Tài liệu Nghiên cứu nhân giống invitro cây ba kích tại khoa nông lâm, trường đh tây bắc

TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN. NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH (MORINDA OFFICINALIS HOW) TẠI KHOA NÔNG - LÂM, TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC Thuộc nhóm ngành: Khoa học Nông nghiệp SƠN LA, NĂM 2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH (MORINDA OFFICINALIS HOW) TẠI KHOA NÔNG - LÂM, TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC Thuộc nhóm ngành: Khoa học Nông nghiệp Ngƣời thực hiện: Lò Thị Dung Giới tính: Nữ Dân tộc: Thái Quàng Văn Đông Giới tính: Nam Dân tộc: Thái Lò Văn Đức Giới tính: Nam Dân tộc: Thái Lớp: K54 ĐH Nông học, Khoa: Nông Lâm Năm thứ 4/số năm đào tạo 4 Ngành học: ĐH Nông học Sinh viên chịu trách nhiệm chính: Lò Thị Dung Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Đoàn Thị Thùy Linh Sơn La, tháng 01 năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này ngoài sự cố gắng của bản thân nhóm đề tài chúng tôi nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên chúng em xin được bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Đoàn Thị Thùy Linh đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên chúng em trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thiện đề tài này. Chúng em xin được gửi lời trân thành cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Nông học, khoa Nông- Lâm những người đã trực tiếp giảng dạy trang bị cho chúng em những kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ chúng tôi trong quá trình học tập và trong quá trình thực hiện đề tài. Sơn la, tháng 10 năm 2016 Nhóm tác giả đề tài Lò Thị Dung Quàng Văn Đông Lò Văn Đức MỤC LỤC PHẦN 1. MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................1 1.2. Mục đích, yêu cầu nghiên cứu ...................................................................................3 1.2.1. Mục đích nghiên cứu ..............................................................................................3 1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ................................................................................................3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU...................................................4 2.1. Giới thiệu về cây ba kích ...........................................................................................4 2.1.1. Phân loại, nguồn gốc [2]. ........................................................................................4 2.1.2. Phân bố [2] ..............................................................................................................4 2.1.3. Đặc điểm sinh vật học và sinh thái học ..................................................................4 2.1.3.1. Đặc điểm hình thái [2] .........................................................................................4 2.1.3.2. Đặc điểm sinh vật học và sinh thái học [7] .........................................................5 2.2. Giá trị của cây ba kích ...............................................................................................6 2.2.1. Giá trị y ho ̣c ............................................................................................................6 2.2.2. Giá trị kinh tế ..........................................................................................................7 2.3. Tình hình phát triển nguồn dược liệu và cây Ba Kích ở Việt Nam ..........................7 2.3.1. Tình hình phát triển nguồn cây dược liệu ..............................................................7 2.3.2. Tình hình phát triển cây Ba Kích ...........................................................................9 2.4. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào. ..................................................................................9 2.4.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .........................10 2.4.2 Vai trò của một số hormone sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............11 2.4.3. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống cây trồng ...................12 2.5. Những nghiên cứu nhân giống nuôi cấy in vitro cây Ba Kích ...............................14 2.5.1. Trên thế giới ..........................................................................................................14 2.5.2. Ở Việt Nam ...........................................................................................................15 PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................................17 3.1. Đối tượng, phạm vi và vật liệu nghiên cứu .............................................................17 3.1.1. Đối tượng ..............................................................................................................17 3.1.2. Phạm vi .................................................................................................................17 3.1.3. Vật liệu ..................................................................................................................17 3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ...............................................................................18 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu.............................................................................................18 3.2.2. Thời gian nghiên cứu............................................................................................18 3.3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................18 3.4. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................18 3.4.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP tới khả năng nhân chồi cây ba kích in vitro. ....................................................................................................................19 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ cây ba kích in vitro .................................................................................................................................19 3.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng thích ứng cây Ba Kích in vitro ...............................................................................................................20 3.4.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu kết quả nghiên cứu. ................................21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................23 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi in vitro cây ba kích ..........23 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của cây Ba Kích. .......................26 4.3. Ảnh hưởng của loại giá thể tới khả năng sinh trưởng của cây Ba Kích invitro ngoài vườn ươm ..............................................................................................................30 4.3.1. Ảnh hưởng của loại giá thể tới tỷ lệ sống của cây ba kích ngoài vườn ươm ......31 4.3.2. Ảnh hưởng của loại giá thể tới khả năng sinh trưởng của cây ba kích invitro ngoài vườn ươm ..............................................................................................................32 PHẦN 5. KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ ..................................................................................36 5.1. Kết luận. ...................................................................................................................36 5.2. Kiến nghị..................................................................................................................36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................37 PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MS : Murashige & Skoog, 1962 BAP : 6-Bezyl amino purine KIN : Kinetin (6-furfurol amino purine) IBA : Indole -3-Butyric Acid α.NAA : 1-Naphthalene Acetic Acid CT : Công thức ĐC : Đối chứng NC : Nghiên cứu RR : Ra rễ GT : Giá thể DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Ảnh hưởng của một số nồng độ BAP tới khả năng nhân nhanh chồi cây ba kích in vitro .....................................................................................................................24 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của một số nồng độ IBA tới khả năng ra rễ cây ba kích in vitro .........................................................................................................................................27 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sống sót của cây ba kích in vitro ở vườn ươm ........................................................................................................................31 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây ba kích in vitro ở vườn ươm ............................................................................................................33 DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Sơ đồ ảnh hưởng của các nồng độ BAP tới một số chỉ tiêu ở giai đoạn nhân nhanh chồi cây ba kích in vitro .......................................................................................24 Hình 4.2. Sơ đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng ra rễ cây ba kích in vitro ..27 Hình 4.3. Thí nghiệm hình thành rễ cây Ba Kích in vitro trên môi trường bổ sung IBA ở các nồng độ khác nhau.................................................................................................29 Hình 4.4. Biểu đồ ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sống sót của cây ba kích in vitro ở vườn ươm ............................................................................................................32 Hình 4.5. Biểu đồ ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây ba kích in vitro ở vườn ươm ........................................................................................................33 Hình 4.6. Cây ba kích in vitro sau 4 tuần huấn luyện ở các giá thể khác nhau .............34 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng. Nguồn dược liệu con người đang sử dụng có thể được tổng hợp bằng nhiều con đường khác nhau như tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu từ thực vật đã được con người sử dụng từ lâu và nhu cầu ngày càng lớn. Tuy nhiên, các loài cây dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức, các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên,…dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người. [12] Cây Ba Kích (Morinda officinalis How) hay còn gọi là cây Ruột gà, Ba kích thiên,…là cây thuốc quý trong y học cổ truyền. Theo Quyết định số 05/2008/QĐBYT ngày 01/02/2008 của Bộ trưởng Bộ Y tế về danh mục các vị thuốc y học cổ truyền chủ yếu dùng để khám chữa bệnh, ba kích đứng đầu trong nhóm các vị thuốc bổ dương khí [11]. Củ của cây Ba kích có tác dụng bổ thận, tăng cường thể lực, tăng cường sức đề kháng, sức dẻo dai, khử phong thấp [21], dịch chiết từ củ Ba Kích có tác dụng giảm huyết áp, bổ trí não, giúp ăn ngủ ngon [18]. Do có nhiều tác dụng nên hiện nay nhu cầu sử dụng đối với củ ba kích đang gia tăng, dẫn đến bị khai thác ồ ạt, vùng phân bố bị tàn phá khiến số lượng loài cây này giảm nghiêm trọng, gần như tuyệt chủng. Vì thế, Ba kích tím đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) [1] và Danh lục Đỏ Cây thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2004) nhằm khuyến cáo bảo vệ. Theo Nghị định số 48/2002/NĐ-CP ngày 22 tháng 4 năm 2002 quy định danh mục thực vật, động vật rừng quý hiếm và chế độ quản lý, bảo vệ thì ba kích thuộc nhóm IIA,thực vật hoang dã, hạn chế khai thác, sử dụng [6] Trong những năm gần đây xu hướng trồng và kinh doanh cây ba kích lấy củ ngày một tăng tại các tỉnh phía bắc có giá trị kinh tế thu nhập lớn hơn hẳn với các loại cây trồng khác như: ngô, lúa, sắn [5] nên nhu cầu về giống đặc biệt là giống chất lượng cao ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc nhân giống cung cấp cho nhu cầu sản xuất hiện nay còn găp nhiều bất cập, khó khăn. 1 Tại Sơn La, cây Ba kích tím mọc tự nhiên, chủ yếu trong các quần hệ rừng, được đồng bào dân tộc Thái gọi là cây Sáy Cáy, người Mông gọi là cây Chẩu Phòng Xì,…loài cây này do khai thác không chú ý đến tái sinh trong nhiều năm qua, cùng với nhiều nguyên nhân khác như thói quen phá rừng, đốt rừng, đốt nương làm rẫy,… làm cho số lượng loài cây này tại Sơn La giảm nghiêm trọng. Ba kích tím là loại cây thuốc rất quý, có giá trị kinh tế cao, đang được nhiều địa phương trong cả nước quan tâm nghiên cứu để bảo tồn và phát triển. Tại nhiều địa phương như Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ, Vĩnh Yên,…đã có nhiều nghiên cứu về loài cây này và nghề trồng cây ba kích tím nguyên liệu là một hướng phát triển kinh tế hiệu quả, giúp nhiều hộ dân ổn định cuộc sống, thoát nghèo. Nhưng tại Sơn La công tác bảo tồn và phát triển loài cây này hiện là vấn đề rất mới mẻ, chưa được quan tâm nghiên cứu. Việc bảo tồn và phát triển loài cây Ba kích tím có nguồn gốc tại Sơn La sẽ góp phần bảo tồn đa dạng nguồn gen thực vật bản địa tại vùng Tây Bắc, đánh giá được thực trạng khai thác, sử dụng, hiện trạng của loài cây này tại địa phương, đồng thời đề xuất các giải pháp nhằm bảo vệ và phát triển chúng, phát triển sản xuất bằng Công nghệ Sinh học để góp phần sản xuất cây giống tốt, sạch bệnh, đáp ứng nhu cầu nguyện vọng về cây giống cho người dân địa phương. Mô hình không chỉ góp phần bảo tồn một loại dược liệu quý mà còn thúc đẩy quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi phù hợp với điều kiện thực tiễn ở địa phương; hạn chế người dân phá rừng làm kạn kiệt nguồn tài nguyên, từng bước thay đổi tập quán canh tác, đưa người nông dân vùng cao, đặc biệt là đồng bào dân tộc thiểu số sinh sống trong tỉnh Sơn La chuyển từ sản xuất tự phát sang tập trung theo vùng sản xuất hàng hóa, nâng cao đời sống, xoá đói giảm nghèo cho người dân. Nguồn cung cấp giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm hom. Việc nhân giống ba kích bằng phương pháp này tuy có ưu điểm là kỹ thuật tương đối đơn giản, không đòi hỏi máy móc hiện đại, dễ áp dụng nhưng cũng có nhiều nhược điểm như: hệ số nhân giống thấp chỉ đạt 0.6/lần/ năm [6] đòi hỏi nguồn cung cấp hom thường xuyên và rất lớn cây giống không hoàn toàn sạch bệnh sản xuất phụ thuộc vào mùa vụ, chất lượng cây giống không đảm bảo vì vậy chưa đáp ứng đủ nhu cầu hiện nay. Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống invitro cây Ba kích (Morinda officinalis How) tại Khoa Nông – Lâm, trường Học Tây Bắc”. 2 1.2. Mục đích, yêu cầu nghiên cứu 1.2.1. Mục đích nghiên cứu Hoàn thiện quy trình nhân giống Ba kích tím bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro với 3 công đoạn chính: nhân nhanh chồi, tạo cây hoàn chỉnh, thích ứng cây trong vườn ươm. 1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu - Xác định môi trường nhân nhanh chồi ba kích tím có hiệu quả. - Xác định môi trường ra rễ thích hợp với cây ba kích tím. - Xác định loại giá thể phù hợp cho giai đoạn ra cây con in vitro. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. Giới thiệu về cây ba kích Cây Ba kích có tên khoa học là Morinda officinalis. How, ở một số vùng miền còn gọi với tên khác như: Cây ruột già, chẩu phóng xì (Quảng Ninh), sáy cáy (Thái), thau tày cáy (Tày), chày kavằng dòi (Dao), Ba kích thiên (Trung Quốc). 2.1.1. Phân loại, nguồn gốc [2]. Cây Ba kích thường mọc hoang ở hầu như tất cả các tỉnh miền núi phía Bắc. Ngoài ra cây còn có ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ và Triều Tiên, cây Ba kích có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây Ba kích thuộc: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa môi (Lamiidae) Bộ Long não (Gentianales) Họ Cà phê (Rubiaceae) Chi Nhàu (Morinda) Loài Morinda officinalis.How Tên thường gọi là Ba kích. 2.1.2. Phân bố [2] Trên thế giới Ba kích phân bố tự nhiên ở Lào, Trung Quốc và Việt Nam. Ở Việt Nam Ba kích mọc hoang, phân bố nhiều ở vùng ñồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc. Ba kích có nhiều ở Quảng Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, Yên Bái, Hà Giang, Hà Tây, Hòa Bình. Gần đây thấy ở Tây Giang - Quảng Nam 2.1.3. Đặc điểm sinh vật học và sinh thái học 2.1.3.1. Đặc điểm hình thái [2] Ba Kích là cây thân thảo, leo bằng thân, quấn vào cành cây khác hoặc giàn giá đỡ thân cây có thể dài tới hàng mét, sống nhiều năm, thân non có màu tím hoặc xanh, cành còn non có lông bao phủ, thân cành già nhẵn, màu nâu. Cành non, ngọn có cạnh, màu tím. Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, mép nguyên, phiến lá cứng có lông tập trung ở mép và ở gân, lá non có lông ở gân và mép lá, dày hơn ở mặt dưới, màu xanh lục, khi già ít lông hơn, màu trắng mốc, dài 6-15cm, rộng 2,5-6cm, cuống 4 ngắn. Lá kèm mỏng ôm sát vào thân. Rễ dạng rễ củ hình trụ tròn, thắt khúc, vặn vẹo cong queo, nhiều đoạn thắt nghẹt như ruột gà (nên gọi là cây ruột gà), đường kính 1.5 2,0 cm. Bên trong là lớp thịt củ dầy màu hồng hoặc tím, không mùi, vị ngọt nhưng hơi chát, trong cùng là lõi củ, thông thường khi chế biến sử dụng phần lõi được loại bỏ. Rễ dùng làm thuốc thường khô, thường được cắt thành từng đoạn ngắn, dài trên 5cm, đường kính khỏang 5mm, có nhiều chỗ đứt để lộ ra lõi nhỏ bên trong.Vỏ ngoài màu nâu nhạt hoặc hồng nhạt, có vân dọc. Bên trong là thịt màu hồng hoặc tím, vị hơi ngọt. Hoa nhỏ, lúc non màu trắng, sau hơi vàng, tập trung thành tán tròn ở đầu cành, dài 0,31,5cm gồm 8 – 10 hoa, hoa mẫu 4 (4 lá đài, 4 cánh hoa, 4 nhị), lúc non màu trắng sau hơi vàng, đài hoa hình chén hoặc hình ống gồm những lá đài nhỏ tam giác đều phát triển không đều. Tràng hoa 4 cánh màu trắng, dính liền ở phía dưới thành ống ngắn, nhị đính ở đáy của sống tràng, bầu hạ, vòi chẻ đôi ở đỉnh. Mùa hoa vào tháng 5, tháng 6. Quả hình cầu, rời hoặc dính với nhau, đường kính 6 – 11 cm khi chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa quả: tháng 7-10. Hạt nhỏ, màu vàng nhạt, vỏ hạt nhám.[2]. Ba Kích trồng được 3 năm có thể thu hoạch. Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11. 2.1.3.2. Đặc điểm sinh vật học và sinh thái học [7] Cây Ba Kích thích ứng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau. Ở giai đoạn trưởng thành cây ưa sáng, khi cây non 2 tuổi cây ưa bóng. Cây sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 22,5° - 23,1°C, độ ẩm không khí từ 82- 89%. Lượng mưa từ 1420.7 – 2574.5mm trên năm, Ba kích thích hợp với đất feralit đỏ vàng và đất feralit giầu mùn trên núi, đất thịt ẩm mát. Mùa hoa vào tháng 5 và tháng 6, mùa quả vào tháng 7 đến tháng 10, quả chín từ tháng 11 đến tháng 12, cây tái sinh bằng hạt hoặc bằng chồi. Cây mọc hoang dưới tán rừng thứ sinh trong các rừng cây hoặc bụi thưa, ở ven rừng rậm ưa ẩm. Thích ở vùng nhiệt đới ẩm có 2 mùa mùa mưa và mùa khô rõ rệt, nhiệt độ không khí mùa mưa là 25- 38 0C, nhiệt độ mùa khô là 8- 24 độ 0C. Lượng mưa năm là 1100 – 2000mm. Khi còn nhỏ cây chịu bóng, thích hợp độ tàn che từ 0,4- 0,5 ở nơi đất trống cần trồng cây che phủ. Trong tự nhiên có 2 loại: Ba kích tím có lõi củ màu tím và Ba kích trắng có lá bầu hơn, lõi củ thường có màu vàng đến hồng vàng, người sử dụng thường ưa chuộng Ba kích tím hơn cây Ba kích trắng.[4] Cây sinh trưởng sau 5 đến 7 năm được thu dược liệu, năng suất 8- 12kg củ tươi/gốc, cây càng để lâu năm sản lượng càng cao chất lượng càng tốt Cây Ba Kích 5 được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu quý có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp, dịch chiết cồn từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não giúp ăn và ngủ ngon. Ngày nay, nhu cầu sử dụng loài cây này làm dược liệu đang gia tăng nên nó bị khai thác kiệt quệ. Mặt khác, vùng phân bố của cây Ba Kích bị tàn hóa nghiêm trọng khiến loài cây này lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng và đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ. Nguồn cung cấp cây giống Ba Kích hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành nhưng hệ số nhân rất thấp (chỉ đạt 0.61/ năm), chất lượng giống không được cao. 2.2. Giá trị của cây ba kích 2.2.1. Giá trị y ho ̣c Củ Ba kích là loại dược liệu quý dùng trong y học cổ truyền. Tăng sức dẻo dai: Trên thực nghiệm, khi dùng Ba kích với liều 5-10g/kg thể trọng dùng liên tiếp 7 ngày thấy có tác dụng tăng sức dẻo dai cho súc vật thí nghiệm. Tăng sức đề kháng: Ba Kích có tác dụng tăng cường sức đề kháng của cơ thể đối với các yếu tố độc hại. Đối với người già hoặc những bệnh nhân biểu hiện mệt mỏi, ăn kém, ngủ ít, gầy yếu mà không thấy có những yếu tố bệnh lý gây nên và một số trường hợp có đau mỏi các khớp, Ba Kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm giác chủ quan như giảm mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. Đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì sau khi dùng Ba Kích dài ngày cho thấy có hiệu quả. [22] Chống viêm: Các kết quả nghiên cứu ở chuột cống trắng đã cho thấy ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt Đối với hệ thống nội tiết, Các thí nghiệm trên chuột lớn và chuột nhắt cho thấy Ba Kích không có tác dụng kiểu androgen (là kích thích tố đực) nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hormon androgen. [19] Đối với nam giới có hoạt động sinh lý yếu Ba kích có tác dụng làm tăng khả năng giao hợp (đặc biệt đối với những trường hợp giao hợp yếu, ít). Ba kích còn có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng nhu cầu sinh lý, không thấy có tác dụng kiểu androgen. Tuy không làm thay đổi tinh dịch đồ nhưng 6 trên thực tế có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh lý cũng như điều trị vô sinh cho nam giới có biểu hiện vô sinh tương đối và suy nhược cơ thể. Đối với các trường hợp tinh dịch ít, tinh trùng chết nhiều, không có tinh trùng, không xuất tinh khi giao hợp thì sử dụng Ba kích chưa thấy có kết quả. [20] Theo y học cổ truyền, rễ Ba Kích vị ngọt, cay, hơi ấm không độc, có tác dụng: bổ thận, tráng dương, ích tinh, cường gân cốt, khứ phong thấp, bổ thận âm, bổ huyết hải, định tâm khí, trừ các loại phong, hóa đờm...chủ trị: thận hư, lãnh cảm, lưng gối mỏi, tê bại, phong thấp, thần kinh suy nhược, trúng phong, ho suyễn, tiêu chảy... Rễ ba kích chiết xuất bằng rượu có tác dụng hạ huyết áp, có tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, tăng cường hoạt động của não, giúp ngủ ngon. [8] 2.2.2. Giá trị kinh tế Do cây Ba Kích nhiều giá trị dược liệu, nên hiện nay củ ba kích có giá trị kinh tế khá cao đem la ̣i lơ ̣i nhuâ ̣n cao cho người trồ ng cây Ba Kích. Như vậy, cây Ba kích là cây bản địa có nhiều giá trị sử dụng và cả giá trị kinh tế cao, việc nhân giống cây Ba kích có ý nghĩa giúp bảo tồn nguồn gen không bị tuyệt chủng đồng thời mang lại hiệu quả kinh tế cao. 2.3. Tình hình phát triển nguồn dƣợc liệu và cây Ba Kích ở Việt Nam 2.3.1. Tình hình phát triển nguồn cây dƣợc liệu Việc khai thác cây thuốc một cách tự phát, mạnh ai người ấy làm, không có kế hoạch, đã làm cạn kiệt nhanh chóng nguồn cây thuốc và nhất là chất lượng dược liệu thu hái không đảm bảo chất lượng. Hiện nay nguồn dược liệu từ cây cỏ được khai thác từ trong nước không đủ dùng để chữa bệnh và sản xuất thuốc mà vẫn phải nhập một khối lượng lớn từ nước ngoài. Trước thực trạng đó, việc trồng cây thuốc để cung cấp nguyên liệu cho nhu cầu sử dụng ở trong nước đang trở nên cấp bách. Cần trồng những cây thuốc bản địa có nhu cầu sử dụng lớn, kể cả di thực cây thuốc của nước ngoài phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu ở Việt Nam. Nằm trong vùng khí hậu gió mùa nóng ẩm nên Việt Nam có nguồn tài nguyên phong phú và đa dạng với khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo. Kết quả điều tra trong nước đã ghi nhận được 3.948 loài thực vật và nấm lớn có thể dùng làm thuốc trong đó có hàng trục loại có giá trị chữa 7 bệnh cao.Tổng sản lượng dược liệu ở Việt Nam hằng năm ước tính khoảng từ ba đến năm nghìn tấn. Một số dược liệu quý được thế giới công nhận và có tiềm năng phát triển rất lớn như: Sâm Ngọc Linh, cây Ba Kích, Trinh Nữ Hoàng Cung, Quế,...[23] Tuy nhiên, trên thực tế cho thấy đến nay các vùng phân bố tự nhiên của cây thuốc bị suy giảm nghiêm trọng do khai thác một cách cạn kiệt. Nhiều vùng rừng có cây thuốc phong phú nay đã hoàn toàn bị phá bỏ, như khu vực núi Hàm Rồng - Sa Pa, Lào Cai, cao nguyên An Khê thuộc hai tỉnh Gia Lai và Bình Ðịnh, nhiều loại có nguy cơ tuyệt chủng, có 144 loài cây thuốc thuộc diện quý hiếm cần được bảo tồn: Sâm Ngọc Linh, Tam Thất, Ba Kích, Bách Hợp...[23] Thực tế, nhiều địa phương có đầy đủ các điều kiện để trồng trọt dược liệu có giá trị cao, nhưng do cách làm manh mún, tự phát, thiếu liên kết và thị trường dược liệu không ổn định nên việc phát triển các vùng dược liệu hiện nay gặp nhiều khó khăn. Chính sách bảo tồn nguồn gen, nhất là các cây quý còn quá ít. Từ một nước xuất khẩu, Việt Nam trở thành một nước nhập khẩu dược liệu để phục vụ thị trường trong nước. Mở rộng diện tích trồng cây thuốc là con đường tất yếu bảo đảm cung cấp đủ dược liệu cho công nghiệp dược trong nước và xuất khẩu. Khó khăn cơ bản cho các đơn vị sản xuất dược liệu hiện nay là nguồn nguyên liệu đầu vào không ổn định, không có khả năng truy nguồn gốc xuất xứ, dược liệu chất lượng kém, dược liệu rác từ biên giới nhập khẩu khó kiểm soát, giá rẻ cho nên dược liệu trong nước có giá cao không cạnh tranh được. Cần phải có một chiến lược khác, nuôi trồng và chế biến hợp lý có thể phát huy giá trị của nguồn tài nguyên quý bấu này trong chăm sóc sức khỏe nhân dân, đảm bảo tính ổn định trong sản xuất và tạo điều kiện cho 3 nhà „nhà doanh nghiệp - nhà khoa học - nhà nông‟ liên kết chặt chẽ để phát triển hiệu quả. Việt nam có điều kiện khí hậu đất đai phù hợp với việc phát triển nhiều loại cây dược liệu. Trong khi đó, các loại dược liệu tự nhiên đã bị khai thác quá mức mà chưa chú ý đến bảo tồn, tái sinh, dẫn đến nguy cơ bị cạn kiệt. Để cây dược liệu thực sự trở thành cây mũi nhọn trong tái cơ cấu nông nghiệp cần xây dựng chương trình hỗ trợ của nhà nước để phát triển cây dược liệu thành thế mạnh nông nghiệp đặc trưng lưu trữ những dược liệu quý trước nguy cơ cạn kiệt. Với điều kiện thiên nhiên nhiều ưu lãi, Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc. Đây cũng là điều kiện thuận lợi để phát triển nguồn dược liệu, cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước. Tuy nhiên, cho đến nay, nguồn dược 8 liệu nước ta vẫn phải phụ thuộc rất nhiều vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu mà chưa phát huy được hết những tiềm năng thảo dược tự nhiên. 2.3.2. Tình hình phát triển cây Ba Kích Ba kích là cây dược liệu có nhiều công dụng quý, sử dụng lại đơn giản nên nhu cầu về cây ba kích trên thị trường lớn. Cây Ba Kích trong rừng tự nhiên bị khai thác quá mức, lạm dụng và không chú ý đến khâu nuôi dưỡng, tái sinh. Dẫn đến số lượng cây Ba Kích còn ít thưa thớt thậm chí một số vùng còn không còn nữa.[10] Trong những năm qua, được sự quan tâm của các nghành chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi ở các huyện miền núi thông qua các chương trình 134, 135 các chương trình này hỗ trợ phát triển kinh tế. Cây ba kích được xếp vào nhóm loài cây lâm sản ngoài gỗ. Dự án lâm sản ngoài gỗ này do chính phủ Hà Lan tài trợ (1998- 2007) đã được tập huấn, giúp nông dân triển khai mô hình trồng cây Ba Kích tại các tỉnh phía bắc như: Hà Tĩnh, Quảng Nam, Bắc Giang, Quảng Ninh [3]. Do thấy được hiệu quả từ cây Ba Kích đem lại, người dân một số địa phương được triển khai dự án đã tự trồng cây Ba Kích trên đất được giao khoán. Tuy nhiên, nguồn giống được mua từ nhiều nơi không rõ nguồn gốc xuất xứ, không kiểm tra được chất lượng. Cây Ba Kích là loài cây đang được phát triển trồng trong vườn nhà,vườn rừng.. Bởi đây là loài cây ít tốn đất, có khả năng sống chịu bóng, sản phẩm có giá trị, thị trường tiêu thụ không chỉ trong nước mà còn được xuất khẩu. Ở nước ta Ba Kích được sử dụng chủ yếu trực tiếp như ngâm rượu, sắc nước uống. Sản phẩm rượu ngâm củ ba kích được coi là đặc sản của tỉnh Quảng Ninh [10]. Dự kiến phát triển ngành nông lâm nghiệp nước ta là chuyển đổi dần diện tích cây có giá trị kinh tế cao thay thế cây có giá trị kém hơn. Ba Kích đang là một trong những đối tượng được lựa chọn để mở rộng diện tích trồng ở các tỉnh phía Bắc trong những năm tới. [13]Việc quy hoạch vườn trồng và nguồn giống có xuất xứ, chất lượng hiện nay là việc làm mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn. 2.4. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào. Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây [15] đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ 9 cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) v.v. Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng [9]. Ưu điểm chính của nuôi cấy mô là cây mô được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Một ưu điểm khác của nhân giống bằng nuôi cấy mô là có hệ số nhân cao hơn nhân giống hom, từ một cụm chồi sau một năm nuôi cấy mô liên tục có thể sản xuất hàng triệu cây con. Hơn nữa, nuôi cấy mô cũng là một trong những biện pháp làm sạch bệnh. Vì thế mặc dầu nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ môhom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp [9]. 2.4.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Khái niệm: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong ñiều kiện vô trùng [13]. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy rằng, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Miller và Skoog (1956) đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy, chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. 10 Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng vẫn giữ nguyên khả năng phân chia. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào, (ngược lại với quá trình phân hoá tế bào). Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong điều kiện cần thiết ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với quá trình phân hoá tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào chính là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy 2 nhóm hormone thực vật là auxin và cytokinin. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp thì sự phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi; nếu tỷ lệ này cao thì tạo thành rễ, còn khi tỷ lệ này cân bằng thì sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo. 2.4.2 Vai trò của một số hormone sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Các hormone thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đó là các chất tự nhiên được sinh ra với hàm lượng nhỏ trong cơ thể thực vật hoặc các chất được tổng hợp nhân tạo. Các chất này được vận chuyển đến các cơ quan, bộ phận khác nhau của thực vật để điều tiết sự sinh trưởng của cơ quan, bộ phận đó. Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào và thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trưởng. Những hormone đó thuộc các nhóm sau: - Auxin: Auxin được gọi là hormone sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện, chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào, nhưng cũng làm tăng phân bào. Có 4 loại auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô là: Indolyl Acetic Acid (IAA) tồn tại trong tự nhiên; Naphthyl Acetic Acid (NAA); 2,4–Dichlorphenoxyacetic Acid (2,4-D); Indolyl Butyric Acid (IBA). 11 Auxin có tác dụng điều chỉnh rất nhiều quá trình sinh trưởng của tế bào, cơ quan và toàn cây, kích thích mạnh lên sự dãn của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kích thích sự hình thành và sinh trưởng của quả, tạo quả không hạt, kìm hãm sự rụng của lá, hoa và quả, điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn, có vai trò quan trọng trong các cử động sinh trưởng, tính hướng sáng và tính hưởng thủy của thực vật, hoạt hóa tổng hợp ARN. - Cytokinin (hormone phân bào) lần đầu tiên được Skoog (khoảng 1950) phát hiện trong một thí nghiệm chiết xuất acid nucleic bị sơ suất. Đó là những cấu tử của acid nucleic bị phân hủy thành. 3 loại cytokinin thường được dùng trong nuôi cấy mô là: Kinetin có cấu trúc phân tử là 6-(2-furfuryl)-aminopurin; Zeatin có cấu trúc phân tử là 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl) aminopurin; BAP (6 benzyl aminopurin). Cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, ảnh hưởng đến sự biệt hóa, đặc biệt là sự phân hóa chồi, kìm hãm sự phân hủy diệp lục, protein và acid nucleic do đó kéo dài tuổi thọ của lá, kích thích sự nảy mầm của chồi hạt và chồi ngủ, kích thích sự sinh trưởng của chồi bên và loại bỏ ưu thế ngọn, ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất như quá trình tổng hợp protein, acid nucleic, diệp lục, giúp thực vật chống lại Stress của môi trường, có hiệu quả lên sự phân hóa giới tính cái. - Giberelin: Giberelin được phát hiện vào những năm 1930. Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được trên 100 loại thuộc nhóm này, nhưng loại thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là acid gibberilic (GA3). Giberelin có vai trò kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng về chiều cao của thân, chiều dài của cành, rễ, hoạt hóa cá enzym thủy phân amilase, protease, lipase,… 2.4.3. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống cây trồng Nuôi cấy in vitro là một phương thức nhân giống dựa trên cơ sở của phân bào nguyên nhiễm, lối phân bào về cơ bản không có sự tổ hợp lại của thể nhiễm sắc trong quá trình phân chia, vì thế đây là phương thức nhân giống truyền đạt các biến dị di truyền của cây mẹ cho cây in vitro. Cây in vitro không những giữ được các hình thái giải phẫu của cây mẹ, giữ được các biến dị di truyền mong muốn mà còn giữ được các biến dị di truyền về sinh trưởng nhanh và cho năng suất cao của chúng. Nhân giống in vitro là phương thức giữ được ưu thế lai đời F1 và khắc phục được hiện tượng phân ly đời F2, nhân giống in vitro làm rút ngắn chu kỳ sinh sản, rút ngắn thời gian thực hiện chương trình cải thiện giống cây trồng và là phương thức nhân nhanh các loài cây quý 12