrÎ ho¸ qua nu«i cÊy m« lµ nguån vËt liÖu lý t-ëng ®Ó cung cÊp hom gièng cho nh©n gièng b»ng gi©m hom. XuÊt ph¸t tõ nh÷ng vÊn ®Ò trªn, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®Ò tµi: “ Nghiªn cøu nh©n gièng Th«ng caribª (Pinus caribaea Morelet) b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro” §èi t-îng nghiªn cøu lµ loµi Th«ng caribª (Pinus caribaea var hondrensis), loµi th«ng nµy lµ mét trong 3 biÕn chñng cña Th«ng caribª cã nhiÒu triÓn väng ë ViÖt Nam. -4- Ch-¬ng 1 Tæng quan tµI liÖu 1.1. Mét sè kÕt qu¶ øng dông kü thuËt nu«i cÊy in vitro thùc vËt trong s¶n xuÊt n«ng l©m nghiÖp Nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo hay vi nh©n gièng lµ tªn gäi chung cho c¸c ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro cho c¸c bé phËn nhá ®-îc t¸ch khái c©y (George, 1993) ®ang ®-îc dïng phæ biÕn ®Ó nh©n gièng thùc vËt, trong ®ã cã c©y l©m nghiÖp. C¸c bé phËn ®-îc dïng ®Ó nu«i cÊy cã thÓ lµ chåi ®Ønh, chåi bªn, chåi bÊt ®Þnh, bao phÊn, phÊn hoa, ph«i vµ c¸c bé phËn kh¸c nh- vá c©y, l¸ non, th©n mÇm … [18], [19]. Nhê øng dông kü thuËt nu«i cÊy m« vµo nh©n gièng, ng-êi ta ®· t¹o ra hµng lo¹t c©y con ®ång nhÊt vÒ kiÓu gen víi sè l-îng lín mµ c¸c ph-¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh th«ng th-êng kh¸c kh«ng thÓ cã ®-îc. Nu«i cÊy m« cã -u thÕ h¬n c¸c ph-¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh kh¸c lµ cã tû lÖ nh©n gièng cao, tíi hµng triÖu c©y mçi n¨m. Ngoµi ra cã thÓ ¸p dông nhiÒu biÖn ph¸p xö lý lªn nu«i cÊy in vitro h¬n lµ c¸c ph-¬ng ph¸p kh¸c. C©y gièng t¹o ra b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro võa khoÎ, trÎ sinh lý vµ cã thÓ s¹ch virus ngay c¶ khi mÉu lÊy tõ ®Ønh sinh tr-ëng cña nh÷ng c©y ®· nhiÔm virus. N¨m 1960, Morell ®· nhËn thÊy m« ph©n sinh cña ®Þa lan vµ phong lan cã rÊt Ýt hoÆc kh«ng cã virus, tõ ®ã «ng ph¸t hiÖn ra kh¶ n¨ng nh©n nhanh c©y s¹ch bÖnh cña c¸c gièng nµy. ChØ sau mét n¨m, «ng thu ®-îc 4 triÖu c©y ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn tõ mét chåi lan ban ®Çu [22]. Sau ®ã Morell vµ céng sù ®· phôc tr¸ng gièng khoai t©y b»ng c¸ch dïng kü thuËt nu«i cÊy m« ph©n sinh vµ ®· t¹o ra ®-îc nh÷ng c©y khoai t©y kh«ng chøa virus (1968) [22]. Theo Murashige (1974) cã kho¶ng 300 loµi c©y cã thÓ nh©n gièng b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro) [33]. Kü thuËt nu«i cÊy m« ®· ®-îc h¬n 600 c«ng ty trªn thÕ giíi ¸p dông ®Ó nh©n hµng triÖu c©y gièng hµng n¨m, trong ®ã chñ yÕu -5- lµ nh©n gièng c©y hoa, c©y c¶nh, c©y ¨n qu¶, c©y c«ng nghiÖp vµ mét sè c©y rau (Vasin, 1994) [21]. Nhu cÇu c©y gièng in vitro ngµy cµng nhiÒu, mÊy n¨m gÇn ®©y hµng n¨m trªn thÕ giíi s¶n xuÊt kho¶ng 50 triÖu c©y c¸c lo¹i, -íc tÝnh ph¶i ®¹t 250 triÖu c©y/n¨m míi ®¸p øng ®-îc yªu cÇu thùc tiÔn [19]. Dù kiÕn thÞ tr-êng c©y gièng ®-îc nh©n b»ng kü thuËt nu«i cÊy m« vµo kho¶ng 15 tû USD/n¨m vµ tèc ®é t¨ng tr-ëng hµng n¨m cña thÞ tr-êng lµ kho¶ng 15% (Govil vµ Gupta, 1997) [21]. Th¸i Lan mçi n¨m xuÊt khÈu hoa thu kho¶ng 20 triÖu USD, trong ®ã phÇn lín lµ hoa ®-îc nh©n gièng b»ng nu«i cÊy in vitro. ViÖc chän vËt liÖu ban ®Çu cho vi nh©n gièng lµ rÊt quan träng, kh«ng nh÷ng quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng ban ®Çu mµ c¶ qu¸ tr×nh nh©n tiÕp theo. C¸c c«ng tr×nh cña D’Amato (1977) cho thÊy chØ cã ®Ønh sinh tr-ëng cña chåi míi ®¶m b¶o vÒ sù æn ®Þnh di truyÒn. TiÕp ®Õn lµ ®Ønh m« ph©n sinh víi kÝch th-íc nhá, kÕt hîp víi xö lý nhiÖt ®Ó lµm s¹ch bÖnh lµ vËt liÖu tèt ®Ó nh©n. C¸c chåi nh©n ban ®Çu th-êng ®-îc lÊy tõ ®Ønh chåi hoÆc ®Ønh m« ph©n sinh trªn m«i tr-êng th¹ch chøa c¸c muèi kho¸ng, ®-êng, vitamin vµ c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng. Vi nh©n gièng ®-îc b¾t ®Çu bÇu b»ng t¸ch ®Ønh chåi hoÆc m« ph©n sinh tõ c¸c c©y ®Þnh nh©n, sau ®ã khö trïng vµ ®-a vµo nu«i cÊy ë m«i tr-êng phï hîp. C¸c chåi ®-îc h×nh thµnh vµ ®-îc t¸ch ra cÊy chuyÓn sang m«i tr-êng míi, quy tr×nh cø thÕ ®-îc lÆp l¹i. §©y lµ ph-¬ng ph¸p cho hÖ sè nh©n thÊp h¬n ph-¬ng ph¸p nh©n qua giai ®o¹n m« sÑo hoÆc ph«i, nh-ng c¸c chåi ®-îc h×nh thµnh gi÷ ®-îc ®Æc ®iÓm cña c©y mÑ, Ýt hoÆc kh«ng bÞ thay ®æi vÒ mÆt di truyÒn. Trong mét sè tr-êng hîp, vi nh©n gièng cã thÓ thùc hiÖn th«ng qua viÖc t¹o ph«i hoÆc t¸i sinh c©y trùc tiÕp tõ m« sÑo. Ph-¬ng ph¸p nµy cho hÖ sè nh©n cao h¬n nh-ng th-êng kÐo theo sù biÕn dÞ soma [19]. ¦u ®iÓm cña nu«i cÊy in vitro lµ: cho hÖ sè nh©n cao sÏ rót ng¾n thêi gian ®-a gièng vµo s¶n xuÊt; nh©n ®-îc mét sè l-îng c©y lín trong mét diÖn tÝch nhá; thuËn tiÖn vµ lµm h¹ gi¸ thµnh vËn chuyÓn, viÖc b¶o qu¶n c©y gièng thuËn lîi. C©y nu«i cÊy m« th-êng ®-îc trÎ ho¸ cao ®é vµ cã rÔ gièng nh- c©y mäc tõ h¹t, thËm chÝ kh«ng cã sù kh¸c biÖt ®¸ng kÓ so víi c©y mäc tõ h¹t. Trong lóc c©y hom l¹i -6- th-êng kh«ng cã rÔ cäc, rÔ c©y kh«ng thÓ ®©m s©u xuèng ®Êt nh- c©y mäc tõ h¹t vµ th-êng cã hiÖn t-îng b¶o l-u côc bé. VÝ dô, c©y m« Keo lai ë giai ®o¹n 1-2 th¸ng tuæi (còng nh- c¸c loµi c©y bè mÑ lµ Keo tai t-îng vµ Keo l¸ trµm) cã ®ñ c¸c lo¹i l¸ kÐp mét lÇn, kÐp hai lÇn vµ l¸ gi¶, l¹i cã rÔ theo kiÓu rÔ cäc nh- nh÷ng c©y mäc tõ h¹t ®iÓn h×nh, th× c©y hom còng cña gièng nµy l¹i chØ cã l¸ gi¶ cña c©y tr-ëng thµnh vµ kh«ng cã rÔ cäc (nghÜa lµ tÝnh trÎ ho¸ bÞ h¹n chÕ , cßn tÝnh b¶o l-u côc bé th× biÓu hiÖn râ rÖt). V× thÕ nu«i cÊy m« cßn lµ mét biÖn ph¸p trÎ ho¸ gièng trong s¶n xuÊt l©m nghiÖp [13]. Kh¸c víi c©y n«ng nghiÖp ng¾n ngµy, c©y rõng cã ®êi sèng dµi ngµy vµ ph¶i mÊt nhiÒu n¨m míi ra hoa kÕt qu¶. Sau khi chän ®-îc c©y tréi, muèn cã gièng tèt ®Ó ®-a vµo s¶n xuÊt, ph¶i x©y dùng v-ên gièng vµ rõng gièng vµ ph¶i ®îi thªm mét sè n¨m míi cã thÓ thu ®-îc mét l-îng h¹t ®ñ lín phôc vô trång rõng, tuy nhiªn c©y gièng tõ nh÷ng h¹t nµy sÏ bÞ ph©n ho¸ dÉn ®Õn n¨ng suÊt rõng biÕn ®éng. Nh©n gièng b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro lµ mét trong nh÷ng biÖn ph¸p h÷u hiÖu ®Ó duy tr× nh÷ng ®Æc tÝnh tèt nhÊt cña c©y mÑ cho c¸c thÕ hÖ c©y sinh d-ìng tiÕp theo. Do vËy nu«i cÊy in vitro ®· ®-îc ¸p dông réng r·i cho mét sè loµi c©y rõng nh- b¹ch ®µn [14]. HiÖn nay nu«i cÊy in vitro ®· vµ ®ang ®-îc øng dông réng r·i trong s¶n xuÊt th-¬ng m¹i ë nhiÒu n-íc trªn thÕ giíi, hµng tr¨m loµi c©y l¸ réng vµ hµng chôc loµi c©y l¸ kim ®· ®-îc nu«i cÊy m« thµnh c«ng. Cho tíi n¨m 1991, Th¸i Lan ®· nh©n gièng thµnh c«ng b»ng nu«i cÊy m« cho 55 loµi trong tæng sè 67 loµi tre tróc thö nghiÖm. C«ng nghÖ nµy cho phÐp nh©n nhanh loµi Dendrocalamus asper víi c«ng suÊt 1 triÖu c©y mçi n¨m. Víi loµi Dendrocalamus asper, trong n¨m 1980 hä chØ cã trong tay vµi tr¨m h¹t gièng vµ ®· nhanh chãng cã trªn 100 000 c©y con ®-îc ®-a ra huÊn luyÖn t¹i v-ên -¬m, ®Õn n¨m 1992 môc tiªu cña hä lµ s¶n xuÊt vµi triÖu c©y con phôc vô trång rõng [14]. Sè c¸c loµi b¹ch ®µn ®· ®-îc nh©n gièng b»ng ph-¬ng ph¸p in vitro ngµy mét t¨ng, tíi n¨m 1987 ®· cã trªn 20 loµi b¹ch ®µn kh¸c nhau t¹o ®-îc c©y con in -7- vitro (Gupta vµ Mascarenhas, 1987). C¸c nhµ khoa häc Ên §é ®· t¹o thµnh c«ng c©y m« tõ c¸c c©y tr«i b¹ch ®µn Eucalyptus camandulensis, Eucalyptus globulus, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus torelliana vµ c¶ tõ c¸c c©y tréi cã hµm l-îng tinh dÇu cao cña b¹ch ®µn chanh Eucalyptus citriodora. C©y m« cã nguån gèc tõ c©y -u viÖt sinh tr-ëng nhanh gÊp 3 lÇn vµ ®ång ®Òu h¬n lµ c©y mäc tõ h¹t cña cïng c©y mÑ. T¹i óc, nh©n gièng b»ng nu«i cÊy in vitro ®· ®-îc ¸p dông ®Ó nh©n nhanh c¸c c©y ®-îc chän cho tÝnh chÞu mÆn trong ®Êt vµ ®ang ®-îc ®-a vµo s¶n xuÊt lín cho loµi E. camaldulensis. Vµo n¨m 1987, kho¶ng 20 000 c©y m« cña c¸c dßng v« tÝnh chÞu mÆn ®· ®-îc t¹o ra ®Ó trång l¹i rõng ë c¸c má bauxite gÇn Perth, T©y óc [14]. Trung Quèc ®· t¹o c©y in vitro thµnh c«ng cho 100 loµi c©y th©n gç nhd­¬ng, b¹ch ®µn, bao ®ång, tÕch … Lµ n-íc øng dông sím vµ thµnh c«ng nu«i cÊy m« vµo trång rõng diÖn réng, c©y ®-îc nh©n gièng thµnh c«ng chÝnh lµ E. urophylla. §Õn n¨m 1991 ë vïng Nam Trung Quèc, ng-êi ta ®· t¹o ra trªn 1 triÖu c©y m« cña c¸c c©y vµ dßng lai ®-îc chän läc. Nh÷ng c©y m« nµy ®-îc dïng nhlµ c¸c c©y ®Çu dßng ®Ó t¹o c©y hom t¹i c¸c v-ên -¬m ®Þa ph-¬ng vµ dïng th¼ng vµo trång rõng [15]. NhiÒu loµi c©y l¸ réng ch©u ¢u ®· ®-îc thö nghiÖm nh©n gièng thµnh c«ng b»ng c¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m«, ®ã lµ c¸c loµi nh-: Acer, Beluta, Carpinus, Fagus, Quercus, Ulmus, Fraxinus, Prunus, Juglans, Castanea, Tilia, Sorbus … C¸c c©y m« ®· ®-îc trång ra thùc ®Þa ®Ó so s¸nh vµ ®· cho thÊy chóng cã phenotip gièng nhau, tû lÖ sèng ë rõng trång sau khi c©y ®-îc huÊn luyÖn lµ kh¸ cao, ®¹t 90 -100% cho c¸c loµi Beluta, Quercus, Sorbus vµ Salix [15]. HiÖn nay nu«i cÊy in vitro còng lµ mét biÖn ph¸p nh©n gièng ®-îc ¸p dông nhiÒu ë c¸c loµi c©y l¸ kim nh»m phôc vô cho c¸c ch-¬ng tr×nh trång rõng dßng v« tÝnh. §èi víi c¸c loµi th«ng P. nigra, P. pinaster, P. sylvestris gi©m hom tõ c©y giµ lµ rÊt khã cho nªn ng-êi ta ®ang ¸p dông c¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« nh- nu«i cÊy ph«i, nu«i cÊy t¹o m« sÑo … vµ c¸c biÖn ph¸p nµy cã nhiÒu triÓn väng, nhÊt lµ ®èi -8- víi th«ng P. pinaster. Nh©n chåi in vitro tõ c©y non loµi V©n sam (Picea sitchensis) cho hÖ sè nh©n biÕn ®éng rÊt lín tuú theo c©y mÑ, cô thÓ lµ 17 – 5000 chåi mçi n¨m. Cã tíi 30 loµi trong sè c¸c loµi c©y l¸ kim ®-îc nghiªn cøu nu«i cÊy m« vµ ®· ®¹t ®-îc nh÷ng thµnh c«ng b-íc ®Çu, trong ®ã ph¶i kÓ ®Õn c¸c loµi nhAbies balsamea (t¹o ®-îc chåi ë c©y 15 – 20 tuæi), c¸c loµi B¸ch t¸n Araucaria, LiÔu sam Cryptomeria japonica, Larix sp., Picea glauca, ThiÕt sam Pseudotsuga menziesii, Cï tïng Sequoia sempervirens, Sequoiadendron gigenteum, Thuja sp., Tsuga heterophylla …[15]. Nu«i cÊy m« cã thÓ lµ biÖn ph¸p tèt ®Ó trÎ ho¸ vµ t¨ng hÖ sè nh©n, nhÊt lµ biÖn ph¸p t¹o ph«i v« tÝnh. Ng-êi ta ®· nghiªn cøu t¹o nu«i cÊy ph«i v« tÝnh cho c©y ThiÕt sam (Pseudotsuga menziesii), mÆc dï ch-a t¹o ra ®-îc c©y hoµn chØnh tõ c¸c ph«i v« tÝnh cña c©y nµy nh-ng chåi bÊt ®Þnh ®· ®-îc t¹o ra tõ ®Ønh th©n c©y mÑ 64 tuæi. B»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro, c¸c loµi B¸ch t¸n cho hÖ sè nh©n thÊp, chØ t¹o ®-îc 20 – 60 chåi míi tõ mét c©y con trong vßng 4 th¸ng ®èi víi loµi A. cunninghamii vµ míi chØ cã c¸c chåi cña loµi c©y nµy ra rÔ in vitro [15] Trong sè 30 loµi c©y l¸ kim ®· ®-îc nu«i cÊy m«, cã bèn loµi ®-îc ®-a vµo s¶n xuÊt diÖn réng, ®ã lµ Cï tïng Sequoia sempevirens ë AFOCEL (Ph¸p); th«ng P. radiate ë ViÖn nghiªn cøu l©m nghiÖp New Dil©n; P. taeda vµ Pseudotsuga menziesii ë Mü . C¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« còng ®· ®-îc ¸p dông cho c©y TÕch, Gupta vµ c¸c céng sù (1979) ®· m« t¶ sù h×nh thµnh côm chåi tõ phÇn c¾t cña c©y non vµ tõ mÇm c©y 100 tuæi. Tõ ®ã hä cã thÓ t¹o ®-îc 500 c©y in vitro tõ mét chåi ë c©y tr-ëng thµnh vµ 3000 c©y tõ mét c©y non trong mét n¨m. Kaosa-ard (1990) cho biÕt Th¸i Lan còng ®· ph¸t triÓn thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy m« (nu«i cÊy ®Ønh th©n vµ ph«i) vµo n¨m 1986 cho c©y TÕch vµ cho phÐp t¹o 500 000 chåi tõ mét chåi trong mét n¨m. Perhutani (1991) còng cho biÕt Indonexia ®· thö nghiÖm nu«i cÊy m« thµnh c«ng vµ mét vµi c©y m« ®· ®-îc ®em trång thö [15]. -9- Ng-êi ta còng ®· nh©n gièng thµnh c«ng Phi lao b»ng c¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« vµ ®· trång so s¸nh víi c©y h¹t trong nhµ kÝnh. Kü thuËt nµy ®ang ®-îc dïng ®Ó t¹o c©y m« Phi lao sinh tr-ëng nhanh, kh¸ng bÖnh vµ cè ®Þnh ®¹m cao cho trång rõng [15]. 1.2. Th«ng caribª, vÞ trÝ trong s¶n xuÊt l©m nghiÖp vµ triÓn väng trång rõng ë ViÖt Nam Th«ng caribª (Pinus caribaea Morelet) ®-îc g©y trång ë n-íc ta tõ nh÷ng n¨m 1963, nh÷ng th«ng b¸o ®Çu tiªn cho thÊy Th«ng caribª lµ loµi sinh truáng nhanh th©n th¼ng ®Ñp, cµnh nh¸nh nhá h¬n Th«ng ba l¸ vµ Th«ng ®u«i ngùa nªn ®-îc nhiÒu ®Þa ph-¬ng -a thÝch g©y trång. Tuy nhiªn ch-a ®-îc ®¸nh gi¸ ®Çy ®ñ, v× vËy cã nhiÒu ý kiÕn kh¸c nhau trong viÖc sö dông loµi th«ng nµy [9], [12]. Th«ng caribª gåm 3 biÕn chñng lµ: Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis vµ Pinus caribaea var bahamensis ®Òu cã ph©n bè tù nhiªn ë vïng Trung Mü. Trong ®ã biÕn chñng caribaea cã ph©n bè tõ 16o – 20o ®é vÜ B¾c, ph©n bè tù nhiªn ë Cuba vµ ®¶o Juventus thuéc vïng biÓn Caribª, chñ yÕu tËp trung ë nh÷ng vïng thÊp, ®åi b¸t óp, th-êng ë ®é cao 330 m so víi mÆt n-íc biÓn. Ngoµi ra biÕn chñng caribaea cßn xuÊt hiÖn ë ®é cao xÊp xØ 760 m, Ýt cã tr-êng hîp ph©n bè ë ®é cao trªn 1200 m (Poyton, 1997) [4]. BiÕn chñng bahamensis ph©n bè tù nhiªn tõ 22o – 27o ®é vÜ B¾c, thuéc vïng ®¶o Bahamas vµ Caicos, ngoµi ra cßn t×m thÊy ë b¸n ®¶o Yucutan thuéc vïng §«ng B¾c Mü. BiÕn chñng hondurensis ph©n bè tù nhiªn tõ 12o – 16o ®é vÜ B¾c, tËp trung chñ yÕu ë ®¶o Belize, Guatelama, Poptun, Guanaja, Nicazagua. Sinh tr-ëng chñ yÕu trªn c¸c khu vùc ®ång cá, ®ång b»ng ven biÓn cã ®é cao so víi mÆt n-íc biÓn lµ 460 – 760 m, nh-ng ph©n bè tËp trung nhiÒu nhÊt ë ®é cao 460 m (Perry JP Jr, 1991) [4]. Gç Th«ng caribª cã thí th¼ng mÞn, ®é bãng võa ph¶i, th-êng ®-îc sö dông lµm v¸n Ðp, th©n Th«ng caribª th¼ng, dÔ c-a xÎ nh-ng phô thuéc nhiÒu vµo ®é tuæi - 10 - (Bredenkamp vµ Van Vuuren, 1987) [25]. Ngoµi ra Th«ng caribª cßn cã nhiÒu c«ng dông kh¸c nh-: gç x©y dùng, gç trô má, v¸n d¨m, v¸n Ðp, bét giÊy, gç ®ãng tµu thuyÒn, v¸n èp t-êng, gç ®ãng congten¬, v¸n èp trÇn, gç ®ãng ®å hép, gç cét ®iÖn, gç cét nhµ, gç néi thÊt, than cñi… Víi tèc ®é sinh tr-ëng nhanh vµ kh¶ n¨ng thÝch øng réng víi c¸c vïng sinh th¸i kh¸c nhau trªn thÕ giíi, ®¸p øng ®-îc nhiÒu môc tiªu kinh tÕ nªn Th«ng caribª ®· ®-îc dÉn nhËp g©y trång ë 65 n-íc trªn thÕ giíi, chñ yÕu lµ c¸c n-íc thuéc vïng NhiÖt ®íi vµ ¸ nhiÖt ®íi. Giíi h¹n vÜ ®é trång më réng nhiÒu so víi n¬i nguyªn s¶n, tõ vÜ ®é 55o Nam ë Argentina tíi 33o vÜ ®é B¾c ë Ên §é D-¬ng, giíi h¹n kinh ®é còng ®-îc më réng tõ 180o kinh ®«ng ë Fiji tíi 158o kinh ®é t©y ë Hawaii. §é cao vïng trång biÕn ®éng tõ mÆt n-íc biÓn tíi 1200 m ë Zaire, 1220 m ë Nigeria, trªn 1820 m ë Uganda vµ 2400 m ë Kenya (Anoruo vµ Berlyn, 1993) [5] Nh- vËy, Th«ng caribª ®· ®-îc g©y trång ë tÊt c¶ c¸c d¹ng khÝ hËu cña c¸c n-íc nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi. Vïng ph©n bè rõng trång cña loµi ®-îc më réng c¶ vÒ vÜ ®é vµ kinh ®é, c¶ vïng cã khÝ hËu miÒn nói tíi khÝ hËu cËn nhiÖt ®íi vµ vïng ven biÓn (Anoruo vµ Berlyn, 1993) [5]. Nh×n chung th«ng Caribª cã thÓ sinh tr-ëng tèt trªn nhiÒu lo¹i ®Êt kh¸c nhau khi ®-îc trång ngoµi ph¹m vi ph©n bè tù nhiªn cña chóng. ViÖt Nam lµ mét n-íc n»m trong khu vùc nhiÖt ®íi cña Ch©u ¸, cã c¸c ®iÒu kiÖn ®Þa lý kh¸ t-¬ng ®ång víi sù ph©n bè tù nhiªn cña Th«ng caribª, nªn ®· ®-îc ®-a vµo trång ë n-íc ta tõ nhiÒu n¨m nay. Ngµy nay Th«ng caribª ®· ®-îc x¸c ®Þnh lµ mét trong c¸c loµi c©y trång rõng trong ch-¬ng tr×nh 5 triÖu hecta rõng. C¸c kÕt qu¶ kh¶o nghiÖm b-íc ®Çu ë ViÖt Nam cho thÊy th«ng lµ loµi c©y cã nhiÒu triÓn väng, ®Æc biÖt lµ biÕn chñng Pinus caribaea var hondurensis. KÕt qu¶ kh¶o nghiÖm Th«ng caribª t¹i §µ L¹t n¨m 1963 b-íc ®Çu cho thÊy biÕn chñng hondurensis cña Th«ng caribª cã sinh tr-ëng nhanh, h×nh d¸ng th©n ®Ñp, cao, thon ®Òu, t¸n l¸ nhá, cµnh mäc ngang, cã tèc ®é sinh tr-ëng nhanh h¬n Th«ng ba l¸. ë tuæi 12, c©y cao b×nh qu©n 14.3 m vµ ®-êng kÝnh ngang ngùc b×nh - 11 - qu©n ®¹t 16.3 cm, t¨ng tr-ëng b×nh qu©n vÒ chiÒu cao lµ 1.19 m/n¨m vµ ®-êng kÝnh lµ 1.35 cm/n¨m. ë tuæi 16, c©y cao trung b×nh 19.9 m, ®-êng kÝnh ngang ngùc trung b×nh lµ 26.4 cm, t¨ng tr-ëng chiÒu cao b×nh qu©n lµ 1.24 m/n¨m vµ ®-êng kÝnh lµ 1.65 cm/n¨m [12]. Kh¶o nghiÖm t¹i Mang Linh cho thÊy biÕn chñng hondurensis trång trªn ®Êt feralit vµng ®á ph¸t triÓn trªn ®¸ mÑ granit cã tÇng ®Êt s©u, Èm vµ líp mïn kh¸ dµy cã sinh tr-ëng nhanh h¬n Th«ng ba l¸ §µ L¹t. Sau 16 n¨m trång, c©y cã chiÒu cao b×nh qu©n lµ 17 m vµ ®-êng kÝnh lµ 26.6 cm, t¨ng tr-ëng b×nh qu©n hµng n¨m vÒ chiÒu cao lµ 1.21 – 1.22 m/n¨m vµ ®-êng kÝnh lµ 1.76 – 1.80 cm/n¨m [12]. Giai ®o¹n 1978 – 1982, mét kh¶o nghiÖm xuÊt xø kh¸ ®Çy ®ñ theo dù ¸n SIDA t¹i Phó Thä (P. Stahl, 1984) [40]. VËt liÖu nghiªn cøu gåm bèn loµi Th«ng: Th«ng nhùa (P. merkusii) víi 5 xuÊt xø, Th«ng ba l¸ (P. kesiya) víi 6 xuÊt xø, Th«ng oocarpa (P. oocarpa) víi 1 xuÊt xø, Th«ng caribª (P. caribaea) gåm 3 biÕn chñng, trong ®ã biÕn chñng caribaea (1 xuÊt xø), biÕn chñng bahamensis (1 xuÊt xø) vµ biÕn chñng hondurensis (4 xuÊt xø). Kh¶o nghiÖm ®-îc x©y dùng trªn 4 ®Þa ®iÓm lµ Th¸i Long, S¬n Nam (Tuyªn Quang), §Òn Hïng vµ Yªn KiÖn (VÜnh Phó cò). Trong 4 loµi th«ng ®-a vµo kh¶o nghiÖm (ë giai ®o¹n 6 – 8 tuæi) th× Th«ng caribª lµ loµi cã sinh tr-ëng nhanh nhÊt, trong c¸c biÕn chñng Th«ng caribª ®-îc kh¶o nghiÖm th× biÕn chñng hondurensis cã sinh tr-ëng nhanh nhÊt, tiÕp ®Õn lµ biÕn chñng bahamensis vµ cuèi cïng lµ biÕn chñng caribaea [16], [30], [41]. KÕt qu¶ kh¶o nghiÖm ë tuæi 8 cho thÊy nh÷ng xuÊt xø cã sinh tr-ëng tèt cña 2 biÕn chñng hondurensis vµ bahamensis lµ xuÊt xø Potun (Guatemala), Guanaja (Honduras), Cardwell (Queensland, Australia), Almicamba (Nicaragua) vµ Andros (Bahamas). T¸c gi¶ ®· ®i ®Õn kÕt luËn: ë khu vùc nµy nÕu trång rõng quy m« lín chØ tËp trung vµo c¸c xuÊt xø tèt cña hai biÕn chñng hondurensis vµ bahamensis [41]. KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ c¸c kh¶o nghiÖm loµi vµ xuÊt xø Th«ng caribª sau 9 n¨m trång kh¶o nghiÖm ë §¹i L¶i (VÜnh Phóc), §«ng Hµ (Qu¶ng TrÞ), - 12 - S«ng M©y (§ång Nai), … cho thÊy Th«ng caribª lµ loµi c©y cã triÓn väng vÒ sinh tr-ëng nhanh, trong ®ã biÕn chñng P. caribaea var hondurensis ®-îc ®¸nh gi¸ lµ biÕn chñng cã sinh tr-ëng nhanh h¬n hai biÕn chñng cßn l¹i, trong biÕn chñng hondurensis cã xuÊt xø Poptun, Alamicamba, Guanaja vµ Cardwell lµ nh÷ng xuÊt xø cã triÓn väng nhÊt vµ phï hîp víi mét sè vïng trång ë n-íc ta [3]. §¸nh gi¸ nh÷ng kÕt qu¶ kh¶o nghiÖm ®-îc x©y dùng gÇn ®©y Lª §×nh Kh¶ còng cho thÊy P. caribaea var hondurensis lµ mét trong nh÷ng biÕn chñng triÓn väng h¬n hai biÕn chñng cßn l¹i [9], [10], [29]. §¸nh gi¸ míi nhÊt cña Phan Thanh H-¬ng (2000) khi nghiªn cøu ®Æc ®iÓm sinh tr-ëng cña mét sè xuÊt xø Th«ng caribª ®-îc kh¶o nghiÖm trªn mét sè trªn mét sè vïng sinh th¸i ë ViÖt Nam cho thÊy trong ba biÕn chñng Th«ng caribª ®-îc ®-a vµo kh¶o nghiÖm, biÕn chñng hondurensis cã sinh tr-ëng tèt nhÊt t¹i 5 ®Þa ®iÓm: §¹i L¶i (VÜnh Phóc), §«ng Hµ (Qu¶ng TrÞ), Pleiku (Gia Lai), Lang Hanh (L©m §ång) vµ S«ng M©y (§ång Nai); biÕn chñng Bahamensis sinh tr-ëng tèt nhÊt ë Xu©n Khanh, CÈm Quú (Hµ T©y); biÕn chñng caribeaea sinh tr-ëng kÐm nhÊt trªn tÊt c¶ c¸c lËp ®Þa [4]. 1.3. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ nh©n gièng th«ng b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro trªn thÕ giíi 1.3.1. C¸c nghiªn cøu vÒ vËt liÖu nu«i cÊy in vitro vµ kh¶ n¨ng h×nh thµnh chåi tõ mÉu nu«i cÊy Nh÷ng nghiªn cøu nu«i cÊy m« cho loµi th«ng ®· ®-îc tiÕn hµnh b»ng viÖc sö dông mÊu nu«i cÊy ban ®Çu tõ c©y con, v× loaÞ vËt liÖu nµy thuËn lîi cho viÖc khö trïng mÉu cÊy. Theo B. Macdonald khi lÊy mÉu cÊy ®èi víi c©y th©n gç nªn lÊy vµo s¸ng sím vµ kÝch th-íc mÉu cÊy nªn dµi tõ 2 – 3 cm [17]. Murashige nhËn thÊy ®èi víi c¸c c©y th©n gç, mÉu cÊy lÊy tõ c©y non t¸i sinh tèt h¬n mÉu lÊy tõ c©y mÑ tr-ëng thµnh [34]. Sù h×nh thµnh c¸c chåi bÊt ®Þnh tõ ph«i tr-ëng thµnh ®· ®-îc tiÕn hµnh cho loµi Th«ng P. radiate, P. loblolly v× kh¶ n¨ng cho hÖ sè nh©n cao, c¸c thö nghiÖm - 13 - trång rõng tõ nh÷ng c©y m« (plantlet) ®· ®-îc thiÕt lËp (Smith, 1985; Amerson vµ céng sù, 1985) [38]. Dïng c¸c mÉu cÊy kh¸c nhau th× sù h×nh thµnh chåi sÏ khã dÔ kh¸c nhau. PhÇn lín c¸c c«ng tr×nh trong nh©n gièng c©y l¸ kim ®· xuÊt b¶n ®Òu m« t¶ vËt liÖu nu«i cÊy ban ®Çu lµ nh÷ng c¬ quan cña c©y non v« trïng víi ph-¬ng thøc t¸i sinh t¹o chåi vµ c©y con. Chåi cã thÓ ®-îc kÝch thÝch vµ h×nh thµnh trùc tiÕp trªn ph«i h÷u tÝnh cña c©y l¸ kim vµ trªn nh÷ng c¬ quan cña c©y non ®Æc biÖt lµ l¸ mÇm vµ chåi ®Ønh, trong ®ã l¸ mÇm cña c©y non tõ lµ vËt liÖu ®-îc sö dông réng r·i nhÊt [26]. Nh÷ng lo¹i mÉu cÊy nµy thuËn tiÖn cho viÖc khö trïng mÉu (lÊy tõ h¹t) vµ còng thuËn lîi cho ph«i v« tÝnh vµ l¸ mÇm ph©n ho¸ t¹o chåi bÊt ®Þnh. Trong hÇu hÕt c¸c nghiªn cøu, l¸ mÇm c©y non ®-îc t¸ch ra ®Ó nu«i cÊy cho sè chåi bÊt ®Þnh nhiÒu h¬n ph«i nguyªn vÑn, trô d-íi l¸ mÇm hoÆc c¸c m« kh¸c cña c©y non vµ trë thµnh mÉu cÊy ®-îc sö dông réng r·i. Kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi cña l¸ mÇm phô thuéc ®éc lËp víi tuæi cña chóng, l¸ mÇm tõ c©y mÇm P. radiate 1 ngµy tuæi ë tr¹ng th¸i sinh lý tèt nhÊt cho sù t¹o chåi (Aitken – Christie vµ c¸c céng sù, 1982), trong khi chåi in vitro cña c©y Linh sam ( Douglas) ®-îc t¸i sinh tõ l¸ mÇm cã tuæi tèi -u tõ 2 – 4 tuÇn (Wochok vµ Abo El-Nil, 1977) [26]. Mét nghiªn cøu kh¸c ®-îc thùc hiÖn bëi Cheng (1977) kh«ng t×m thÊy sù ¶nh h-ëng cña tuæi (2 tuÇn hoÆc 2 th¸ng tuæi) ®Õn sè chåi ®-îc t¹o ra tõ l¸ mÇm c©y Linh sam (Douglas) non. Sè chåi ®-îc h×nh thµnh tõ ph«i hoÆc mÉu cÊy tõ c©y non cã thÓ bÞ ¶nh h-ëng lín bëi c¸c thñ tôc xö lý tr-íc khi t¹o chåi. Sù t¸i sinh chåi in vitro sÏ thuËn lîi nÕu h¹t th«ng ®-îc xö lý l¹nh (Smeltzer vµ céng sù, 1977; Relly vµ Washer, 1977) [26] hoÆc ®-îc xö lý b»ng H2O2 ®Ó ph¸ vì tr¹ng th¸i ngñ tr-íc khi ph«i ®-îc t¸ch ra vµ nu«i cÊy (Mehra-Palta vµ céng sù, 1977) [31]; (Mott vµ Amerson, 1981) [32]. So s¸nh c¸c kÕt qu¶ tõ h¹t ®-îc xö lý vµ kh«ng xö lý, mét tû lÖ lín l¸ mÇm cña P. taeda vµ P. monticola ®· h×nh thµnh chåi vµ cã mét sè lín chåi trªn mét c©y so víi h¹t kh«ng ®-îc xö lý [26]. - 14 - Tuy nhiªn nh÷ng mÉu cÊy trªn chØ nªn giíi h¹n trong viÖc nghiªn cøu qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i v× khã ®¶m b¶o r»ng c¸c ®Æc tÝnh di truyÒn cña chóng cã ®-îc b¶o vÖ hay kh«ng vµ cã phï hîp môc tiªu kh«ng, nªn kh«ng thÓ dïng cho s¶n xuÊt. NÕu môc ®Ých lµ nghiªn cøu, mÉu cÊy ®Òu cã thÓ lÊy tõ ph«i cña h¹t non, h¹t giµ. Nu«i cÊy m«, c¬ quan cña c©y tr-ëng thµnh sÏ khã kh¨n h¬n v× khã t¹o ®-îc mÉu cÊy, cã thÓ kh«ng cho ra ®-îc chåi bÊt ®Þnh hay chåi n¸ch, ®«i khi khã ra rÔ vµ th-êng t¹o ra nh÷ng c©y cã tÝnh h-íng nghiªng. 1.3.2. C¸c nghiªn cøu vÒ m«i tr-êng nu«i cÊy trong nh©n gièng th«ng in vitro Trªn thÕ giíi nh©n gièng c¸c loµi c©y l¸ kim b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy m« ®· ®-îc thùc hiÖn vµ c«ng bè bëi nhiÒu t¸c gi¶ (Aitken – Christie vµ Thorpe, 1984; Berlyn vµ c¸c céng sù, 1986) [38]. Trong nu«i cÊy in vitro, chåi cã thÓ ®-îc t¸i sinh trùc tiÕp tõ callus trªn mÉu cÊy cßn non cña c©y l¸ kim nh-ng nh- vËy th-êng hay cã nh÷ng rñi ro vÒ biÕn ®éng kiÓu gen, ®Æc biÖt lµ nu«i cÊy nh÷ng callus kh«ng cã tæ chøc (Aitken – Christie vµ c¸c céng sù, 1988) [38]. NÕu nh- sù h×nh thµnh chåi tõ callus bÞ lo¹i trõ, kü thuËt nh©n gièng in vitro thÝch hîp cho c©y l¸ kim lµ: t¹o chåi trùc tiÕp; t¹o chåi tõ chåi n¸ch; nu«i cÊy ph«i v« tÝnh. MÉu cÊy sö dông cho nh÷ng kü thuËt nµy lµ ph«i h¹t non, c©y mÇm, chåi n¸ch ... MÉu cÊy tõ nh÷ng c©y tr-ëng thµnh khã ®-îc h×nh thµnh, cã thÓ kh«ng cho ra ®-îc chåi bÊt ®Þnh hay chåi n¸ch, ®«i khi khã t¹o rÔ vµ kÕt qu¶ th-êng t¹o ra nh÷ng c©y h-íng nghiªng (Aitken – Christie vµ céng sù, 1988) [38]. M«i tr-êng nu«i cÊy ®· ®-îc dïng cho nu«i cÊy t¹o chåi in vitro c©y l¸ kim cã thÓ kÓ tíi lµ: SH (1972); WPM (1981); GD (1972); MCM (1983); SH (1972)…c¸c m«i tr­êng SH; GD; WPM; LPm … c¶i tiÕn vµ thÊy phÇn lín c¸c m«i tr-êng t¹o chåi tèt h¬n so víi m«i tr-êng MS (1962), chåi xuÊt hiÖn víi tÇn sè lín h¬n nhiÒu [26]. C¸c m«i tr-êng nu«i cÊy nãi trªn ®Òu chøa ®ñ c¸c nguyªn tè ®a l-îng vµ vi l-îng nh-ng sai kh¸c vÒ hµm l-îng kh¸ lín. - 15 - Thorpe vµ Harry (1991) ®· nghiªn cøu nu«i cÊy th«ng Pinus canariensis víi nguån vËt liÖu sö dông chñ yÕu tõ l¸ mÇm cña c©y con míi n¶y mÇm v« trïng, t¸c gi¶ sö dông hai lo¹i m«i tr-êng nu«i cÊy chÝnh lµ m«i tr-êng SH (1972); m«i tr-êng MCM (1983) cã bæ sung 5-10 M BAP. Nghiªn cøu ®· x¸c ®Þnh ®-îc m«i tr-êng MCM víi nång ®é BAP tèi -u trong giai ®o¹n t¸i sinh chåi lµ 10 M, x¸c ®Þnh ®-îc tæ hîp phytohormon lµ BAP/2 iP (tû lÖ 1:1) lµ 5/5 M cho kÕt qu¶ t¸i sinh chåi tèt h¬n m«i tr-êng chØ cã BAP; x¸c ®Þnh ®-îc gi¸ thÓ ra rÔ lµ hçn hîp v« trïng than bïn/vermiculate (tû lÖ 1:1) chøa 1/4 kho¸ng MCM, xö lý chåi ra rÔ b»ng IBA 1 M trong 4 giê. KÕt qu¶ ®· ®-a c©y in vitro vµo gi¸ thÓ trong bÇu PVC ë ®iÒu kiÖn nhµ kÝnh [42]. Shakya, Joshee vµ Agrawal (1989) ®· thµnh c«ng trong nghiªn cøu nh©n gièng th«ng P. wallichiana b»ng kü thuËt nu«i cÊy ph«i cã ®Þnh h-íng. VËt liÖu nu«i cÊy lµ ph«i ®-îc t¸ch ra tõ h¹t th«ng P. wallichiana (cßn gäi th«ng xanh hay th«ng Bhutan). Ph«i t¸ch ra ®-îc nu«i cÊy trªn m«i tr-êng Aiken - Christie (LP1984) bæ sung BAP ë c¸c nång ®é tõ 0 - 88 M trong 10; 14; 21 ngµy. KÕt qu¶ ®¹t Ýt nhÊt 40 chåi/ph«i trong 1 chu kú cÊy chuyÓn 4 th¸ng [40]. N¨m 1995, Okamura M. vµ Kondo T. c«ng bè “H­íng dÉn nu«i cÊy m« c©y th«ng” giíi thiÖu t¹o c©y con th«ng Pinus thunbergi trong èng nghiÖm tõ nu«i cÊy ph«i vµ l¸ mÇm. Trong h-íng dÉn nµy dïng m«i tr-êng GD (1972) vµ m«i tr-êng AE ®Ó nu«i cÊy giai ®o¹n nh©n chåi. Giai ®o¹n nu«i cÊy ban ®Çu bæ sung 5 - 10 M BAP vµ 3 % ®-êng. Giai ®o¹n ra rÔ dïng m«i tr-êng Risser and White cã bæ sung 10 M IBA vµ ®· t¹o thµnh c«ng c©y con trong èng nghiÖm nh-ng kh«ng thÊy c«ng bè sè l-îng vµ c¸c kÕt qu¶ thÝ nghiÖm [37]. Nu«i cÊy m« c©y l¸ kim cã nhiÒu khã kh¨n, ®Æc biÖt lµ ®èi víi c¸c lo¹i c©y nh- th«ng. C¸c th«ng tin vÒ mÉu nu«i cÊy, m«i tr-êng dinh d-ìng kho¸ng vµ sö dông chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng cho c¸c loµi c©y l¸ kim nãi chung vµ loµi th«ng nãi riªng ®-îc kª trong biÓu 1.1 [26]: BiÓu 1.1: Th«ng tin vÒ nu«i cÊy in vitro c¸c loµi c©y l¸ kim - 16 - M«i nu«i M«i tr-êng tr-êng kÝch thÝch h×nh nh©n chåi thµnh chåi Loµi c©y MÉu cÊy Piece abies Ph«i h¹t giµ M«i tr-êng kÐo dµi Nguån tham kh¶o chåi 1/2SH-1972 + 1/2SH-1972 1.1 mg/lBAP Von Arnold vµ Eriksson (1987) Von Arnold (1987) Piece glauca Trô d-íi l¸ LPm-1981 + 2.2 LPm-1981 mÇm mg/lBAP Ellis vµ c¸c céng sù (1991) Piece glauca Trô d-íi l¸ CD-1975 +2.25 CD-1975 mÇm mg/lBAP Campbell (1975) Piece ormorika Chåi vµ l¸ LPm-1981 + 1.0 LPm-1981 mÇm c©y mg/lBAP Budimir (1992) vµ vµ Durzan Vujieie con Pinus briata Ph«i h¹t vµ SH mod.- 1981 SH mod.- 1981 l¸ mÇm + 3.0 mg/lBAP Abdullah vµ c¸c céng sù (1981) Pinus canariensis Ph«i míi mÇm Martinez Pulido vµ c¸c céng sù (1991-1992) Pinus caribeae Ph«i h¹t h¹t MCM-1983 + 1/2David n¶y 2.2 mg/lBAP 1982a Cheng- 1/2David + 0.05%AC Cheng-1977;1978 1977;1978 + 2 mg/lBAP Halos vµ Go (1993); Go vµ c¸c céng sù (1993) Pinus contorta l¸ mÇm vµ 1/2LPm-1981 + 1/2LPmtrô d-íi l¸ 2.25 mg/lBAP 1981 mÇm c©y non 1/4LPm1981; 1/8LPm1981 Patel vµ Thorpe (1984) Pinus elliotii l¸ mÇm tõ GD-1975 + 10 GD-1975 ph«i mg/lBAP + 0.01 1/2GD1975 Lesney vµ c¸c céng sù (1988) mg/lNAA Pinus virginiana l¸ mÇm tõ GD mod.-1981 SH-1972 SH- 1972 h¹t ®· n¶y + 10 mg/lBAP + 4 mÇm mg/lBAP Lopez Petalta vµ c¸c céng sù (1991) - 17 - S¬ ®å nu«i cÊy in vitro c©y l¸ kim tõ c¸c mÉu cÊy cã thÓ tãm t¾t [26]: Sự phát sinh phôi T¹o chåi trùc tiÕp Phôi C©y mÇm Callus phôi hoá Phôi vô tính L¸ mÇm Chåi bÊt ®Þnh Trô d-íi l¸ mÇm T¹o chåi trùc tiÕp - Chåi n¸ch - Bã l¸ kim Chåi sinh tr-ëng vµ v-¬n dµi Cây con in vitro Cây con in vitro Chåi n¸ch Trªn c¬ së cã m«i tr-êng dinh d-ìng kho¸ng víi thµnh phÇn vµ hµm l-îng t-¬ng ®èi thÝch hîp th× ®iÒu quan träng nhÊt cßn l¹i lµ vÊn ®Ò sö dông chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng (cßn gäi lµ phytohormone hay hormon). BiÓu 1.1 cho thÊy trong nu«i cÊy in vitro c©y th«ng, ®Ó kÝch thÝch h×nh thµnh chåi th-êng ®ßi hái hµm l-îng chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng t-¬ng ®èi thÊp. PhÇn lín c¸c m«i tr-êng h×nh thµnh vµ v-¬n chåi kh«ng cÇn sö dông phytohormon. Tuy nhiªn nhiÒu t¸c gi¶ cho r»ng cho thªm mét sè chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng víi liÒu l-îng thÝch hîp lµ cÇn thiÕt. Cã nghiªn cøu ®· dïng BAP ®Õn nång ®é 2 – 10 mg/l. Qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu thµnh c«ng víi h¬n 30 loµi c©y l¸ kim cña c¸c t¸c gi¶ trªn thÕ giíi, nhËn thÊy r»ng BAP 2 mg/l – 2.25 mg/l lµ rÊt thÝch hîp cho sù ph©n ho¸ t¹o chåi, kÝch thÝch ph©n ho¸ t¹o chåi tõ ph«i v« tÝnh b»ng BAP sÏ t-¬ng ®èi cã hiÖu qu¶. Nh©n gièng b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro víi th«ng, mÆc dï c¸c loµi cã ®ßi hái gÇn gièng nhau ®èi víi m«i tr-êng nu«i cÊy nh-ng do mçi ®Æc ®iÓm - 18 - riªng cña mçi loµi mµ vÉn cã thÓ yªu cÇu nh÷ng xö lý, ®iÒu chØnh c¸ biÖt kh¸c nhau. T¸c dông dÉn d¾t ph©n ho¸ t¹o chåi cña c¸c cytokinin kh¸c nhau kh«ng gièng nhau hoÆc còng cã thÓ gièng nhau, trong biÓu cã thÓ thÊy t¸c dông cña BAP râ h¬n Kinetin. Trong sù phèi hîp gi÷a cytokinin vµ auxin, th-êng thÊy sö dông BAP phèi hîp víi NAA h¬n lµ víi IAA vµ IBA. Trong viÖc dÉn d¾t h×nh thµnh rÔ, c¸c nghiªn cøu cã nhËn xÐt kh¸ thèng nhÊt víi nhau vµ phÇn lín ®Òu chän dïng IBA, tuy nhiªn vÒ chän chÊt auxin nµo vµ vÒ liÒu l-îng th× cßn cÇn ph¶i thö nghiÖm cho phï hîp víi mçi loµi. Trong c¸c m«i tr-êng nu«i cÊy bæ sung thªm cytokinin (th-êng sö dông BAP), ®«i khi kÕt hîp víi mét auxin ë mét nång ®é nhÊt ®Þnh. Chåi th«ng sau ®ã ®-îc ra rÔ trªn m«i tr-êng chøa IBA [26]. M«i tr-êng nu«i cÊy c¸c loµi th«ng th-êng ®-îc bæ sung thªm vitamin vµ c¸c acid amin…C¸c chÊt nµy ®Òu cã ¶nh h­ëng tèt ®èi víi sù ph©n ho¸ t¹o chåi vµ h×nh thµnh ph«i v« tÝnh. Nh÷ng chÊt nµy cã thÓ cã t¸c dông n©ng cao tû lÖ h×nh thµnh chåi, ®Èy nhanh tèc ®é ph¸t triÓn cña chåi. Trong nu«i cÊy in vitro thùc vËt nãi chung vµ th«ng nãi riªng m«i tr-êng nu«i cÊy cã hµm l-îng ®-êng kh¸c nhau sÏ cã hiÖu qu¶ kh¸c nhau. Nång dé thÊp ¶nh h-ëng ®Õn nguån cung cÊp Hidratcarbon sÏ kh«ng cã lîi cho sinh tr-ëng cña chåi. Nång ®é qu¸ cao lµm ¶nh h-ëng ®Õn ¸p suÊt thÈm thÊu vµ sÏ kh«ng cã lîi cho qu¸ tr×nh hÊp thô vµ vËn chuyÓn c¸c chÊt. C¸c nghiªn cøu nu«i cÊy t¹o chåi c©y th«ng th-êng chän dïng nång ®é 2-3 %, phÇn lín dïng ®-êng sacaroza. 1.4. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ nh©n gièng c©y th©n gç vµ c©y th«ng b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro ë ViÖt Nam Sau khi mét sè gièng B¹ch ®µn cã n¨ng suÊt cao ®-îc nhËp, c¸c dßng v« tÝnh B¹ch ®µn vµ Keo lai cã n¨ng suÊt cao ra ®êi, nu«i cÊy m« vµ gi©m hom ®· trë thµnh mét phong trµo nh©n gièng ®-îc ¸p dông r«ng r·i trong s¶n xuÊt l©m nghiÖp. - 19 - Nh÷ng c¬ së hiÖn ®ang nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« ë quy m« lín trong l©m nghiÖp n-íc ta lµ ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liªô giÊy Phï Ninh, Trung T©m khoa häc s¶n xuÊt l©m nghiÖp Qu¶ng Ninh, XÝ nghiÖp gièng thµnh phè Hå ChÝ Minh, Tr-êng §¹i häc L©m nghiÖp. Trong khi n¨ng suÊt rõng tù nhiªn cöa ta chØ ®¹t 2 - 6 m3/ha/n¨m, n¨ng suÊt rõng trång qu¶ng canh ®-îc trång b»ng c©y h¹t còng chØ ®¹t 5 - 7 m3/ha/n¨m, th× n¨ng suÊt rõng trång cña mét sè gièng B¹ch ®µn míi chän t¹o hoÆc míi nhËp ®-îc trång b»ng c©y m« vµ c©y hom cã thÓ ®¹t 15 m3/ha/n¨m, cßn n¨ng suÊt gièng Keo lai ®-îc trång b»ng c©y m« vµ c©y hom ë mét sè n¬i còng cã thÓ ®¹t 20 -30 m3/ha/n¨m [13]. Cïng víi nh÷ng kÕt qu¶ vÒ c¶i thiÖn gièng Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng ®· nghiªn cøu thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy m« cho Keo lai, B¹ch ®µn vµ mét sè gièng c©y rõng kh¸c [13]. Nghiªn cøu nu«i cÊy m« cho gièng lai gi÷a Bach ®µn liÔu vµ B¹ch ®µn tr¾ng ®· ®-îc NguyÔn Ngäc T©n vµ céng sù (1977) thùc hiÖn thµnh c«ng tõ n¨m 1993 vµ thÊy r»ng khi dïng BAP bæ sung vµo m«i tr-êng c¬ b¶n MS cã thÓ t¹o ®-îc 20 -30 chåi/côm. M«i tr-êng MS bæ sung IBA cã thÓ ®¹t tû lÖ ra rÔ 80% [11]. Nghiªn cøu nu«i cÊy m« cho gièng B¹ch ®µn lai U29C3 do §oµn ThÞ Mai vµ céng sù (2000) tiÕn hµnh vµ ®· thu ®-îc c©y m« tõ tæ hîp lai nµy ®Ó kh¶o nghiÖm. KÕt qu¶ cho thÊy thêi kú mÉu bÞ nhiÔm Ýt nhÊt vµ cã tû lÖ bËt chåi cao nhÊt lµ tõ th¸ng N¨m ®Õn th¸ng T¸m. M«i tr-êng MS bæ sung 0,5 mg/l BAP cho sè chåi trung b×nh trong mçi côm cao nhÊt (16.6 chåi/côm). M«i tr-êng ra rÔ thÝch hîp lµ m«i tr-êng MS bæ sung 1,0 mg/l IBA, cho tû lÖ ra rÔ tíi 83,8% [11]. D-¬ng Méng Hïng (1993) nghiªn cøu nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« cho hai loµi b¹ch ®µn Eucalyptus camaldulensis vµ Eucalyptus urophylla tõ c©y tréi cña 2 loµi. KÕt qu¶ ®· t¹o ®-îc mét sè c©y m« b¹ch ®µn, tuy nhiªn tû lÖ mÉu nhiÔm nÊm bÖnh khi ®-a mÉu vµo m«i tr-êng v« trïng cßn cao, hÖ sè nh©n chåi thÊp (1 – 2 lÇn) [7]. - 20 - Nu«i cÊy m« cho L¸t hoa (Chukrasia tabularis) ®· ®-îc thùc hiÖn cho chåi lÊy tõ c©y 2 tuæi. Giai ®o¹n nh©n chåi dïng m«i tr-êng MS cã 1,0 – 1,5 mg/l BAP ®¹t 10 chåi/côm. Giai ®o¹n ra rÔ dïng m«i tr-êng MS bæ sung 0,1 mg/l IBA hoÆc 0,1 mg/l IBA phèi hîp víi 0,1 mg/l NAA cho tû lÖ ra rÔ ®Õn 87,5% [10]. Nu«i cÊy m«, tÕ bµo c©y th©n gç cã nhiÒu khã kh¨n, ®Æc biÖt lµ víi c¸c loµi c©y l¸ kim nh- c©y th«ng. ë n-íc ta, kü thuËt nu«i cÊy m«, tÕ bµo cho c©y th©n gç míi ë thêi kú cña nh÷ng b-íc ®i ban ®Çu vµ øng dông vµo s¶n xuÊt quy m« lín chñ yÕu cho loµi b¹ch ®µn vµ ®Õn nay c¸c c«ng tr×nh ®· ®-îc c«ng bè ch-a nhiÒu. N¨m 2003, TrÇn Trung HiÕu, NguyÔn Xu©n Th-¬ng vµ c¸c céng sù c«ng bè kÕt qu¶ b-íc ®Çu nh©n nhanh gièng th«ng caribª (Pinus caribaea) b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. KÕt qu¶ ®· t×m ra m«i tr-êng nh©n chåi, ra rÔ vµ t¹o ®-îc c©y con cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ngoµi v-ên -¬m [6]. C¸c t¸c gi¶ sö dông mÉu cÊy lµ ®o¹n chåi non ®Çu cµnh cña c©y 3-5 tuæi do Trung t©m s¶n xuÊt L©m nghiÖp §«ng Nam Bé Thèng NhÊt - §ång Nai (ViÖn Khoa häc L©m nghiÖp) cung cÊp. M«i tr-êng nu«i cÊy c¬ b¶n lµ m«i tr-êng SH (1973), Litvay (1981) vµ c¸c m«i tr-êng kho¸ng ®a l-îng gi¶m ®i mét nöa lµ SH-1/2 vµ LV-1/2. §Ó t¹o côm chåi, t¨ng tr-ëng chåi vµ ra rÔ, c¸c t¸c gi¶ ®· dïng chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng lµ BAP, NAA, IBA. KÕt qu¶ sau 6 tuÇn nu«i cÊy, sè chåi thu ®-îc cao nhÊt trªn m«i tr-êng SH7 (cã bæ sung 3 mg/l BAP; 0.5 mg/l IBA) lµ 6,17  1,13 chåi/mÉu; trªn m«i tr-êng SH16 (cã 0,1 mg/l BAP; 0,1 mg/l IBA) cho chiÒu cao chåi cao nhÊt lµ 3,41  0,51 cm; sau 9 tuÇn nu«i cÊy trªn m«i tr-êng t¹o rÔ SH -1/2, chåi t¹o 3 rÔ/chåi vµ rÔ dµi nhÊt lµ 3 cm, sau 12 tuÇn nu«i cÊy c©y con cã thÓ ph¸t triÓn ngoµi v-ên -¬m. C«ng bè trªn kh«ng cho biÕt tû lÖ t¹o rÔ cña chåi in vitro vµ tû lÖ c©y sèng sau khi ®-a ra ®iÒu kiÖn ngoµi. Cuèi n¨m 2002 nh÷ng nghiªn cøu b-íc ®Çu vÒ nu«i cÊy m« c©y Th«ng caribª vµ Th«ng lai ®· ®-îc tiÕn hµnh t¹i Trung t©m nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy. KÕt qu¶ ®· x¸c ®Þnh ®-îc ph-¬ng ph¸p khö trïng mÉu cho tû lÖ mÉu sèng vµ s¹ch lµ 10,1% (khö trïng b»ng H2O2 5% trong 20 phót), ®· thö nghiÖm vµ x¸c ®Þnh
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan