Tài liệu Nghiên cứu nhân giống cây ba kích tím bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- TRẦN VĂN PHÚ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- TRẦN VĂN PHÚ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : 44-CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình ThS. Nguyễn Xuân Vũ Thái Nguyên - 2016 i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây ba kích Tím bằng phương pháp In Vitro”. Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Thí nghiệm trung tâm lâm nghiệp, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực tập. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo Nguyễn Thị Tình và các kỹ sư trong trung tâm lâm nghiệp của trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập và mình cũng cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ mình trong thời gian vừa qua xin chân thành cám ơn. Trong thời gian thực tập vừa qua em đã có sự cố gắng rất nhiều nhưng vì thời gian có hạn lên em vẫn còn nhiều thiếu sót trong bài khóa luận của em, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 5 năm 2016 Sinh viên Trần Văn Phú ii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzylaminopurine MS : Murashige & Skoog (1962) CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/c : Đối chứng LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog (1962) MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid WHO : World Health Organization 1 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Ba kích tím ( Morinda officinalis How ) là một cây thuốc quý trong y học cổ truyền. Củ của cây ba kích được sử dụng như một loại dược liệu có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng sức dẻo dai và trừ phong thấp. Dịch chiết của củ cây ba kích có tác dụng giảm huyết áp tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon. Do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên cây Ba Kích Tím bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt . Mặt khác, vùng phân bố của ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ (nghị định số 48/2002/NĐ-CP). Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống ba kích có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách. Nguồn cung cấp cây giống ba kích hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành, nhưng hệ số nhân rất thấp (chỉ đạt 0,61/năm); chất lượng giống lại không cao. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Giải quyết được phần nào khó khăn trong nhân giống hữu tính cho đối tượng cây trồng này, góp phần bảo tồn và phát triển giống cung cấp nguyên liệu cho thị trường tiêu thụ và ngành y dược. 1.2. Mục đích và yên cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích của đề tài - Đề tài nhằm nghiên cứu xây dựng cải tiến quy trình nhân giống cây ba kích tím bằng phương pháp in vtiro có hệ số nhân giống cao và dễ ứng dụng sản xuất. 2 1.2.2. Yêu cầu của đề tài - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 0.1mg/l đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vtiro. - Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng auxin và cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Ba kích tím (Morinda officinalis How ) - Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng auxin và cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Ba kích tím (Morinda officinalis How ) - Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng auxin và cytokinin đến khả năng ra rễ cây Ba kích tím (Morinda officinalis How ) 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống cây ba kích tím bằng phương pháp in vitro. - Là tài liệu tham khảo thêm cho việc nghiên cứu và sản xuất tại các cơ sở. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần nhân nhanh tạo số lượng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo tồn loài dược liệu quý theo Nghị định số 48/2002/NĐ-CP, đảm bảo chất lượng cung cấp nguyên liệu cho việc phục hồi và phái triển lại cây ba kích tím 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) thuộc họ cà phê Rubioceae. Ba kích tím hình thái cây Ba kich tím Cây thường xanh sống lâu năm, leo cuốn vào cây khác hoặc tự cuốn tạo thành bụi lớn. Cây ba kích có lá mọc đối, khi non màu xanh hoặc màu tím, khi già màu xanh, cuống lá dài từ 4 - 8mm. Lá kèm màu nâu dạng mo, ôm thân. Phiến lá thường hình mác thuôn nhọn, hình ellip thuôn dài nhọn hoặc hình mác ngược hay hình trứng. Hiếm khi thấy hình mác hẹp dài phiến lá dài 3 16cm, rộng 1,9 - 6,5 cm đầu lá thuôn nhọn hay nhọn sắc, gốc lá nhọn hình nêm, tròn hay gần bằng, có khi hơi lõm dạng tim. Rễ dạng trụ tròn phân nhánh nhiều cấp thành bộ phận rễ, phân bố tỏa tròn xung quanh gốc, nhìn ngoài có vết thắt từng đoạn, thịt củ dày, nạc, màu tím hoặc trắng ngà. Rễ cây Ba kích - Cành non dạng bốn cạnh, màu tím hoặc xanh, có lông, khi già tròn không lông. - Cụm hoa chủ yếu là xim tán kép, ít khi là cụm hoa tán đơn. Ở cụm sim tán kép, hoa hầu như không cuống, cụm tán đơn hoa có cuống rõ ràng. Hoa của cây nhỏ ống đài dạng chén, có 3 - 4 răng nhỏ không đều. Tràng màu trắng, ống tràng dài 2 - 3mm, họng có lông, ở đầu có 3 - 4 cánh tràng dạng tam giác nhỏ. - Nhị 3 - 4 bao phấn nhọn đầu, hai ô, đính lưng, chỉ nhị cực ngắn. Vòi nhụy ngắn, đầu nhụy hai thùy. Hoa Ba Kích - Cụm quả kép do nhiều quả dính liền với nhau đính trên các cuống xim nhỏ tạo thành. - Ở cụm quả đơn, quả có cuống rõ ràng. Mỗi quả có 4 hạt. - Hạt có lông màu hồng, khi khô màu trắng. 4 Mùa hoa tháng 4 - 5, quả chín tháng 10 - 11, cá biệt có thể quả chín từ tháng 9 hoặc kéo dài tới đầu tháng 12-1 hay 3. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có khả năng chịu bóng, nhất là khi còn nhỏ. Ba Kích thường mọc tự nhiên trong các kiểu rừng thường xanh nhưng đã trở nên thứ sinh, bao gồm cả rừng xen tre nứa và rừng non phục hồi sau nương rẫy. Độ cao dưới 400m, cá biệt có thể tới 1000m. Đất ở nơi có Ba kích thường còn tương đối mầu mỡ, tơi xốp, trung tính hoặc hơi chua. Cây sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, ra hoa quả hàng năm. Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt hoặc mọc cụm chồi từ các phần còn lại sau khi chặt, phần rễ còn sót lại khi khai thác cũng có thể nảy mầm thành cây mới. Yêu cầu về nhiệt độ trung bình năm 22,5oC - 23,1oC. Độ ẩm không khí trung bình năm từ 82 - 89%. Ba kích mọc tự nhiên trên các loại đất feralit đỏ vàng hay vàng - đỏ, tầng đất thịt ở trên tương đối dày, có kết cấu tượng hạt và kết vón nhưng không có đá ong chặt. Đất luôn ẩm hơi chua, pH từ 3,6 đến 4,1, hàm lượng mùn 3,78 - 5,91%. Hàm lượng tổng số các chất trong 100g đất lần lượt là: nitơ 0,24 - 0,34mg, lân 0,7 - 1,5mg và kali 7mg. Ngoài ra, Ba Kích có thể sống trên đất feralit đỏ sẫm. Tầng đất mặt ở đây tương đối dày (tới 1m), thành phần cơ giới nặng, cấu tạo hạt chắc và tơi xốp, pH hơi chua đến trung tính 4,5 - 6, hàm lượng mùn ở mức trung bình 3 4%. Tại Hoành Bồ - Quảng Ninh và Sơn Động - Bắc Giang còn thấy Ba kích mọc trên đất bồi tụ, pha cát ở chân núi. Loại đất này thường nghèo dinh dưỡng hơn so với loại đất trên. Chú ý: Ba Kích không thích hợp với đất phù sa và các loại đất khác ở đồng bằng. 5 Ánh sáng: ánh sáng là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và phát triển của Ba Kích. Trong tự nhiên cây mọc xen lẫn với các loài cây khác dưới tán rừng, độ che tán 20 - 60%. Tuy nhiên để sinh trưởng phát triển được, cây thường leo lên các cây bụi hay cây gỗ nhỏ để tiếp cận với ánh sáng. Cây được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả nhiều hơn và nhiều hạt chắc hơn cây bị che bóng. Ba Kích mọc hoang ở vùng rừng thứ sinh, trung du và miền núi các tỉnh phía Bắc, dưới tán một số kiểu rừng nhiệt đới ẩm lá rộng thường xanh, nay trở nên thứ sinh gồm cây bụi và dây leo chằng chịt hoặc ở bờ nương rẫy. Độ cao phân bố khoảng 100m so với mặt biển. Càng lên cao cây càng thưa dần, đến độ cao khoảng 100m thì hầu như hiếm gặp. Có nhiều nhất ở các tỉnh Quảng Ninh, Phú Thọ, Hoà Bình, Hà Giang, Lạng Sơn. 2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học lịch sử của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1. Khái niệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ . Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau . 2.2.2. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Haberland (1902)là người đầu tiên đề xuất ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông mỗi tế bào bất kỳ cơ thế sống đều mang toàn bộ thông tin di truyền của loài 6 đó. Vì vậy ghặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào sẽ phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã thí nghiệm với tế bào khỉ khổng và thành công. Điều này đã làm cho những nhà hoa học thời bấy giờ mất hy vọng về việc sây dựng phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong 1 thời gian dài. Tuy nhiên sau đó Garrison(1904-1907) đã nuôi được tế bào thần kinh của ếch trong huyết tương chưng minh khả năng nuôi cấy mô tế bào động vật nhân tạo. Trên cơ sở thành công của các nhà khoa học nuôi cấy mô tế bào động vật các nhà khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi trường dinh dưỡng tự nhiên nhưng khong thành công. Năm 1922 Robins và Kotte đã thành công nuôi cấy đầu rễ trong vòng 12 ngày. Từ nhưng năm 30 của thế kỉ 20 phương phái nuôi cấy tế bào đã mang nhưng nét của nuôi cấy mô tế bào hiện đại với kỹ thuật ko khác với hiện nay nhiều lắm. Trong thời gian này White nhà bác học người Mỹ và Ghautheret (Pháp) đã có nhiều đóng ghóp trong việc nghiên cứu môi trường nuôi cấy, nhiều môi trường đến nay vẫn được sử dụng. Từ năm 1931 phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật được coi chính thức bắt đầu bằng công trình nghiên cứu của White với việc nuôi cấy rễ cây cà chua và ông là người đầu tiên chỉ ra rằng mô phân sinh trưởng trong thời gian dài nêu được cáy chuyển trong môi trường dinh dưỡng mới. Trong cùng thời gian Ghautheret cũng đã thành công trong việc nuôi cấy mô tượng tầng và tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp. Sau đó Miller và Skoog trong khi nuôi cấy nõi cây thước lá đã xác định được vài trò của Kinetin trong sự kích thích phát triển của mô. Những thí nghiêm về môi trường dinh dưỡng đã chỉ ra răng môi trường dinh dưỡng tính chất vật lý tính chất hóa học là những điều quan trọng quyết định đến thành công trong nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào. Những thành phần băt buộc của môi trường bao gồm chất khoáng từ các muối khác nhau của các nguyên tố đa lượng và vi lượng, thành phần hydrocacbon trong đường 7 và chât điều hóa sinh trưởng. Cũng rừ những năm 30 nuôi cấy mô tế bào đã phát triển theo một số hương như nuôi cấy phôi nuôi cấy cơ quan tách rời. Từ những năm 60 của thế kỷ thứ 20 trở lại đây, ngoài các hướng như nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần (protolast) được phát triển mạnh. Từ những năm 70 trở lại đây các kỹ thuật lại Xoma bằng dung hợp tế bào trần và chuyển gen biến nạp đàu tiên được tát sinh từ mô lá và được đưa vào trồng thử ngoài đồng ruông đã trở thành cơ sở không thể thiếu của công nghệ sinh học thực vật là công cụ quan trọng trong công tác phục tráng và nhân giống. 2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1. Tính toàn năng (Totipotenc) của tế bào Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào 2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau. Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia. 8 Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng. 2.4. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn: 2.4.1 Giai đoạn 1: Chuẩn bị vật liệu Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Có thể vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: CaOCl2, NaOCl, HgCl2,... Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân… Sharma G.J. (2005) đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây địa liền và cây ngải máu. Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu. Dương Tấn Nhựt và cs (2011) tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng cồn 70% trong 30 giây và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao. 2.4.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt. Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. Nayak S. và cs (2011) nghiên cứu nhân giống cây riềng in vitro cho thấy: Khi thử nồng độ BA từ 1 - 3 mg/l đến khả năng bật chồi thì cho thấy ở nồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt nhất. Behera K.K. và cs (2010) sử 9 dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng. Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy. Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hoá. 2.4.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy. Để tăng hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Chế độ nuôi cấy thường là 23-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính. Jala A. và cs (2012) nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp BA1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy. 2.4.4. Giai đoạn ra rễ cho mẫu. Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi. Nguyễn Thị Liễu và cs (2011) đã nghiên cứu ảnh 10 hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh cho thấy nồng độ tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định sâm Ngọc Linh là 2,4-D 1,0 mg/l trong môi trường MS bổ sung sucrose 50 mg/l. 2.4.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Là giai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất. Sen A. và cs (2010) khi chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường tự nhiên. Shahinozzaman M. (2013) chuyển cây con tái sinh in vitro sang chậu nhựa có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được làm thích nghi. Kết quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao. Theo Goer (1993) để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: - Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). - Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. - Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp. 2.5. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.5.1. Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) . 11 Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy . Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất. Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2 - hypoclorit canxi, NaOCl - hypoclorit natri, oxy già, HgCl2 - thủy ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…) . 2.5.2. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Buồng cấy có hệ thống màng lọc giúp lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt vi sinh vật trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy. Để khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương pháp: khử trùng khô (bằng nhiệt), khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc . - Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ . 2.5.3. Môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu và mục đích nuôi cấy. 12 2.5.4. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. 2.5.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật - Điều kiện vô trùng: + Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro. + Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. + Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgCl2 0,1% … để khử trùng. - Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH: + Ánh sáng  Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày .  Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy.  Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 13 1000 - 7000 Lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro.  Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm. + Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C . + pH pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng . 2.5.4.2.Thành phần nuôi cấy mô tế bào thực vật. - Nước: cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường dinh dưỡng. Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu. Nếu môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào hay meristem thì nên dùng nước cất 2 lần. Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô. Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn. 14 - Dinh dưỡng vô cơ: + Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng. + Theo thống nhất của Hội sinh lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng. Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật. + Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S). + Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo). + Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật. - Dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên + Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin… + Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid. + Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B. + Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh. - Đường: + Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật. Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối). 15 + Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường saccharose ở nồng độ 1-5%. Đường saccharose là dạng đường được tổng hợp và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy. Cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật. Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi mẫu cấy. - Vitamin + Vitamin là thành phần cũng rất quan trọng để cây có thể duy chì các hoạt động sống và phát triển bình thường. + Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid. + Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất [26]. + Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp. + Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon . - Agar + Agar là một loại polysacharit của tảo. Agar là chất keo đông thường được sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành. + Nồng độ của thạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 612 g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy. Ở 800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C thì trở về trạng thái gel. 16 + Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lít nước. Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng . - Chất điều hoà sinh trưởng + Auxin: Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp, trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus). Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy. + Cytokinin: Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (cytokinin tự nhiên). Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt. Zeatin làmột loại cytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rất đắt. Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ. + Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất .