Tài liệu Nghiên cứu nhân giống một số dòng tếch (tectona grandis linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Bé n«ng nghiÖp vµ PTNT Tr-êng ®¹i häc l©m nghiÖp NguyÔn thÞ thuú D-¬ng Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng tÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc L©m nghiÖp Hà T©y 2007 Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Bé n«ng nghiÖp vµ PTNT Tr-êng ®¹i häc l©m nghiÖp NguyÔn thÞ thuú D-¬ng Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng tÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro Chuyªn ngµnh: L©m häc M· sè: 60.62.60 LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc L©m nghiÖp Ng-êi h-íng dÉn : T.S Hµ huy thÞnh Hà T©y 2007 Lêi nãi ®Çu N©ng cao chÊt l-îng ®µo t¹o b»ng nghiªn cøu khoa häc lµ môc tiªu quan träng trong viÖc ®µo t¹o cao häc cña Tr-êng ®¹i häc L©m nghiÖp. §Ó hoµn thµnh ch-¬ng tr×nh ®µo t¹o Cao häc L©m nghiÖp kho¸ häc 2005- 2007, ®-îc sù ®ång ý cña Khoa sau ®¹i häc - Tr-êng §¹i häc L©m nghiÖp, t«i thùc hiÖn ®Ò tµi tèt nghiÖp: "Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng TÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro”. §-îc sù nhÊt trÝ cña Ban l·nh ®¹o Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng, ®Ò tµi ®-îc thùc hiÖn t¹i phßng nghiªn cøu nu«i cÊy m« - Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. §Ó ®¹t ®-îc kÕt qu¶ trong häc tËp vµ hoµn thµnh luËn v¨n tèt nghiÖp nµy, t¸c gi¶ ®· nhËn ®-îc sù quan t©m vµ gióp ®ì tËn t×nh vÒ nhiÒu mÆt cña Tr-êng ®¹i häc L©m nghiÖp, ®Æc biÖt lµ Khoa sau ®¹i häc, cïng tÊt c¶ c¸c thÇy c« gi¸o trùc tiÕp gi¶ng d¹y, còng nh- l·nh ®¹o Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. Cho phÐp t«i ®-îc bµy tá lßng biÕt ¬n ch©n thµnh ®Õn c¸c thÇy, c« gi¸o, ®Æc biÖt lµ T.S Hµ Huy ThÞnh vµ Th.S §oµn ThÞ Mai, toµn thÓ c¸n bé c«ng nh©n viªn t¹i trung t©m ®· tËn t×nh h-íng dÉn, chØ b¶o gióp ®ì t«i hoµn thµnh b¶n luËn v¨n nµy. Trong b¶n luËn v¨n nµy kh«ng thÓ tr¸nh khái nh÷ng khiÕm khuyÕt, rÊt mong ®-îc sù chØ b¶o bæ sung ý kiÕn cña c¸c nhµ khoa häc, c¸c b¹n ®ång nghiÖp ®Ó c«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®-îc hoµn thiÖn. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n! Hµ T©y, Ngµy 25/09/2007 T¸c gi¶ 1 §Æt vÊn ®Ò Theo quyÕt ®Þnh cña thñ t-íng chÝnh phñ (Q§ sè 17/2006/N§-TTg), ®Õn n¨m 2020 chóng ta ph¶i t¹o ra c¸c gièng c©y trång, vËt nu«i… cã n¨ng suÊt cao, chÊt l-îng vµ hiÖu qu¶ kinh tÕ cao phôc vô tèt nhu cÇu chuyÓn ®æi c¬ cÊu kinh tÕ trong lÜnh vùc N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn n«ng th«n. Mét trong nh÷ng nhiÖm vô cña ngµnh L©m nghiÖp lµ “ph¸t triÓn vi nh©n gièng vµ ®¸p øng ®ñ nhu cÇu vÒ gièng c©y L©m nghiÖp vµo n¨m 2015” [16]. TÕch lµ loµi sinh tr-ëng nhanh cã biªn ®é sinh th¸i réng h¬n n÷a gç TÕch ®-îc sö dông phæ biÕn trong x©y dùng vµ lµm ®å gç gia dông v× cã kh¶ n¨ng chèng mèi mät, chÞu n-íc l©u ngµy, mÆt gç cã ®é bãng cao. Trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn gç: TÕch lµ loµi c©y cã chÊt l-îng gç mÞn cã thÓ bãc t¸ch thµnh tÊm máng. Do gç TÕch cã tû träng nhÑ, Ýt bÞ hµ b¸m, chÞu va ®Ëp vµ ng©m n-íc mÆn nªn ®-îc dïng trong c«ng nghiÖp ®ãng tµu. MÆt kh¸c, nhu cÇu th-¬ng m¹i cña gç TÕch ngµy cµng t¨ng bëi nã cã thÓ thay thÕ mét sè loµi gç quý kh¸c[42]. C©y TÕch ®-îc trång th¨m dß ë n-íc ta vµo kho¶ng nh÷ng n¨m 30 cña thÕ kû 20. Lóc ®Çu, c©y TÕch ®-îc trång thö ë c«ng viªn hoÆc trªn ®-êng phè t¹i nhiÒu tØnh nh-: Hµ Giang, Tuyªn Quang, S¬n La, Lai Ch©u, Hµ Néi, §¾c L¾c, §ång Nai, T©y Ninh, Sµi Gßn… Còng trong thêi gian nµy chØ riªng ë Léc Ninh, TØnh B×nh Ph-íc ®· g©y trång TÕch thµnh nh÷ng khu rõng nhá. Vµo nh÷ng n¨m 60, víi nguån gièng thu h¸i tõ Léc Ninh ®· trång thµnh c«ng mét khu rõng TÕch 200 ha t¹i §Þnh Qu¸n, tØnh §ång Nai vµ mét khu rõng TÕch 5 ha t¹i Eak – Mat, tØnh §¾c L¾c. Sau n¨m 1975, c©y TÕch ®-îc trång më réng ë nhiÒu l©m tr-êng trong c¸c tØnh miÒn §«ng Nam Bé vµ T©y Nguyªn nh-: §ång Nai, B×nh Ph-íc, T©y Ninh, §¾c L¾c, Gia Lai, Kom Tum…Nh­ng do ch­a cã gièng ®­îc c¶i thiÖn nªn chÊt l­îng rõng kh«ng cao, n¨ng suÊt rõng trång TÕch ë n-íc ta cßn thÊp (9 – 12m3/ n¨m) [17]. HiÖn nay, diÖn tÝch rõng TÕch trång míi cña c¸c n-íc trªn thÕ giíi mçi n¨m t¨ng nhanh, nhiÒu nhÊt lµ ë Indonesia kho¶ng 1.760 ngh×n ha, Ên §é kho¶ng 2.450 ngh×n ha, Myanmar lµ 139 ngh×n ha, Malaysia kho¶ng 4 ngh×n ha, Th¸i Lan lµ 2 836 ngh×n ha [29]. ë ViÖt Nam, diÖn tÝch trång TÕch chØ ®¹t 1.500 ha, rÊt Ýt so víi c¸c n-íc trong khu vùc do nhiÒu nguyªn nh©n kh¸c nhau mµ thiÕu gièng ®-îc c¶i thiÖn lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n quan träng. ChÝnh v× thÕ c«ng t¸c chän t¹o vµ nh©n gièng mét sè dßng tÕch cã n¨ng suÊt cao lµ vÊn ®Ò cÇn thiÕt. HiÖn nay, c©y gièng s¶n xuÊt tõ h¹t ®-îc sö dông phæ biÕn nh-ng kh«ng ®¸p øng ®-îc nhu cÇu trång rõng do kh«ng cã rõng gièng chuyªn canh, h¹t gièng thu h¸i x« bå nªn phÈm chÊt h¹t kÐm. H¬n n÷a c¸ch nh©n gièng nµy cßn g©y ra hiÖn t-îng ph©n ly tÝnh tr¹ng v× thô phÊn tù do lµm cho c©y trång kh«ng ®ång ®Òu dÉn ®Õn n¨ng suÊt rõng biÕn ®éng. Mét khã kh¨n n÷a lµ n¨ng suÊt h¹t trªn mét c©y còng rÊt thÊp (1 ha rõng 15 tuæi chØ cho kho¶ng 50 kg h¹t). Kh«ng nh÷ng thÕ, h¹t TÕch trong tù nhiªn cã kh¶ n¨ng n¶y mÇm thÊp, trong v-ên -¬m tû lÖ n¶y mÇm còng kh«ng cao, chØ ®¹t kho¶ng 5-10% [28] [42]. §Ó kh¾c phôc nh÷ng nh-îc ®iÓm trªn th× gi¶i ph¸p nh©n gièng sinh d-ìng ngµy cµng ®-îc quan t©m. Tuy nhiªn ®èi víi loµi TÕch th× ph-¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh b»ng hom còng gÆp nhiÒu khã kh¨n do tû lÖ ra rÔ kh«ng cao chØ ®¹t kho¶ng 24-30% [3]. ChÝnh v× nh÷ng lý do trªn nªn gi¶i ph¸p nh©n gièng sinh d-ìng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo ®ang ®-îc quan t©m nghiªn cøu. Nh©n gièng b»ng kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo, cßn gäi lµ nh©n gièng in vitro, lµ ph-¬ng ph¸p s¶n xuÊt c©y con tõ chåi v-ît cña c©y mÑ b»ng c¸ch nu«i cÊy chóng trong èng nghiÖm, ë ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi víi m«i tr-êng thÝch hîp vµ cã thÓ kiÓm so¸t trong ®iÒu kiÖn hoµn c¶nh ®ång nhÊt. Nu«i cÊy m« tÕ bµo cã thÓ nh©n nhanh víi sè l-îng c©y con lín trong mét kho¶ng thêi gian ng¾n, ®-îc tiÕn hµnh trong ®iÒu kiÖn phßng thÝ nghiÖm nªn hoµn toµn chñ ®éng trong s¶n xuÊt. Ngoµi ra, kü thuËt nµy cßn gióp chóng ta cã thÓ t¹o ra gièng míi, t¹o nguån c©y s¹ch bÖnh, t¹o ra c©y con cã ®é ®ång ®Òu cao vµ duy tr× ®-îc nh÷ng ®Æc tÝnh tèt nhÊt cña c©y mÑ. Tõ nh÷ng lý do trªn ®Ò tµi “Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng TÕch b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro” ®­îc tiÕn hµnh. §©y lµ mét néi dung trong ®Ò tµi cÊp bé “Nghiªn cøu tuyÓn chän vµ nh©n gièng Xoan ta vµ TÕch cã n¨ng suÊt cao”. 3 Ch-¬ng 1 Tæng quan vÊn ®Ò nghiªn cøu 1.1. Kh¸i niÖm vµ c¬ së khoa häc cña ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt 1.1.1. Kh¸i niÖm Nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt hay cßn gäi lµ vi nh©n gièng lµ ph-¬ng ph¸p s¶n xuÊt hµng lo¹t c©y con tõ chåi non cña c©y (c¬ quan, m« tÕ bµo) b»ng c¸ch nu«i cÊy chóng trong èng nghiÖm ë c¸c ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi víi m«i tr-êng thÝch hîp vµ ®-îc kiÓm so¸t. ThuËt ng÷ “nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt” hay “nu«i cÊy in vitro” lµ ph¹m trï kh¸i niÖm chØ tÊt c¶ c¸c lo¹i nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ë ®iÒu kiÖn v« trïng, bao gåm:  Nu«i cÊy c©y: nu«i cÊy thùc vËt.  Nu«i cÊy c¸c bé phËn ®· ®-îc t¸ch khái thùc c¬ thÓ thùc vËt: nu«i cÊy c¬ quan  Nu«i cÊy c¸c ph«i thµnh thôc hay ch-a thµnh thôc ®· ®-îc t¸ch khái c¬ thÓ thùc vËt: nu«i cÊy ph«i.  Nu«i cÊy m« b¾t nguån tõ c¬ quan thùc vËt: nu«i cÊy m« hay nu«i cÊy m« sÑo.  Nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n lÎ hay c¸c côm tÕ bµo rÊt nhá trong m«i tr-êng láng.  Nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt sau khi ®· t¸ch bá vá tÕ bµo, cßn gäi lµ nu«i cÊy tÕ bµo trÇn (protoplast) [14]. 1.1.2. C¬ së khoa häc cña cña nu«i cÊy m« tÕ bµo * TÝnh toµn n¨ng (totipotence) N¨m 1902 lÇn ®Çu tiªn nhµ thùc vËt häc ng-êi §øc Haberlandt ®· ®-a ra quan niÖm: “Mçi tÕ bµo bÊt kú (®· biÖt ho¸) lÊy tõ mét c¬ thÓ thùc vËt ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh”. Theo 4 quan niÖm cña sinh häc hiÖn ®¹i th× mçi tÕ bµo riªng rÏ ®· biÖt ho¸ ®Òu chøa toµn bé th«ng tin di truyÒn (ADN) cÇn thiÕt cña c¬ thÓ ®ã, nÕu gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp th× mçi tÕ bµo ®Òu cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh, ®ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt. TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo chÝnh lµ c¬ së lý luËn cña nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËy. Cho ®Õn nay, con ng-êi ®· hoµn toµn chøng minh ®-îc kh¶ n¨ng t¸i sinh mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ. * Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo C¬ thÓ thùc vËt tr-ëng thµnh lµ mét chØnh thÓ thèng nhÊt bao gåm nhiÒu c¬ quan chøc n¨ng kh¸c nhau, trong ®ã cã nhiÒu lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau thùc hiÖn c¸c chøc n¨ng cô thÓ kh¸c nhau. Tuy nhiªn, tÊt c¶ c¸c lo¹i tÕ bµo ®ã ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo ph«i sinh. Sù ph©n ho¸ tÕ bµo lµ sù chuyÓn ho¸ c¸c tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo cña c¸c m« chuyªn ho¸ ®¶m nhËn c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau cña c¬ thÓ. Qu¸ tr×nh ph©n ho¸ cã thÓ biÓu thÞ nh- sau: Ph©n ho¸ TÕ bµo ph«i sinh TÕ bµo d·n TÕ bµo chuyªn ho¸ Ph¶n ph©n ho¸ S¬ ®å 1.1: Qu¸ tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo Qu¸ tr×nh nµy gåm cã c¸c giai ®o¹n - Sù ph©n chia tÕ bµo: Qu¸ tr×nh ph©n chia tÕ bµo x¶y ra trong m« ph©n sinh lµm cho sè l-îng tÕ bµo t¨ng lªn mét c¸ch ®¸ng kÓ. 5 - Sù d·n tÕ bµo: TÕ bµo d·n ra c¶ vÒ chiÒu ngang vµ chiÒu däc lµm t¨ng kÝch th-íc cña tõng c¬ quan nãi riªng vµ toµn bé c¬ thÓ nãi chung. Sau hai giai ®o¹n nµy cïng víi qu¸ tr×nh biÖt ho¸ tÕ bµo ph©n ho¸ thµnh c¸c m« cã chøc n¨ng riªng biÖt, ®¶m nhËn c¸c vai trß kh¸c nhau trong cïng mét c¬ thÓ sèng. Tuy nhiªn, khi tÕ bµo ph©n ho¸ thµnh c¸c m« chøc n¨ng th× chóng kh«ng hoµn toµn mÊt ®i kh¶ n¨ng ph©n chia cña m×nh. Trong mét ®iÒu kiÖn nhÊt ®Þnh nµo ®ã c¸c tÕ bµo nµy l¹i cã thÓ trë thµnh d¹ng tÕ bµo ph«i sinh vµ tiÕp tôc qu¸ tr×nh ph©n chia cho ra c¸c tÕ bµo míi cã kh¶ n¨ng t¸i sinh thµnh c©y hoµn chØnh. §©y chÝnh lµ qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo. VÒ b¶n chÊt th× sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ lµ mét qu¸ tr×nh ®iÒu hoµ ho¹t ho¸ gen. T¹i mét thêi ®iÓm nµo ®ã trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn c¸ thÓ, cã mét sè gen bÞ øc chÕ ®-îc ho¹t ho¸ trë l¹i ®Ó t¹o ra tÝnh tr¹ng míi, mét sè gen kh¸c l¹i bÞ ®×nh chØ ho¹t ®éng. §iÒu nµy x¶y ra theo mét ch-¬ng tr×nh ®· ®-îc m· ho¸ trong cÊu tróc ph©n tö ADN ë mçi tÕ bµo. MÆt kh¸c, khi tÕ bµo n»m trong mét khèi m« cña c¬ thÓ, nã th-êng bÞ øc chÕ bëi c¸c tÕ bµo ë xung quanh. Khi tÕ bµo ®-îc t¸ch riªng ra, gÆp ®iÒu kiÖn thuËn lîi th× c¸c gen ®-îc ho¹t ho¸, qu¸ tr×nh nµy sÏ diÔn biÕn theo mét ch-¬ng tr×nh ®· ®Þnh s½n trong bé gen ®ã. 1.2. C¸c giai ®o¹n chÝnh trong qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro 1.2.1. Giai ®o¹n chuÈn bÞ Môc ®Ých cña giai ®o¹n chuÈn bÞ nh»m t¹o ra nguån mÉu s¹ch ®Ó phôc vô cho c¸c b-íc tiÕp theo. Giai ®o¹n nµy coi nh- mét b-íc thuÇn ho¸ vËt liÖu ®Ó nu«i cÊy. C©y gièng ®-îc ®-a ra khái n¬i ph©n bè tù nhiªn ®Ó chóng thÝch øng víi m«i tr-êng míi, ®ång thêi gi¶m bít kh¶ n¨ng nhiÔm bÖnh cña cña mÉu nu«i cÊy vµ chñ ®éng trong c«ng t¸c nh©n gièng. Trong tr-êng hîp cÇn thiÕt cã thÓ lµm trÎ ho¸ vËt liÖu gièng. 6 1.2.2. Giai ®o¹n cÊy khëi ®éng Môc ®Ých cña giai ®o¹n nµy lµ t¹o ra c¸c chåi míi tõ c¸c m« nu«i cÊy. Khi ®· cã nguån nguyªn liÖu nu«i cÊy, tiÕn hµnh lÊy mÉu vµ xö lý trong nh÷ng ®iÒu kiÖn v« trïng. Ng-êi ta th-êng dïng mét sè ho¸ chÊt nh- HgCl 2, Ca(Ocl)2, H2O2… ®Ó khö trïng mÉu cÊy. Tuú thuéc vµo tõng lo¹i vËt liÖu mµ chän ho¸ chÊt, nång ®é vµ thêi gian khö trïng thÝch hîp. VÒ nguyªn t¾c, m« nu«i cÊy cã thÓ lµ bÊt kú bé phËn nµo cña c©y (th©n, rÔ, l¸, hoa qu¶) nh-ng theo Bhatt th× m« lÊy tõ c¸c phÇn non cña c©y cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy thµnh c«ng cao h¬n m« lÊy tõ c¸c bé phËn tr-ëng thµnh kh¸c [29]. V× vËy, ng-êi ta th-êng lÊy chåi ®Ønh hay chåi n¸ch ®Ó nu«i cÊy in vitro. Ngoµi ra, khi lùa chän m« nu«i cÊy cÇn chó ý tuæi sinh lý cña m« cµng thÊp th× ®é trÎ ho¸ cµng cao, nu«i cÊy dÔ thµnh c«ng. C¸c m« lÊy ë thêi kú sinh tr-ëng m¹nh cña c©y trong mïa sinh tr-ëng cho kh¶ n¨ng t¸i sinh tèt h¬n (Anolesnon 1980). §èi víi mÉu dÔ bÞ ho¸ n©u khi nu«i cÊy cã thÓ bæ sung than ho¹t tÝnh hoÆc Polyvinylpyrroline (PVP) vµo m«i tr-êng [8]. Giai ®o¹n nµy cÇn ®¶m b¶o c¸c yªu cÇu: tû lÖ m« nhiÔm thÊp, tû lÖ sèng cao, m« tån t¹i vµ sinh tr-ëng tèt. KÕt qu¶ cña giai ®o¹n nµy phô thuéc vµo viÖc chän bé phËn nu«i cÊy, cho nªn khi lÊy mÉu cÇn ®¶m b¶o c¸c nguyªn t¾c nªu trªn. Giai ®o¹n nµy th-êng kÐo dµi 4 – 6 tuÇn. 1.2.3. Giai ®o¹n nh©n nhanh Mét trong nh÷ng -u ®iÓm cña ph-¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro so víi c¸c ph-¬ng ph¸p nh©n gièng kh¸c lµ cã hÖ sè nh©n cao. V× vËy, cã thÓ coi ®©y lµ giai ®o¹n then chèt cña toµn bé qu¸ tr×nh nh©n gièng. HÖ sè nh©n ë giai ®o¹n nµy biÕn ®éng tõ 5 ®Õn 50 lÇn tuú thuéc vµo loµi c©y, m«i tr-êng vµ ph-¬ng ph¸p nh©n. §Ó t¹o hÖ sè nh©n cao cÇn lùa chän m«i tr-êng vµ ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh thÝch hîp. Trong giai ®o¹n nµy vai trß cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng (Auxin, Cytokinin) lµ cùc kú quan träng ®Ó s¶n sinh ra l-îng c©y con tèi ®a mµ vÉn ®¶m b¶o søc sèng vµ b¶n chÊt di truyÒn cña c©y. Theo 7 nguyªn t¾c chung th× trong m«i tr-êng cã nhiÒu Cytokinin sÏ kÝch thÝch t¹o chåi. ChÕ ®é nu«i cÊy th-êng lµ 25 – 27oC vµ 10 – 16 giê chiÕu s¸ng/ngµy, c-êng ®é ¸nh s¸ng 1000 – 3000lux. Yªu cÇu cña giai ®o¹n nµy lµ t¹o ra sè l-îng c©y con tèi ®a trong thêi gian ng¾n nh-ng vÉn ®¶m b¶o søc sèng vµ b¶n chÊt di truyÒn cña c©y. 1.2.4. T¹o c©y hoµn chØnh (cho ra rÔ) §©y lµ giai ®o¹n chuÈn bÞ cho c©y con chuyÓn ra ngoµi hÖ thèng v« trïng khi ®¹t ®-îc kÝch th-íc nhÊt ®Þnh, c¸c chåi ®-îc chuyÓn tõ m«i tr-êng ë giai ®o¹n 3 sang m«i tr-êng t¹o rÔ. Th-êng sau 2 – 3 tuÇn ë c¸c chåi nµy sÏ xuÊt hiÖn rÔ vµ trë thµnh c©y hoµn chØnh. M«i tr-êng t¹o rÔ ®-îc gi¶m l-îng Cytokinin vµ t¨ng l-îng Auxin ®Ó t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho sù ra rÔ cña chåi c©y. Ng-êi ta th-êng dïng c¸c chÊt NAA (Axit α-naphtyl axetic), IBA (Axit β-indol butyric) vµ IAA (Axit β-indol axetic) ë nång ®é 1mg/lÝt ®Õn 5 mg/lÝt ®Ó t¹o rÔ cho hÇu hÕt c¸c loµi c©y trång. Giai ®o¹n nµy th-êng kÐo dµi tõ 2 – 4 tuÇn lÔ, sau ®ã ®-îc chuyÓn sang m«i tr-êng kh«ng cã Auxin ®Ó rÔ ph¸t triÓn. ë giai ®o¹n nµy c©y con rÊt nh¹y c¶m víi Èm ®é vµ bÖnh tËt do ho¹t ®éng cña l¸ vµ rÔ míi ph¸t sinh rÊt yÕu, c©y ch-a chuyÓn sang giai ®o¹n tù d-ìng. 1.2.5. §-a c©y ra m«i tr-êng tù nhiªn §©y lµ giai ®o¹n chuyÓn dÇn c©y con tõ èng nghiÖm ra nhµ kÝnh råi ra ngoµi trêi. C©y m« ®-îc chuyÓn tõ m«i tr-êng dÞ d-ìng sang m«i tr-êng tù d-ìng nªn ph¶i tËp cho c©y quen dÇn víi m«i tr-êng tù nhiªn, tr¸nh sù thay ®æi ®ét ngét lµm c©y cã thÓ sèc hoÆc bÞ chÕt. Khi c©y con ®· cøng c¸p vµ ®¹t nh÷ng tiªu chuÈn nhÊt ®Þnh vÒ chiÒu cao, sè l¸ vµ sè rÔ th× ®-a ra ngoµi gi¸ thÓ. Gi¸ thÓ tiÕp nhËn c©y in vitro ph¶i ®¶m b¶o t¬i, xèp, tho¸ng n-íc vµ s¹ch bÖnh. Ph¶i gi÷ Èm cho c©y khi míi ®-a tõ b×nh nu«i ra, cÇn duy tr× ®é Èm trªn 50% ®Ó c©y con kh«ng mÊt n-íc vµ lµm giµn che ®Ó tr¸nh ¸nh s¸ng qu¸ m¹nh. Sau 2 – 3 tuÇn ®-a ra ngoµi c©y m« sÏ sinh tr-ëng æn ®Þnh, ch¨m sãc c©y m« t-¬ng tù chÕ ®é ch¨m sãc c©y hom hoÆc c©y tõ h¹t. 8 1.3. C¸c nh©n tè ¶nh h-ëng tíi qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro 1.3.1. M«i tr-êng nu«i cÊy Trong nu«i cÊy in vitro, m«i tr-êng nu«i cÊy vµ ®iÒu kiÖn bªn ngoµi ®-îc xem lµ vÊn ®Ò quyÕt ®Þnh sù thµnh b¹i cña qu¸ tr×nh nu«i cÊy. M«i tr-êng nu«i cÊy ®-îc xem lµ phÇn ®Öm ®Ó cung cÊp c¸c chÊt dinh d-ìng cÇn thiÕt cho sù t¨ng tr-ëng vµ ph©n ho¸ m« trong suèt qóa tr×nh nu«i cÊy in vitro. Cho ®Õn nay, ®· cã nhiÒu m«i tr-êng dinh d-ìng ®-îc t×m ra (MS – 62, WPM, SH…) tuú thuéc vµo ®èi t­îng vµ môc ®Ých nu«i cÊy. VÊn ®Ò lùa chän m«i tr-êng thÝch hîp cho c©y sinh tr-ëng vµ ph¸t triÓn tèi -u trong tõng giai ®o¹n cña nu«i cÊy in vitro lµ rÊt quan träng. M«i tr-êng nu«i cÊy cña hÇu hÕt c¸c loµi thùc vËt bao gåm c¸c muèi kho¸ng ®a l-îng, vi l-îng, nguån c¸c bon, c¸c axit amin vµ c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng (còng cã thÓ bæ sung thªm mét sè chÊt phô gia kh¸c nh­ than ho¹t tÝnh…) tuú vµo tõng loµi, gièng, nguån gèc mÉu cÊy, thËm chÝ tuú tõng c¬ quan kh¸c nhau trªn cïng c¬ thÓ mµ dinh d-ìng cÇn cho sù sinh tr-ëng tèi -u cña chóng kh¸c nhau. V× vËy, vÊn ®Ò cÇn lùa chän m«i tr-êng thÝch hîp cho sinh tr-ëng, ph¸t triÓn tèi -u cho tõng giai ®o¹n cña hÖ m« trong nu«i cÊy in vitro rÊt quan träng, sè l-îng vµ c¸c lo¹i ho¸ chÊt ph¶i cùc kú chÝnh x¸c phï hîp víi tõng ®èi t-îng cô thÓ. Tuy nhiªn, m«i tr-êng nu«i cÊy bao giê còng cã nh÷ng thµnh phÇn sau: + Nguån C¸cbon: Trong nu«i cÊy m«, c¸c tÕ bµo ch-a cã kh¶ n¨ng quang hîp ®Ó tæng hîp nªn chÊt h÷u c¬ nªn ng-êi ta ph¶i ®-a vµo m«i tr-êng mét l-îng hîp chÊt c¸cbon nhÊt ®Þnh ®Ó cung cÊp ®Ó cung cÊp n¨ng l-îng cho tÕ bµo vµ m« (Debengh – 1991). Nguån c¸cbon ë ®©y lµ c¸c lo¹i ®-êng kho¶ng 20 – 30mg/lÝt cã t¸c dông gióp m« tÕ bµo thùc vËt tæng hîp c¸c hîp chÊt h÷u c¬, gióp tÕ bµo t¨ng sinh khèi, ngoµi ra nã cßn ®ãng vai trß lµ chÊt thÈm thÊu chÝnh cña m«i tr-êng. Ng-êi ta th-êng sö dông 2 lo¹i ®-êng ®ã lµ Saccarose vµ Glucose [13]. 9 + Nguån Nit¬: Tû lÖ nguån Nit¬ tuú thuéc vµo loµi c©y vµ tr¹ng th¸i ph¸t triÓn cña m«. Th«ng th-êng, nguån nit¬ ®-îc ®-a vµo m«i tr-êng ë hai d¹ng lµ NH4+ (amoni) vµ NO3- (Nitrat). Trong ®ã, viÖc hÊp thô NO3- cña c¸c tÕ bµo thùc vËt tá ra cã hiÖu qu¶ h¬n so víi NH4+ . Nh-ng ®«i khi NO3- g©y ra hiÖn t­îng “kiÒm ho¸” m«i tr­êng v× vËy gi¶i ph¸p sö dông phèi hîp c¶ 2 nguån nit¬ víi tØ lÖ hîp lý ®-îc sö dông réng r·i nhÊt. + C¸c nguyªn tè ®a l-îng: lµ nh÷ng nguyªn tè kho¸ng nh-: N, P, K, S, Mg, Ca cÇn thiÕt vµ thay ®æi tuú ®èi t-îng nu«i cÊy. Nh×n chung, c¸c nguyªn tè nµy ®-îc sö dông ë nång ®é trªn 30ppm. C¸c nguyªn tè nµy cã chøc n¨ng cung cÊp nguyªn liÖu ®Ó m« hoÆc tÕ bµo thùc vËt x©y dùng thµnh phÇn cÊu tróc hoÆc gióp cho qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt gi÷a tÕ bµo thùc vËt víi m«i tr-êng ®-îc thuËn lîi. Cã nhiÒu m«i tr-êng víi thµnh phÇn, tØ lÖ c¸c chÊt kh¸c nhau, chóng ta cã thÓ lùa chän ®Ó sö dông. Nãi chung, m«i tr-êng giµu Nit¬ thÝch hîp cho viÖc h×nh thµnh chåi, cßn m«i tr-êng giµu Kali sÏ thóc ®Èy qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt m¹nh h¬n. Thµnh phÇn kho¸ng cña mét m«i tr-êng cÊy ®-îc x¸c ®Þnh do sù c©n b»ng nång ®é cña nh÷ng ion kh¸c nhau trong dung dÞch (nång ®é ion thÓ hiÖn b»ng mg/lÝt). ViÖc lùa chän thµnh phÇn vµ hµm l-îng kho¸ng cho mét ®èi t-îng nu«i cÊy lµ rÊt khã ®ßi hái ng-êi lµm c«ng t¸c nu«i cÊy m« ph¶i cã nh÷ng hiÓu biÕt c¬ b¶n vÒ sinh lý thùc vËt ®èi víi dinh d-ìng kho¸ng. + Nhãm c¸c nguyªn tè vi l­îng:Fe, Cu, Zn, Mg, Mo, B, Co, I … lµ c¸c nguyªn tè rÊt quan träng vµ kh«ng thÓ thiÕu cho sù ph¸t triÓn cña m« vµ tÕ bµo do chóng ®ãng vai trß quan träng trong c¸c ho¹t ®éng cña enzym. Chóng ®-îc dïng ë nång ®é thÊp h¬n nhiÒu so víi c¸c nguyªn tè ®a l-îng ®Ó ®¶m b¶o sinh tr-ëng vµ ph¸t triÓn b×nh th-êng cña c©y [25]. + C¸c Vitamin: MÆc dï c©y in vitro cã thÓ tù tæng hîp vitamin, nh-ng kh«ng ®ñ cho nhu cÇu (czocnowoki – 1952). Do ®ã, ®Ó c©y sinh tr-ëng tèi -u mét sè vitamin nhãm B ®-îc bæ sung vµo m«i tr-êng víi l-îng nhÊt ®Þnh tuú theo tõng hÖ m« vµ giai ®o¹n nu«i cÊy. C¸c vitamin B1 (Thiamin) vµ B6 10 (pyrodoxal) lµ nh÷ng vitamin c¬ b¶n nhÊt th-êng dïng trong m«i tr-êng nu«i cÊy víi nång ®é thÊp kho¶ng 0.1 – 1mg/lÝt [13]. + Dung dÞch h÷u c¬ cã thµnh phÇn kh«ng x¸c ®Þnh nh- n-íc dõa, dÞch chiÕt nÊm men… ®­îc bæ sung vµo m«i tr­êng cã t¸c dông kÝch thÝch sinh tr-ëng m« sÑo vµ c¸c c¬ quan. N-íc dõa ®· ®-îc sö dông vµo nu«i cÊy in vitro tõ n¨m 1941 vµ ®-îc øng dông kh¸ réng r·i trong c¸c m«i tr-êng nh©n nhanh in vitro. Trong n-íc dõa th-êng chøa c¸c axit amin, axit h÷u c¬, ®-êng, ARN vµ ADN. §Æc biÖt trong n-íc dõa cßn cã chøa nh÷ng hîp chÊt quan träng cho nu«i cÊy m« ®ã lµ Myo-inositol, c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh Auxin, c¸c Gluxit cña Cytokinin [25]. + ChÊt lµm ®«ng cøng m«i tr-êng: Agar (th¹ch) lµ mét lo¹i Polysacharid cña t¶o cã kh¶ n¨ng ngËm n-íc kh¸ cao 6-12g/lÝt. §é tho¸ng khÝ cña m«i tr-êng th¹ch cã ¶nh h-ëng râ rÖt ®Õn sinh tr-ëng m« nu«i cÊy. Nång ®é th¹ch dao ®éng trong kho¶ng 6 – 10mg/lÝt thuú theo môc tiªu nu«i cÊy. 1.3.2. C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng C¸c Phytohormon lµ nh÷ng chÊt cã t¸c dông ®iÒu hoµ sinh tr-ëng vµ ph¸t triÓn cña thùc vËt. Chóng ®ãng vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña thùc vËt nh­: ph©n chia, biÖt ho¸ tÕ bµo… Ngoµi ra, nã cßn ¶nh h-ëng ®Õn qu¸ tr×nh l·o ho¸ m« vµ nhiÒu qu¸ tr×nh kh¸c. C¸c Phytohormon cã thÓ chia thµnh 5 nhãm: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic Axit. Chóng lµ yÕu tè quan träng nhÊt trong m«i tr-êng quyÕt ®Þnh ®Õn sù thµnh c«ng cña kÕt qu¶ nu«i cÊy. + Auxin: Nhãm nµy gåm cã c¸c chÊt chÝnh lµ: IBA (3-Indol butyric axit), IAA (Indol acetic axit), NAA (Napthyl acetic axit), …Trong nu«i cÊy m« thùc vËt Auxin th-êng ®-îc sö dông ®Ó kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo, biÖt ho¸ rÔ, h×nh thµnh m« sÑo, k×m h·m sù ph¸t triÓn chåi vµ t¹o ra c¸c rÔ phô [25]. + Cytokinin: §-îc bæ xung vµo m«i tr-êng chñ yÕu ®Ó kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo vµ quyÕt ®Þnh sù ph©n ho¸ chåi bÊt ®Þnh tõ m« sÑo vµ c¬ 11 quan. C¸c hîp chÊt th-êng sö dông lµ: Kinetin (6-Furfuryl aminopurine – C10H9NO5), BAP (6-Benzyl amino purine) , Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin. Trong c¸c chÊt nµy th× Kinetin vµ BAP ®-îc sö dông phæ biÕn nhÊt v× chóng cã ho¹t tÝnh cao vµ gi¸ thµnh rÎ. Tuú vµo tõng hÖ m« vµ môc ®Ých nu«i cÊy mµ Cytokinin ®-îc sö dông ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. ë nång ®é thÊp (10-7-106 M) chóng cã t¸c dông kÝch thÝch sù ph©n bµo, ë nång ®é 10 -6-10-5M chóng kÝch thÝch sù ph©n ho¸ chåi. Trong nu«i cÊy m« ®Ó kÝch thÝch sù nh©n nhanh ng-êi ta th-êng xö dông Cytokinin víi nång ®é 10-6-10-4M [2]. + Gibberellin: Nhãm nµy cã kho¶ng 50 lo¹i hormone kh¸c nhau nh-ng quan träng nhÊt lµ GA3 (Gibberellic Axit 3). GA3 cã t¸c dông kÝch thÝch n¶y mÇm cña c¸c lo¹i h¹t kh¸c nhau, kÐo dµi c¸c lãng ®èt th©n cµnh. Bªn c¹nh ®ã GA3 cßn cã t¸c dông ph¸ ngñ c¸c ph«i, øc chÕ t¹o rÔ phô (Picrik-1987) còng nh- t¹o chåi phô (Street-1973) [43]. Ngoµi ra, nã cßn ¶nh h-ëng ®Õn sù ra hoa cña mét sè thùc vËt vµ cã t¸c dông rót ng¾n thêi gian sinh tr-ëng sinh d-ìng cña c©y. + Abscisic Axit (ABA): lµ chÊt øc chÕ sinh tr-ëng tù nhiªn nh-ng vÉn ®-îc dïng trong nu«i cÊy tÕ bµo in vitro. ABA cã ¶nh h-ëng ©m tÝnh ®Õn m« nu«i cÊy in vitro. Khi ABA t-¬ng t¸c víi BAP cho hÖ sè nh©n chåi cao h¬n khi dïng BAP riªng rÏ [2]. + Ethylen: Cã biÓu hiÖn t¸c ®éng hai chiÒu, nã k×m h·m sù h×nh thµnh chåi ë giai ®o¹n sím nh-ng l¹i kÝch thÝch sù ph¸t triÓn chåi ë giai ®o¹n muén. Trong mét sè tr-êng hîp, Ethylen cã t¸c dông kÝch thÝch h×nh thµnh rÔ nh-ng mét sè tr-êng hîp nã l¹i k×m h·m qu¸ tr×nh nµy [25]. Ngoµi ra, cÇn ph¶i chó ý tíi ®é pH cña m«i tr-êng vÝ nã ¶nh h-ëng kh¸ râ nÐt tíi kh¶ n¨ng hoµ tan c¸c chÊy kho¸ng trong m«i tr-êng, sù æn ®Þnh cña m«i tr-êng, kh¶ n¨ng hÊp thô chÊt dinh d-ìng cña c©y. NÕu pH thÊp (<4.5) hoÆc cao (>7.0) ®Òu g©y øc chÕ sinh tr-ëng, ph¸t triÓn cña c©y trong nu«i cÊy in vitro. Nªn viÖc x¸c ®Þnh ®-îc ®é pH ban ®Çu cña m«i tr-êng cho qu¸ tr×nh 12 sinh tr-ëng vµ ph¸t triÓn cña m« cÊy lµ cÇn thiÕt. §é pH th-êng ®-îc sö dông trong nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt nãi chung tõ 5,6 – 5,8. 1.3.3. M«i tr-êng vËt lý Trong nu«i cÊy in vitro c¸c yÕu tè cña m«i tr-êng vËt lý ®-îc quan t©m ®ã lµ ¸nh s¸ng, nhiÖt ®é vµ ®é Èm. + ¸nh s¸ng: §©y lµ yÕu tè cÇn thiÕt cho sù ph¸t triÓn vµ ph¸t sinh h×nh th¸i cña c¸c m« nu«i cÊy. ¸nh s¸ng cã ¶nh h-ëng tíi mÉu cÊy th«ng qua thêi gian chiÕu s¸ng, c-êng ®é ¸nh s¸ng vµ chÊt l-îng ¸nh s¸ng. Thêi gian chiÕu s¸ng cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn cña m« nu«i cÊy. Víi ®a sè c¸c loµi c©y, thêi gian chiÕu s¸ng thÝch hîp lµ 8 – 12 h/ngµy. C-êng ®é ¸nh s¸ng ¶nh h-ëng lªn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i m« nu«i cÊy. C-êng ®é ¸ng s¸ng cao kÝch thÝch sinh tr-ëng cña m« sÑo trong khi c-êng ®é thÊp g©y nªn sù t¹o chåi (Ammirato, 1986). Nh×n chung, c-êng ®é ¸nh s¸ng thÝch hîp cho m« nu«i cÊy kho¶ng tõ 1000 – 7000 lux (Moresin, 1974). Bªn c¹nh thêi gian chiÕu s¸ng, c-êng ®é ¸nh s¸ng th× chÊt l-îng ¸nh s¸ng còng ¶nh h-ëng kh¸ râ tíi sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« nu«i cÊy. ¸nh s¸ng ®á lµm t¨ng chiÒu cao cña th©n chåi h¬n so víi ¸nh s¸ng tr¾ng, cßn ¸nh s¸ng xanh th× øc chÕ sù v-¬n cao cña chåi nh-ng l¹i cã ¶nh h-ëng tèt tíi sù sinh tr-ëng cña m« sÑo. ChÝnh v× vËy mµ trong c¸c phßng thÝ nghiÖm th-êng sö dông ¸nh s¸ng cña ®Ìn huúnh quang víi c-êng ®é 2000 – 3000 lux. + NhiÖt ®é: lµ nh©n tè cã ¶nh h-ëng râ rÖt ®Õn sù ph©n chia tÕ bµo vµ c¸c qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña m« nu«i cÊy, ®ång thêi nã cßn ¶nh h-ëng tíi sù ho¹t ®éng cña Auxin, do ®ã lµm ¶nh h-ëng ®Õn kh¶ n¨ng ra rÔ cña c©y m«. Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña Vonanorld (1982) th× nÕu nhiÖt ®é ngµy/®ªm lµ 20OC/15 OC hoÆc 20 OC/18 OC tû lÖ ra rÔ ®¹t ®-îc kho¶ng 33%, thËm chÝ cßn thÊp h¬n. ë nhiÖt ®é trung b×nh th× ho¹t ®éng trao ®æi chÊt tèt h¬n. Cßn ë nhiÖt ®é cao l¹i kÝch thÝch 13 ra nhiÒu tÕ bµo kh«ng cã tæ chøc. Trong nu«i cÊy m«, nhiÖt ®é th-êng ®-îc duy tr× æn ®Þnh, ban ngµy tõ 25 - 28 OC vµ ban ®ªm tõ 17 - 20 OC. + §é Èm: Trong c¸c b×nh nu«i cÊy th× ®é Èm t-¬ng ®èi th-êng ®¹t kho¶ng 100% nªn ta kh«ng cÇn ph¶i quan t©m nhiÒu ®Õn vÊn ®Ò ®é Èm khi nu«i cÊy. 1.3.4. VËt liÖu nu«i cÊy ViÖc lùa chän vËt liÖu nu«i cÊy quyÕt ®Þnh ®Õn sù thµnh b¹i cña qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro. VÒ nguyªn t¾c th× mäi tÕ bµo cña c¸c m« chuyªn ho¸ ®Òu cã tÝnh toµn n¨ng, nghÜa lµ ®Òu cã thÓ nu«i cÊy thµnh c«ng. Thùc tÕ cho thÊy c¸c lo¹i tÕ bµo vµ c¸c lo¹i m« kh¸c nhau cã møc ®é nu«i cÊy thµnh c«ng kh¸c nhau. Mét nguyªn t¾c c¬ b¶n trong nu«i cÊy m« tÕ bµo lµ c¸c tÕ bµo lµm vËt liÖu nu«i cÊy cµng non th× kh¶ n¨ng nu«i cÊy thµnh c«ng cµng cao. Nh- vËy, tÕ bµo vµ m« ph«i non lµ triÓn väng nhÊt, råi ®Õn c¸c tÕ bµo cña ®Ønh sinh tr­ëng nh­: m« ph©n sinh ®Çu ngän, ®Çu rÔ, l¸ non, t­îng tÇng…, sau ®ã lµ c¸c tÕ bµo sinh dôc nh- no·n bµo vµ tÕ bµo h¹t phÊn ë giai ®o¹n non [21] [22]. 1.3.5. §iÒu kiÖn v« trïng §©y lµ ®iÒu kiÖn c¬ b¶n ®Çu tiªn quyÕt ®Þnh sù thµnh b¹i cña qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro. NÕu ®iÒu kiÖn nµy kh«ng ®-îc ®¶m b¶o th× mÉu nu«i cÊy hoÆc m«i tr-êng sÏ bÞ nhiÔm, m« nu«i cÊy sÏ bÞ chÕt, c¸c thÝ nghiÖm ë giai ®o¹n sau sÏ bÞ ngõng l¹i. Do ®ã, trong toµn bé qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro cÇn ®¶m b¶o ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi. Muèn ®¶m b¶o ®iÒu kiÖn v« trïng cÇn cã ph-¬ng ph¸p khö trïng mÉu thÝch hîp, ph-¬ng tiÖn khö trïng hiÖn ®¹i, buång vµ bµn nu«i cÊy v« trïng. Chän ®-îc ®óng ph-¬ng ph¸p khö trïng sÏ cho tû lÖ sèng cao, m«i tr-êng dinh d-ìng thÝch hîp sÏ ®¹t tèc ®é sinh tr-ëng nhanh. 14 Ph-¬ng tiÖn khö trïng: - Nåi hÊp tiÖt trïng: sö dông cho viÖc khö trïng m«i tr-êng nu«i cÊy, dông cô nu«i cÊy b»ng h¬i n-íc cã ¸p suÊt vµ nhiÖt ®é cao (1,2 – 1.5 atm, 120 – 1300C). - Tñ sÊy: ®Ó sÊy kh« c¸c dông cô thuû tinh vµ dông cô cÊy. - Dung dÞch khö trïng: §Ó khö trïng vËt liÖu ®-a vµo nu«i cÊy ng-êi ta th-êng sö dông c¸c dung dÞch nh- HgCl2 (Clorua thuû ng©n), NaClO (Hypoclorit natri), Ca(Ocl)2 (Hypoclorit canxi), H2O2 (¤xi giµ) [43]… Cån dïng ®Ó khö trïng mÉu s¬ bé vµ ®èt c¸c dông cô khi nu«i cÊy. - PhÔu läc v« trïng: Dïng ®Ó khö trïng c¸c dung dÞch, kh«ng khö trïng ®-îc ë nhiÖt ®« cao nh- dung dÞch Enzym hoÆc mét sè chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng. HiÖn nay, ng-êi ta th-êng sö dông mét hÖ thèng b¬m khö trïng dung tÝch lín ®Ó thanh trïng c¸c dung dÞch nu«i cÊy khi nu«i cÊy tÕ bµo trÇn hay huyÒn phï tÕ bµo. - Buång cÊy vµ bµn cÊy v« trïng: + Buång v« trïng: N¬i ®Æt bµn cÊy cÇn kÝn giã, cao r¸o, s¹ch sÏ. Buång ph¶i ®-îc tiÖt trïng liªn tôc tr-íc vµ sau khi lµm viÖc b»ng Foocmon kÕt hîp chiÕu ®Ìn tö ngo¹i. + Bµn cÊy v« trïng: Tèt nhÊt lµ sö dông bµn cÊy Laminair flow box. ThiÕt bÞ nµy lµm viÖc theo nguyªn t¾c läc kh«ng khÝ v« trïng qua mµng vµ thæi kh«ng khÝ v« trïng vÒ phÝa ng-êi ngåi thao t¸c. 1.3.6. Buång nu«i cÊy Buång cÊy lµ n¬i dïng ®Ó ®Æt c¸c mÉu nu«i cÊy. Buång cÊy cÇn ph¶i ®¶m b¶o c¸c ®iÒu kiÖn: - NhiÖt ®é 25 – 30OC. - ¸nh s¸ng ®¹t 2000 – 3000 lux. - S¹ch sÏ, tr¸nh tiÕp xóc víi bªn ngoµi. 15 1.4. øng dông nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt trong c«ng t¸c gièng c©y rõng 1.4.1. Trªn thÕ giíi HiÖn nay, nu«i cÊy in vitro ®· vµ ®ang ®-îc øng dông réng r·i trong s¶n xuÊt th-¬ng m¹i ë nhiÒu n-íc trªn thÕ giíi, hµng tr¨m loµi c©y l¸ réng vµ hµng chôc loµi c©y l¸ kim ®· ®-îc nu«i cÊy m« thµnh c«ng. Cho tíi n¨m 1991, Th¸i Lan ®· nh©n gièng in vitro thµnh c«ng cho 55 loµi trong tæng sè 67 loµi tre tróc thö nghiÖm. C«ng nghÖ nµy cho phÐp nh©n nhanh loµi Dendrocalamus asper víi sè l-îng kho¶ng 1 triÖu c©y mçi n¨m ®¸p øng ®-îc nhu cÇu c©y con phôc vô cho trång rõng [15]. Sè l-îng c¸c loµi B¹ch ®µn ®· ®-îc nh©n gièng b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro ngµy cµng t¨ng, ®Õn n¨m 1987 ®· cã trªn 20 loµi B¹ch ®µn kh¸c nhau ®-îc nu«i cÊy thµnh c«ng. C¸c nhµ khoa häc Ên §é thµnh c«ng trong viÖc t¹o c©y m« tõ c¸c c©y tréi B¹ch ®µn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana. C©y m« cã nguån gèc tõ c©y -u viÖt sinh tr-ëng nhanh gÊp 3 lÇn vµ ®ång ®Òu h¬n lµ c©y mäc tõ h¹t cña cïng c©y mÑ. T¹i Autralia, nh©n gièng in vitro ®· ®-îc ¸p dông ®Ó nh©n nhanh cho c¸c c©y ®-îc chän cho tÝnh chÞu mÆn trong ®Êt vµ ®ang ®-îc ®-a vµo s¶n xuÊt trªn quy m« lín cho loµi E. camandulensis. Trung Quèc lµ mét n-íc thµnh c«ng trong viÖc t¹o c©y in vitro cho c¸c loµi c©y th©n gç. §Õn nay ®· cã h¬n 100 loµi c©y th©n gç ®-îc nu«i cÊy nhD­¬ng, B¹ch ®µn, TÕch, Bao ®ång… Lµ mét trong nh÷ng n­íc øng dông sím vµ thµnh c«ng nu«i cÊy m« vµo trång rõng trªn diÖn réng. §Õn n¨m 1991 ë vïng Nam Trung Quèc, ng-êi ta ®· t¹o ra trªn 1 triÖu c©y m« cña c¸c c©y vµ c¸c dßng lai ®-îc chän läc. Nh÷ng c©y m« nµy ®-îc dïng nh- lµ nh÷ng c©y ®Çu dßng ®Ó t¹o c©y hom t¹i c¸c v-ên -¬m ®Þa ph-¬ng vµ dïng th¼ng vµo trång rõng [14]. 16 NhiÒu loµi c©y l¸ réng Ch©u ¢u ®· ®-îc thö nghiÖm nh©n gièng thµnh c«ng b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy m« nh-: Acer, Beluta, Fagus, Quercus, Carpinus... C¸c c©y m« ®· ®-îc trång ra thùc ®Þa ®Ó so s¸nh vµ ®· cho thÊy chóng cã kiÓu h×nh t-¬ng ®èi gièng nhau, tû lÖ sèng ë rõng trång sau khi c©y ®-îc huÊn luyÖn lµ kh¸ cao cã thÓ ®¹t 90% ®Õn 100% cho mét sè loµi [14]. HiÖn nay, nu«i cÊy in vitro còng lµ mét biÖn ph¸p nh©n gièng ®-îc ¸p dông nhiÒu ë c¸c loµi c©y l¸ kim nh»m phôc vô cho c¸c ch-¬ng tr×nh trång rõng dßng v« tÝnh. Mét sè loµi Th«ng ®· ®-îc nu«i cÊy thµnh c«ng ®ã lµ Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Cã tíi 30 loµi trong sè c¸c loµi c©y l¸ kim ®-îc nghiªn cøu nu«i cÊy m« ®· ®¹t ®-îc nh÷ng thµnh c«ng b-íc ®Çu, trong ®ã ph¶i kÓ ®Õn c¸c loµi B¸ch t¸n (Araucaria) LiÔu sam (Cryptomeria japonica) B¸ch xanh [14]…Trong sè 30 loµi c©y l¸ kim ®· ®­îc nu«i cÊy m«, cã bèn loµi ®-îc ®-a vµo s¶n xuÊt trªn diÖn réng ®ã lµ Cï tïng (Sequoia sempevirens) ë Ph¸p; Th«ng P. radiate ë ViÖn nghiªn cøu L©m nghiÖp New Dil©n; Th«ng P. taeda vµ Pseudotsuga menziesii ë Mü. T¸c gi¶ Darus H. Ahmas thuéc ViÖn nghiªn cøu L©m nghiÖp Malaysia ®· nu«i cÊy in vitro c©y Keo tai t-îng (Accasia mangium) b»ng m«i tr-êng MS cã bæ sung 3% sucrose, 0.6% agar vµ 0.5mg/l BAP cho giai ®o¹n nh©n chåi. Nh÷ng chåi cã chiÒu cao trªn 0.5 cm ®-îc cÊy vµo m«i tr-êng t¹o rÔ vµ chÊt ®iÒu hoµ sinh tr-ëng tèt nhÊt cho t¹o rÔ lµ IBA 1000ppm víi tû lÖ ra rÔ lµ 40% [30]. Ng-êi ta còng ®· nh©n gièng thµnh c«ng Phi lao b»ng biÖn ph¸p nu«i cÊy m« vµ ®· trång so s¸nh víi c©y h¹t trong nhµ kÝnh. Kü thuËt nµy ®ang ®-îc ¸p dông ®Ó t¹o c©y m« Phi lao sinh tr-ëng nhanh, kh¸ng bÖnh vµ cè ®Þnh ®¹m cao cho trång rõng [14]. C¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« còng ®· ®-îc ¸p dông cho c©y TÕch (Tectona grandis). Gupta vµ c¸c céng sù (1979) ®· m« t¶ sù h×nh thµnh côm chåi tõ phÇn c¾t cña c©y non vµ tõ mÇm c©y 100 tuæi. Tõ ®ã hä cã thÓ t¹o 17 ®-îc 500 c©y in vitro tõ mét chåi ë c©y tr-ëng thµnh vµ 3000 c©y tõ mét c©y non trong mét n¨m. Kaosaard (1990) cho biÕt Th¸i Lan còng ph¸t triÓn thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy m« vµo n¨m 1986 cho c©y TÕch vµ cho phÐp t¹o ra 500.000 chåi tõ mét chåi trong mét n¨m [28]. Perhutani (Indonesia, 1991) ®· thö nghiÖm vµ nu«i cÊy m« thµnh c«ng ®èi víi loµi TÕch vµ mét vµi c©y m« ®· ®-îc ®em trång thö. 1.4.2. ë ViÖt nam Nh÷ng c¬ së hiÖn nay ®ang nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« ë quy m« lín trong L©m nghiÖp n-íc ta lµ Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng, ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy Phï Ninh, C«ng ty gièng L©m nghiÖp trung -¬ng, Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt L©m nghiÖp Qu¶ng Ninh, XÝ nghiÖp gièng Thµnh phè Hå ChÝ Minh, Tr­êng ®¹i häc L©m nghiÖp, …vv. HiÖn nay, mét sè tØnh vµ ®Þa ph-¬ng ®· thµnh lËp phßng nu«i cÊy m« ®Ó phôc vô cho c«ng t¸c gièng c©y trång vµ ®¹t ®-îc nh÷ng thµnh c«ng b-íc ®Çu. Nu«i cÊy m« ë n-íc ta ®· ¸p dông réng r·i trong c«ng t¸c nh©n gièng mét sè gièng B¹ch ®µn nhËp néi, c¸c dßng v« tÝnh B¹ch ®µn lai vµ Keo lai cã n¨ng suÊt cao. Cïng víi nh÷ng kÕt qu¶ vÒ c¶i thiÖn gièng Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng ®· nghiªn cøu thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy in vitro cho Keo lai, B¹ch ®µn vµ mét sè gièng c©y rõng kh¸c [9]. D-¬ng Méng Hïng (1993) nghiªn cøu b»ng nu«i cÊy m« cho hai loµi B¹ch ®µn E. camaldulensis vµ E. urophylla tõ c©y tréi cña 2 loµi ®· t¹o ®-îc mét sè c©y m« B¹ch ®µn víi hÖ sè nh©n chåi lµ 1-2 lÇn [5]. N¨m 1995, NguyÔn Ngäc T©n vµ céng sù còng cã nghiªn cøu nh©n nhanh Keo lai b»ng ph-¬ng ph¸p nu«i cÊy m«. Keo lai nu«i cÊy trong m«i tr-êng MS cã bæ sung BAP 2mg/l cho hÖ sè nh©n chåi cao h¬n ë c¸c nång ®é kh¸c tõ 3-4 lÇn. C©y m« cã thÓ cho ra rÔ trùc tiÕp trªn nÒn c¸t phun s-¬ng trong nhµ kÝnh b»ng c¸ch ng©m hoÆc nhóng nhanh trong c¸c chÊt kÝch thÝch