Tài liệu Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng thảo phi điệp tím (dendrobium anosmum lindl.)

iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Giới thiệu chung về phong lan ................................................................... 3 1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium).......................................................... 4 1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) ............... 7 1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan .............................................. 9 1.2. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 10 1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào ....................................................................................................... 10 1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính ........... 11 1.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitro................................................... 12 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô ................................ 13 1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium ......................... 14 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................... 16 Chƣơng 2: ................. 18 2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 18 .................................................................................... 18 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 18 iv 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................... 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 19 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................ 19 2.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy............................................................... 20 2.2.3. Chuẩn bị một số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy ........... 21 2.2.4. Chuẩn bị giá thể và ra cây ..................................................................... 21 2.2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................... 21 2.2.6. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 21 2.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi .............................................................................. 24 2.2.8. Xử lý số liệu .......................................................................................... 24 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 25 3.1. Kết quả khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy ................................................ 25 3.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt phong lan ................................................... 25 3.2. Kết quả tái sinh chồi ................................................................................. 26 3.2.1. Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím ..................... 26 3.2.2. Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím ............. 28 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím ............ 29 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) .............................................................................................................. 33 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả năng ra rễ Hoàng thảo phi điệp tím ............................................................................................................ 35 3.6. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của cây lan sau khi ra chai trồng trong bầu ........................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40 1. Kết luận ....................................................................................................... 40 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đủ ABA Abscisic acid ADN Acid deoxyribonucleic APG III Angiosperm Phylogeny Group III B1 Thiamine B2 Riboflavin BAP 6 - Benzyl adenin purine ĐC Đối chứng EAC Ehrlich ascites cells GA3 Gibberellic acid IAA Indol - 3 - acetic acid IBA Indol - 3 - butyric acid Kinetin 6 - furfurryl - aminopurin KTST Kích thích sinh trưởng MS Murashige and Skoog PM Phytamax RE Robert Ernst THT Than hoạt tính VW Vacin Went USA United States of America 2,4 - D α - NAA 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid α - Naphthalene acetic acid CT Công thức TG Thời gian KT Khử trùng vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím bằng HgCl2 0,1% ..................................................................................... 25 Bảng 3.2. Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hoàng thảo phi điệp tím ........ 27 Bảng 3.3. Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 50 ngày cấy chuyển ............................................................ 29 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím.................................................................. 30 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 30 ngày ............................................................................................ 34 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Hoàng thảo phi điệp tím ............................................................................. 36 Bảng 3.7. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát triển của cây .................................................................................... 38 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím ................................ 9 Hình 2.1. Quả loài lan Hoàng thảo phi điệp tím ............................................. 20 Hình 3.1. Hạt Hoàng thảo phi điệp tím nảy mầm trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy ....................................... 26 Hình 3.2. Protocorm của lan Hoàng thảo phi điệp tím được tạo thành từ hạt trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP ................................... 27 Hình 3.3. Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP .... 29 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ....................................... 33 Hình 3.5. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ........................ 35 Hình 3.6. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan sau 30 ngày.... 37 Hình 3.7. So sánh sự ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng và phát triển của cây lan con so với đối chứng sau 60 ngày ............... 38 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh quan môi trường. Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cần thiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng được trồng, sản xuất khá phổ biến và đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu trên thế giới. Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất khẩu lên đến hàng trăm triệu USD [15]. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự phát triển của các loài phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì nước ta có 137 - 140 chi với trên 1000 loài phong lan, mỗi loài lan đều có vẻ đẹp riêng. Lan rừng tuy không rực rỡ về màu sắc như những giống lan ngoại nhập nhưng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hương thơm vì vậy luôn được người chơi lan ưa chuộng. Thế giới lan rừng rất phong phú với nhiều chủng loại, một trong những chi phổ biến nhất là chi Hoàng thảo (Dendrobium). Hiện nay, Dendrobium được trồng nhiều và có giá trị kinh tế cao bởi bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại thì Dendrobium còn được tách chiết để phục vụ cho một số ngành công nghiệp mỹ phẩm, y học. Với giá trị như vậy hoa lan Dendrobium hứa hẹn sẽ mang lại nguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này. Trên thị trường hiện nay, phong lan chủ yếu được cung cấp dưới dạng cây giống khai thác từ rừng, còn hạt lan rất khó nảy mầm ở điều kiện tự nhiên vì vậy số lượng cây con mọc ra không nhiều. Ngày nay, với công nghệ nhân giống in vitro, người ta có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền từ một quả lan, từ đó góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen của các loài lan Việt Nam. Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vào chi Dendrobium đã làm cho nó trở thành một loài hoa cắt cành hiệu quả. 2 Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)” nhằm mục đích góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống lan rừng bằng phương pháp in vitro. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống loài lan rừng Dendrobium anosmum Lindl. (Hoàng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quý hiếm và nhân giống lan rừng Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đưa mẫu lan Hoàng thảo phi điệp tím vào nuôi cấy in vitro. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thực vật lên quá trình tái sinh chồi từ phôi hạt của loài lan Hoàng thảo phi điệp tím. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin lên quá trình nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.). - Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin lên quá trình hình thành rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.). - Tìm hiểu tác dụng của một số chế phẩm lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) sau khi ra cây trồng trong bầu. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học thuộc Khoa Khoa học Sự sống, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về phong lan Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc ngành thực vật hạt kín, lớp một lá mầm (Monocotylendons), phân lớp hành (Liliidae), họ Lan (Orchidaceae). Họ phong lan đã biết khoảng 850 chi (APG III, 2009) và có trên 25000 loài chiếm khoảng 10% của các loài thực vật có hoa (Dressler, 1993) [12]. Bên cạnh đó còn có hơn 30000 loài lan lai. Ngày nay, dựa vào đặc tính di truyền các nhà khoa học đã chia họ lan thành 6 họ phụ: Apostasioideae, Cypridioideae, Neottioideae, Orchidioideae, Epidendroideae, Vandoideae. Họ Lan là một họ thực vật lớn và phân bố gần như trên toàn thế giới (ngoại trừ châu Nam Cực). Danh sách dưới đây liệt kê gần đúng sự phân bố của họ này [18] Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi Châu Đại Dương: 50 - 70 chi Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 - 60 chi Bắc Mỹ: 20 - 25 chi Ở Việt Nam có 137-140 chi gồm trên 1000 loài lan rừng, bao gồm cả địa lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nước, hầu hết đều có hoa đẹp nên được trồng làm cây cảnh [3]. Dựa theo đặc điểm của thân cây, phong lan được chia ra làm hai nhóm là nhóm cây đơn thân (monopodial) và nhóm cây đa thân (sympodial). Nhóm cây đơn thân: lá mầm từ đỉnh mọc thêm hàng năm kéo theo thân cây phát triển dài ra có thể đạt kích thước tối đa đến vài mét. Ví dụ như chi lan Vanda, Vanilla... Nhóm cây đa thân thì một thân mầm chỉ phát triển đến kích thước nhất định, sau đó ngừng phát triển và có các thân mầm khác phát triển thay thế. Thân mầm phát triển từ thân gốc gọi là “mắt” cây. Các mắt cây phát triển 4 đến một kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây. Thân cây cứ phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các thân cây mọc từ cây gốc ban đầu gọi là cây đa thân, ví dụ như chi lan Cattleya, Dendrobium…[4], [17]. Dựa theo khả năng thích nghi với điều kiện môi trường họ lan được chia thành 4 nhóm chính: Phong lan (Epiphyte): Là loài sống ký gửi nhờ vào thân cây cao ẩm mục ở trong rừng hoặc trên núi cao, rễ bám vào các cây to, thân rủ xuống. Địa lan (Terrestrial): Là loài có thân giả dạng củ, rễ chùm sống nhờ đất ở sườn núi, bờ suối hay dưới tán rừng ẩm ướt. Địa lan có nhiều loài với hình dáng, màu sắc phong phú đẹp mắt. Hoại lan (Saprophyte): Gồm những loại mọc trên rêu và gỗ mục. Thạch lan (Lithophyte): Gồm một số loại mọc trên đá. 1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 1.1.1.1. Phân loại chi lan Hoàng thảo Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan đứng sau lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ở các vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á. Lan Hoàng thảo rất đa dạng về cấu tạo sinh học, hình thái và phong phú về dạng cây, dạng hoa. Vì vậy các nhà khoa học đã chia thành 40 nhóm nhỏ để tiện cho việc nghiên cứu và trồng trọt. Trong đó tiêu biểu nhất là các nhóm: Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm, hoa thường mọc ở gần ngọn có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobium phalaenopsis…[17] Nhóm thứ hai có đặc điểm là các giả hành buông thõng xuống, mang nhiều lá xanh hai bên, hoa mọc thành từng chùm hoặc từng hoa như: Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum… Nhóm thứ ba có đặc điểm là hoa mọc ở đỉnh, buông thõng xuống và có 5 mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum… Nhóm thứ tư có đặc điểm là chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc màu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile… Nhóm thứ năm có đặc điểm là giả hành mọc thẳng đứng có một lớp lông bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…[17] Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm thân mềm: Có đặc điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủ xuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao 1000 m. Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn (Malaysia, Indonexia…). Ngoài ra còn một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng nóng lạnh như: Dendrobium primulimun, Dendrobium farmeri… [17]. 1.1.1.2. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa. Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C tuy nhiên lan có thể chịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông lạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 - 6 tuần lan sẽ khó ra nụ. Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 - 70%. Nếu độ ẩm quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi. Cây cũng không mọc mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi. Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh trưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm, có sẵn trong tự nhiên. Những chất liệu này không 6 phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và quy mô sản xuất. Những loại giá thể thường sử dụng như vỏ thông, vỏ dừa, rêu... Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 - 3 lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa đi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩm quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1 - 2 lần [19]. 1.1.1.3. Sâu bệnh và các vấn đề khác Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiện cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị: Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium gây nên, cách phòng trị là tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vào thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18]. Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora gây nên, bệnh thường phát sinh mạnh trên cây lan Dendrobium, gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18]. Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum gây ra. Bệnh phát triển mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốc diệt nấm 5 - 7 ngày/lần [18]. Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám [18]. Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ 7 nhiễm bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và thối. Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần. Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phun nhiều hơn (2 - 3 lần/tuần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa [18]. Sâu hại lan: Rệp vảy thường bám trên các thân giả hành còn non, phòng trị bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng; Bọ trĩ gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1lần / tuần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [19] . 1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) 1.1.2.1. Phân loại Có nhiều cách phân loại cho Hoàng thảo phi điệp tím, theo hệ thống APG III thì lan được phân loại như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae) Lớp: Một lá mầm (Monocotylendons) Bộ: Măng tây (Asparagales) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae) Chi: Hoàng thảo (Dendrobium) Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) Tên khoa học của lan Hoàng thảo phi điệp tím được nhiều nhà khoa học công nhận là Dendrobium anosmum Lindl.[3]. 1.1.2.2. Đặc điểm sinh học - Rễ của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nước, muối 8 khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp. - Thân của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc nhóm lan thân có giả hành. Giả hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới. Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Củ giả hành có màu xanh bóng nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [4]. - Lá là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, là xưởng chế tạo chất dinh dưỡng bằng quang hợp. Xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang, các gân lá chính chạy song song và các khe lõm xuống, lá rụng tạo thành các giả hành. - Hoa không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên các giả hành cũ. Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mặt tím đậm, hương thơm ngào ngạt. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa mang phần đực ở phía trên và phần cái ở phía trước mặt. Nhị gồm hai phần bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốc phấn thì lõm lại mang khối phấn và thường song song với bao phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng. - Quả của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại quả nang nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc, khi chín quả nở ra, mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng. Hạt cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy không khí. Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [4], [5]. 1.1.2.3. Phân bố Hoàng thảo phi điệp tím có nguồn gốc rộng lớn khắp châu Á, từ miền Nam Nhật Bản đến các chân đồi phía Himalaya, bán đảo Đông Dương, 9 Malaysia, Indonexia… Ở Việt Nam, loài này phân bố trên khắp các núi rừng từ Bắc tới Nam: Đô Lương, Đà Lạt, Đắk Lắc, Hòa Bình… [16]. Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím 1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan 1.1.3.1. Các phương pháp nhân giống truyền thống Nhân giống vô tính Tách bụi: Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng được từ 2 - 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai, từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con [5]. Chiết cành: Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành một cách tự nhiên. Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách ra khỏi giả hành để trồng. Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn. 10 Nhân giống hữu tính: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện do cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụ phấn ấy. Có 2 phương pháp thụ phấn: Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên núm nhụy của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan. Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoa hác của cùng một cây hay cùng loài hoặc khác loài, khác giống. Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sang ngày hôm sau, các phiến hoa co lại nhưng không rụng và để tránh sự thụ phấn khác do côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng vì hầm hơi sẽ làm hư trái. Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to ra thành trái, mỗi trái có thể chứa hàng ngàn đến triệu hạt. Khi trái từ màu xanh lục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái. Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phải được nhiễm một số loại nấm cộng sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài nấm giúp hạt lan nảy mầm, mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan như: Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium; Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis; Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [3]. Nhân giống in vitro Ngày nay với công nghệ nhân giống in vitro, từ một quả lan có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền, đồng thời có chất lượng tốt và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. 1.2. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây[1]. 11 Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống đó là: (1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác nhau; (3) Nhân nhanh với điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh cho cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1]. Vì vậy, nuôi cấy mô - tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ có các ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vào sản xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo tốc độ nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây; (2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vận chuyển và bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm. 1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng: Ở lan có sự phát triển cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocrom sau đó tiếp tục phân chia cho ra các protocrom mới hay các chồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây: Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô - tế bào như các đoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ... Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo: Trong khuôn khổ mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. 12 1.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitro Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro [1], [11]. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy [1], [11]. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokynin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp [1], [11]. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng l này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [1], [11]. Giai đoạn 5: Đưa cây ra giá thể Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra ngoài môi trường l bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con đạt tỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất [1], [11]. 13 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô Mô nuôi cấy: Mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả hoặc thu được những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngừng phát triển ở một giai đoạn nhất định. Điều kiện vô trùng: Môi trường nuôi cấy mô thực vật có các thành phần thích hợp cho các loại nấm, vi khuẩn phát triển. Vì vậy, điều kiện tiên quyết là phải đảm bảo nguyên tắc vô trùng cho mẫu cấy, môi trường cấy và các trang thiết bị liên quan trong suốt quá trình nuôi cấy, tất cả các thao tác nuôi cấy, cấy chuyển… cũng phải thực hiện trong điều kiệ 1]. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng: Nguồn cacbon: Nguồ đường sucrose, glucose, maltose, galactose. Cung cấp năng lượng cho nuôi cấy đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [1], [10]. Thành phần khoáng: Các nguyên tố đa lượng như: N, P, S, K, Mg, Ca… được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l và thường tồn tại dưới các dạng muối NH4+, NaH2PO4, KNO3, KCl… Các nguyên tố vi lượng như: Mn, Bo, Zn, Cu, Ni… được cung cấp với hàm lượng nhỏ hơn 30 mg/l [1], [10]. Vitamin: Để cây phát triển được tối ưu ta cần bổ sung từ bên ngoài các vitamin như: Vitamin B1, B2; myo-inositol; biotin; pantothenic acid… Nước: Nước là thành phần quan trọ ấy, nó chiếm khoảng 95% trong môi trường dinh dưỡng. Agar: Hàm lượng agar thường dùng cho môi trường nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng. Than hoạt tính: Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 - 3%. Than hoạ 14 hấp thụ độc tố nâu/đen và các độc tố không màu khác; hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin…); thúc đẩy sự tạo phôi soma, ổn định độ pH [1], [10]. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chúng và nguồn gốc mô cấy... Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon) được chia làm hai nhóm chất có tác dụng đối kháng về sinh lý đó là: nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Đối với nhóm chất kích thích sinh trưởng gồm có 3 nhóm chính đó là: auxin, gibberellin và cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy. Còn các chất thuộc nhóm ức chế sinh trưởng gồm có ABA, etilen, các hợp chất phenol, các chất ức chế tổng hợp như retardant, các chất diệt cỏ… Bên cạnh các chất điều hoà sinh trưởng, người ta còn bổ sung thêm các dung dịch hữu cơ có thành phần phức tạp và không xác định như: dịch chiết nấm men, nước ép khoai tây, chuối, nước dừa, cazein thuỷ phân… nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy [10]. Ảnh hƣởng củ ật lí: Nhiệt độ thông thường trong phòng thí nghiệm nhiệt độ được duy trì bằng máy điều hoà ở 25 ± 2 C phù hợp với đa số mô cấy; ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990; Dooley, 1991). Cường độ ánh sáng trắng từ 1000 - 2500 lux, với chu kỳ 16/24 giờ chiếu sáng được dùng phổ biến cho nhiều mô nuôi cấy; pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 - 6 thì tốt trong nuôi cấy mô [10]. 1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium Phong lan là một trong những loại cây trồng có nhiều thành công nhất 15 trong nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Trên thế giới cũng như tại Việt Nam đã có rất nhiều công trình về nhân nhanh các giống lan nhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất. Với việc sử dụng kĩ thuật nhân giống đã tạo ra sự phát triển vượt bậc nghề trồng lan ở quy mô lớn. 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Tháng 8/2010, Maridass M. và cộng sự đã tiến hành nhân giống in vitro phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Nghiên cứu này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010). Vật liệu thân rễ được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử trùng với hyponatri 3% (bổ sung 2 - 3 giọt Tween80 EAC) trong 20 phút và sau đó rửa sạch cho 4 - 5 lần bằng nước cất vô trùng. Thân rễ được chẻ ra cắt miếng nhỏ (5 mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của MS bổ sung các chất KTST như NAA, BAP và kinetin. Các mẫu hình thành protocorm tốt trên môi trường MS + kinetin 1,2μM + NAA 2.0μM. Sau đó protocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + BAP 0.5μM [14]. Năm 2011, Sana A. và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh chồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách, sử dụng môi trường có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 mg/l và kinetin. Qua nghiên cứu các tác giả nhận thấy ở môi trường có chứa BAP 1,5 mg/l kết hợp với kinetin cho kết quả nhân chồi cao nhất. Tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa IBA 2 mg/l với tỷ lệ phần trăm tạo rễ (97,5%), số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA. Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ kém [15]. Bijaya P. và Deepa T. (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống Dendrobium primulinum Lindl. đã nhận thấy: Thông qua việc nuôi cấy các đỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5 mm trên môi trường MS cơ bản và môi trường MS bổ sung kết hợp các chất NAA, BAP ở các nồng độ khác nhau,