Tài liệu Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly collagen từ da lợn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --------------------------- HOÀNG DUY KHÁNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI QUÁ TRÌNH TRÍCH LY COLLAGEN TỪ DA LỢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Trần Văn Chí THÁI NGUYÊN, 2015 THÁI NGUYÊN, 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài vừa qua, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô của bộ môn Công nghệ Thực phẩm thuộc khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đƣợc đề tài của mình. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Trầ n Văn Chí , đã hƣớng dẫn và chỉ dạy tận tình giúp em hoàn thành tốt đề tài và tích lũy vốn kiến thức hữu ích về chuyên ngành trong suốt thời gian qua. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô làm việc tại phòng thí nghiệm, các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K43 đã nhiệt tình giúp đỡ đóng góp ý kiến và tạo điều kiện tốt cho em trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Do bƣớc đầ u tiên tiế n hành trić h ly sản phẩ m collagen còn thiế u sót về kinh nghiê ̣m, kiế n thƣ́c và trong khoảng thời gian thƣ̣c hiê ̣n có ha ̣n lên không tránh đƣơ ̣c nhƣ̃ng sai sót . Kính mong quý thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến để đề tài hoàn thiện hơn. đƣơ ̣c Cuối cùng em xin kính chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe và chúc các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K43 báo cáo thành công luận văn của mình. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 28 tháng 5 năm 2015 Sinh viên thực hiện Hoàng Duy Khánh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác (số gốc/1000 gốc) ........................................................................................................5 Bảng 2.2: Ứng dụng của collagen hydrolysate trong công nghệ chế biến thịt .........15 Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng ......................................................................................19 Bảng 3.2: Hệ số chuyển đổi đạm tổng số của một số nguyên liệu ..........................29 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ Na 2SO4 đến nguyên liệu da lợn . ......................31 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ ispropyl tới quá trình loa ̣i béo . ........................33 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình loa ̣i béo . ....................................34 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ dung môi tới lƣợng collagen .............................35 thu đƣơ ̣c. ....................................................................................................................35 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của thời gian trích ly tới lƣợng collagen thu đƣợc . ..............37 Bảng 4.6 : Ảnh hƣởng của pH tới lƣơ ̣ng collagen thu đƣơ ̣c ....................................38 DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 2.1: Công thức cấu tạo của hydroxyproline ....................................................... 6 Hình 2.2: Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử Collagen ............................. 7 Hình 3.1 : Quy trình trích ly collagen từ da lợn ........................................................ 20 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cƣ́u lƣ̣a cho ̣n nồ ng đô ̣ Na2SO4 thích hợp ............................ 21 Hình 3.3: Sơ đồ thƣ̣c hiê ̣n phân tích xác đinh ̣ hàm lƣơ ̣ng ispropyl thích hơ ̣p . ......... 22 Hình 3.4: Sơ đồ thƣ̣c hiê ̣n thí nghiê ̣m xác đinh ̣ thời gian loa ̣i béo ........................... 23 Hình 3.5: Sơ đồ thƣ̣c hiê ̣n thí nghiê ̣m xác đinh ̣ nồ ng đô ̣ trić h ly .............................. 24 Hình 3.6: Sơ đồ thƣ̣c hiê ̣n thí nghiê ̣m xác đinh ̣ thời gian trić h ly ............................. 25 Hình 3.7: Sơ đồ thƣ̣c hiê ̣n xác đinh ̣ pH kế t tủa collagen .......................................... 26 Hình 4.1 : Biểu đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ Na 2SO4 đến mẫu nguyên liệu .............. 32 Hình 4.2 : Biểu đồ ảnh hƣởng của nồng độ ispropyl tới quá trin ̀ h loa ̣i béo ............. 33 Hình 4.4 : Biểu đồ ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ dung môi tới lƣơ ̣ng collagen thu đƣơ ̣c. 36 Hình 4.5 : Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian trić h ly tới lƣơ ̣ng collagen thu đƣơ ̣c. .. 37 Hình 4.6 : Biểu đồ ảnh hƣởng của pH tới lƣơ ̣ng collagen thu đƣơ ̣c ........................ 38 Hình 4.7 : Ảnh collagen thu đƣợc sau khi trích ly .................................................... 39 Hình 4.8: Biể u đồ thể hiê ̣n sƣ̣ thay đổ i đô ̣ nhớt của collagen theo nhiê ̣t đô ̣ ............. 39 Hình 4.9: Ảnh phân tích mẫu .................................................................................... 41 Hình 4.10 : Ảnh phân tích chỉ tiêu sinh hóa.............................................................. 42 MỤC LỤC PHẦN 1 MỞ ĐẦU ---------------------------------------------------------------------------- 1 1.1. Đặt vấn đề --------------------------------------------------------------------------------- 1 1.2. Mục đích nghiên cứu --------------------------------------------------------------------- 2 1.3. Yêu cầu của đề tài ------------------------------------------------------------------------ 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế --------------------------------------------------- 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học ----------------------------------------------------------------------- 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ----------------------------------------------------------------------- 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU --------------------------------------------------- 3 2. Cơ sở khoa học của đề tài ----------------------------------------------------------------- 3 2.1. Tổng quan về collagen ------------------------------------------------------------------- 3 2.1.1. Định nghĩa về collagen ---------------------------------------------------------------- 3 2.2. Cấ u ta ̣o collagen -------------------------------------------------------------------------- 4 2.3. Tính chất của collagen ------------------------------------------------------------------- 8 2.3.1. Tác dụng với nƣớc --------------------------------------------------------------------- 8 2.3.2. Tác dụng với acid và kiềm ------------------------------------------------------------ 8 2.3.3. Sự biến tính --------------------------------------------------------------------------- 10 2.3.4. Tính kỵ nƣớc -------------------------------------------------------------------------- 11 2.3.5. Tính chất của dung dịch keo -------------------------------------------------------- 11 2.3.6. Tính chất Hydrat hóa của collagen ------------------------------------------------ 11 2.4. Ứng dụng của collagen ---------------------------------------------------------------- 12 2.4.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm -------------------------------------------- 13 2.4.1.1. Ứng dụng của collagen trong công nghệ sản xuất bánh kẹo ----------------- 13 2.4.1.2. Ứng dụng của collagen trong sản xuất sữa ------------------------------------- 13 2.4.1.3. Ứng dụng collagen trong công nghiệp sản xuất đồ uống --------------------- 14 2.4.1.4. Ứng dụng collagen trong công nghiệp chế biến thịt -------------------------- 15 2.4.2. Ứng dụng trong y học và dƣợc phẩm ---------------------------------------------- 15 2.4.3. Ứng dụng trong công nghệ mỹ phẩm ---------------------------------------------- 17 PHẦN 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------- 19 3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ---------------------------------------------------- 19 3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu---------------------------------------------------------------- 19 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ------------------------------------------------------------------ 19 3.1.3. Hóa chất ------------------------------------------------------------------------------- 19 3.1.4 Nguyên liệu ---------------------------------------------------------------------------- 19 3.1.5. Dụng cụ -------------------------------------------------------------------------------- 19 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ---------------------------------------- 19 3.3. Nội dung nghiên cứu ------------------------------------------------------------------- 20 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi---------------------------------- 20 3.4.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ----------------------------------------------------- 20 3.4.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu ---------------------------------------------------------- 27 3.4.3. Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu lý hóa --------------------------------------- 27 3.4.3.1. Phƣơng pháp phân tić h Kendalh. ------------------------------------------------ 27 3.4.2.2. Phƣơng pháp phân tić h Soxhlet -------------------------------------------------- 29 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN -------------------------------------------------- 31 4.1. Kế t quả phân tić h mẫu da lơ ̣n --------------------------------------------------------- 31 4.2. Kế t quả xác đinh ̣ nồ ng đô ̣ dung môi Na 2SO4 xƣ̉ lý nguyên liê ̣u ----------------- 31 4.3. Kế t quả xác định nồng độ isopropyl dùng để loại béo . ---------------------------- 32 4.4. Kế t quả xác đinh ̣ thời gian loại béo -------------------------------------------------- 34 4.5. Kế t quả xác định nồng độ dung môi trích ly ---------------------------------------- 35 4.6. Kế t quả xác định thời gian trích ------------------------------------------------------ 36 4.8. Xác định nhiệt độ biến tính của collagen thu đƣợc---------------------------------37 4.7. Kế t quả xác đinh ̣ pH kế t tủa collagen------------------------------------------------38 PHẦN 5 KẾT LUÂN VÀ KIẾN NGHỊ -------------------------------------------------- 43 5.1. Kết luận ---------------------------------------------------------------------------------- 43 5.2. Kiến nghị -------------------------------------------------------------------------------- 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------------ 44 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây cùng với sự phát triển của đất nƣớc, nhu cầu sử dụng các sản phẩm chế biến từ thịt lợn ngày một tăng. Để đáp ứng nhu cầu sử dụng khác nhau của ngƣời tiêu dùng các sản phẩm công nghiệp chế biến từ thịt lợn ngày đa dạng và nhiều chủng loại các sản phẩm chế biến từ thịt lợn nhƣ: thịt hộp, giò chả, súc xích… Các sản phẩm này chỉ sử dụng phần thịt, thải ra môi trƣờng một lƣợng lớn da, xƣơng và các phế phụ phẩm khác gây ôi nhiễm môi trƣờng. Trong đó da lơn có chứa hàm lƣợng lớn collagen, có thể sử dụng nguyên liệu này để thu nhận collagen. Đây là một hƣớng đi mới nhiều triển vọng mang lại lợi ích về kinh tế và môi trƣờng. Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật và con ngƣời. Nó đƣợc phân bố trong các bộ phận nhƣ da, cơ, gân, sụn, dây chằng xƣơng và răng... Collagen là một loại protein chiếm tới 25% lƣợng protein trong cơ thể ngƣời, có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau. Nó đƣợc coi nhƣ là một chất keo dính các bộ phận trong cơ thể con ngƣời thành một khối hoàn chỉnh, nếu không có collagen cơ thể ngƣời chỉ là các phần rời rạc. Đối với da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và đƣợc phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da. Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da. Collagen đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trong đời sống. Trong công nghệ thực phẩm collagen là một phụ gia có tính an toàn với ngƣời sử dụng, collagen đƣợc ứng dụng trong nhiều sản phẩm chế biến với trò ổn định cấu trúc cho sản phẩm, tăng giá trị dinh dƣỡng, giá trị cảm quan cho sản phẩm, đa dạng hóa các sản phẩm, tạo ra các sản phẩm mới.... Đối với sản phẩm thực phẩm chức năng collagen đƣợc sử dụng nhiều trong các sản phẩm chức năng với mục đích chăm sóc sắc đẹp. Nhu cầu sử dụng của collagen ngày một lớn. Do đó việc nghiên cứu sản xuất collagen từ nguồn phế liệu từ các nhà máy, cơ sở chế biến thịt là rất cần thiết vừa đáp ứng nhu cầu sử dụng collgen vừa giải quyết vấn đề môi trƣờng. Từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly collagen từ da lợn” . 2 1.2. Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly collagen. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định đƣợc điều kiện xử lý nguyên liệu. - Xác định đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình trích ly. - Xác định đƣợc điều kiện thu nhận collagen. 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Xác định thông số kĩ thuật từ đó đƣa ra quy trình trích ly collagen từ da lợn bằng phƣơng pháp nghiên cứu và phân tích tại phòng thí nghiệm. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Tận dụng nguồn phế phụ phẩm trong sản xuất chết biến thịt lơn tạo ra sản phẩm có giá trị cao và góp phần giảm ô nhiễm môi trƣờng. - Tạo ra chế phẩm collagen có ứng dụng rộng rãi. - Góp phần làm phong phú phụ gia dùng trong thực phẩm. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2. Cơ sở khoa học của đề tài 2.1. Tổng quan về collagen 2.1.1. Đinh ̣ nghiã về collagen Chữ collagen bắt nguồn từ chữ Hy Lạp, nó gồm 2 thành tố đƣợc Latinh hoá. Tiếp đầu ngữ Kolla: colla có nghĩa là chất keo, và tiếp vị ngữ Gennan: gen có nghĩa là tạo ra Collagen có nghĩa đen là chất tạo keo[1]. Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hƣớng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc. Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 25% - 35% tổng lƣợng protein trong cơ thể ở các động vật có xƣơng sống. Collagen đƣợc phân bố trong các bộ phận nhƣ da, cơ, gân, sụn, răng, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ và là thành phần chính của dây chằng và gân,... Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (hơn 90% trong gân, xƣơng và khoảng 50% trong da) có chứa collagen[2]. Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và đƣợc phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da nhƣ : sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm,... Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da. Sự suy giảm về số lƣợng và chất lƣợng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đƣờng nhăn mảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đƣờng nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ[3]. Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống và tác động của môi trƣờng, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thƣơng, khi đó sợi collagen sẽ mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá hủy. Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng... 4 Collagen cũng đƣợc phân bố ở giác mạc, và tồn tại dƣới dạng tinh thể. Trong mô cơ, collagen chiếm khoảng từ 1% đến 2%. Trong cơ thể ngƣời, collagen chiếm từ 20 - 25% protein của cơ thể[4]. Collagen là thành phần chính của mô liên kết, có chức năng tạo độ vững chắc và đàn hồi. Collagen có tác dụng giống nhƣ một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể. Collagen cung cấp cho các mô liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó. Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hàn gắn vết thƣơng, là thành phần hoạt hoá các tiểu cầu trong máu và sự hình thành mạch. Thêm vào đó sự phát triển của một số bệnh di truyền đƣợc xác định là do sự đột biến trong cấu trúc gen của collagen. Những rối loạn trong quá trình tổng hợp hoặc phân giải collagen đều đƣợc ghi lại nhƣ là nguyên nhân của nhiều căn bệnh phức tạp nhƣ chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đƣờng và ung thƣ cũng nhƣ những bệnh có liên quan đến sự lão hoá. Collagen phân bố khắp nơi trong cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc. Trong gân và dây chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ cơ sang xƣơng và tích trữ năng lƣợng đàn hồi. Chính nhờ tính chất này mà cơ thể có thể di chuyển, vận động một cách nhịp nhàng và uyển chuyển. Collagen còn là chất nền hữu cơ có trong xƣơng và men răng giúp chúng chống lại sự rạn nứt. Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ. Bên cạnh các chức năng cơ học, ở giác mạc, thủy tinh thể, trật tự cấu trúc của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt duy trì thị lực[1]. Collagen đƣợc xem nhƣ một vật liệu mang tính xây dựng. Sự linh hoạt của nó là nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ những chức năng nhất định. Xét về mặt kinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất ra gelatine chất có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: Công nghệ Thực phẩm, y học và dƣợc phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nhiếp ảnh,... 2.2. Cấ u ta ̣o collagen Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại acid amin, bao gồm 20 loại acid amin (Schrieber và Gareis,2007). Thành phần acid amin có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc của collagen, nhƣng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy nhất cho tất cả collagen. Trong thành phần collagen không chứa cystein và trytophan, nhƣng chứa một lƣợng lớn glycine (Gly), chiếm khoảng 33% và proline (Pro), chiếm tỉ lệ 12% 5 và hydroxyproline (Hyp), chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian và Bowes 1977). Collagen là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành phần Collagen còn chứa khoáng, chiếm tỉ lệ 1%[1]. Bảng 2.1: So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác (số gốc/1000 gốc) (Nguồ n Schrieber và Gareis,2007) Collagen Casein Albumin Glycine 363 30 19 Alanin 107 43 35 Valine 29 54 28 Leucine 28 60 32 Isoleucine 15 49 25 Serin 32 60 36 Threonine 19 41 16 Cystein - 2 1 Methionine 5 17 16 Aspatic acid 47 63 32 Glutamic acid 77 153 52 Lycine 31 61 20 Hydroxylycine 7 - - Arginine 49 25 15 Histidine 5 19 7 Phennylalanine 15 28 21 Tyrosine 5 45 9 Trytophan - 8 3 Proline 131 65 14 Hydroxyproline 107 - - Proline và Hydroxyproline liên quan tới cấu trúc bậc 2 của collagen. Những amino acid này giúp giới hạn sự quay của bộ khung polypeptide, do đó góp phần tạo nên sự bền vững cho cấu trúc xoắn ốc bậc 3. Nhóm hydroxyl của hydroxylproline đóng vai trò quan trọng trong sự bền vững cấu trúc xoắn ốc bậc 3 của collagen. Polypeptide của collagen mà thiếu hydroxylproline sẽ tạo nên cấu trúc gấp khúc ở nhiệt độ thấp và sẽ không bền vững ở nhiệt độ thân nhiệt[2]. 6 Hydroxyproline là một acid amin đặc trƣng của collagen mà các loại protein khác không có. Hydroxyproline đƣợc hình thành sau quá trình điều chỉnh proline khi đƣợc kết hợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y. Hydroxyproline có công thức phân tử là C5H9NO3, khác với proline, trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn nhóm OH nằm ở vị trí cacbon gamma, acid amin này có vai trò quan trọng trong sự ổn định cấu trúc của collagen, là dẫn xuất của proline trong quá trình hình thành chuỗi collagen có sự xúc tác của enzyme hydroxylase proline và sự có mặt của Vitamin C để giúp bổ sung thêm Oxy, thiếu vitamin C sẽ làm chậm quá trình tổng hợp hydroxyproline, ảnh hƣởng đến quá trình xây dựng cấu trúc protein gây ra những rối loạn trong cơ thể. Hình 2.1: Công thức cấu tạo của hydroxyproline Phân tử collagen bao gồm 3 chuỗi xoắn lại với nhau tạo thành collagen triple-helix tạo thành cấu trúc 3D- một mô hình lý tƣởng cho các liên kết hydro giữa các chuỗi (Te Nijenhuis, 1997). Mỗi chuỗi trong triple- helix quay theo chiều kim đồng hồ. Triple-helix dài xấp xỉ 300nm và chuỗi có khối lƣợng phân tử khoảng 105 kDa (Papon, Leblon và Meijer, 2007). Triple-helix đƣợc ổn định bởi liên kết hydro nội giữa các chuỗi. Trong cấu trúc phân tử collagen, do tƣơng tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nƣớc và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nƣớc làm trƣơng nở collagen. Sự biến tính collagen làm cho các cầu nối bị tách một phần hoặc hoàn toàn gây nên sự tách rời các chuỗi do phá hủy các liên kết hydro, chính điều này làm mất đi cấu trúc triple-helix. Mô hình “triple-helice” của collagen dựa trên những nghiên cứu về hiện tƣợng nhiễu xạ sợi. Chuỗi nhiễu xạ sợi thể hiện trên mức trung bình của toàn bộ phân tử collagen, và mô hình đặc trƣng thể hiện đó là sự sắp xếp lặp đi lặp lại của các chuỗi polypeptid, thông thƣờng là Gly-Pro-Hyp. Một đặc điểm đặc trƣng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino acid trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Mỗi sợi collagen này đƣợc cấu tạo từ ba chuỗi polypeptid nối với nhau giống nhƣ sợi dây thừng. Cấu trúc của collagen tƣơng tự nhƣ hình xoắn ốc, mỗi một chuỗi polypeptid trong collagen 7 đƣợc cấu tạo từ các acid amin theo một trật tự, thông thƣờng là Gly - Pro - Y, hoặc Gly - X - Hyp[1]. Hình 2.2: Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử Collagen Trong đó X, Y là những đơn vị aminoacid khác nhau, có thể là proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chiều dài chuỗi. Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và nó đƣợc phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành nên một đƣờng xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline và glycine đã chiếm ½ chuỗi Collagen. Các acid amin còn lại chiếm ½ [2]. Collagen cũng chứa các đơn vị carbonhydrate, cả monosaccharide galactose hoặc disaccharide glucosylgalactose, liên kết với phần dƣ hydroxylysine thông qua nhóm hydroxyl chức năng của amino acid. Tỷ lệ của mono/disaccharide phụ thuộc vào loại collagen và tình trạng sinh học. Chức năng của các đơn vị carbohydrate vẫn chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ, nhƣng ảnh hƣởng của chúng trong việc gắn kết phần bên phân tử collagen hình thành nên sợi và bán kính của sợi đang đƣợc nghiên cứu[3]. Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùng gồm khoảng 9  26 amino acid tại các điểm đầu mút amino hay carboxyl của chuỗi. Các vùng này không sáp nhập với cấu trúc xoắn ốc và đƣợc gọi là telopeptide. 8 2.3. Tính chấ t của collagen Collagen là một protein cấu trúc. Chính vì vậy collagen cũng có đầy đủ các tính chất hóa lý của một protein. 2.3.1. Tác dụng với nước Collagen không hòa tan trong nƣớc mà nó hút nƣớc để nở ra, nguyên nhân là do tƣơng tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nƣớc và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nƣớc làm trƣơng nở collagen. Cứ 100g collagen khô có thể hút đƣợc khoảng 200g nƣớc. Collagen kết hợp với nƣớc nở ra trong nƣớc, độ dày tăng lên chừng 25% nhƣng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 - 3 lần[5]. Do nƣớc phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liên kết phối trí của collagen làm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3 - 4 lần[4]. Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptide tƣơng đối nhỏ. Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 - 650C collagen hút nƣớc bị phân giải. Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chƣa xử lý tƣơng đối cao. Khi nguyên liệu đã khử hết chất khoáng, thì nhiệt độ phân giải của nguyên liệu sẽ giảm xuống[3]. 2.3.2. Tác dụng với acid và kiềm Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch của collagen có gốc carboxyl và amin. Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó. Trong điều kiện có acid tồn tại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp). Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+. Môi trƣờng H+ COOH NH3+…Cl- NH3+…Cl- COOH NH3+…Cl- NH3+…Cl- COOH 9 Môi trƣờng OHCOO-…Na+ COO-…Na+ NH2 COO-…Na+ NH2 NH2 COO-…Na+ NH2 Trong điều kiện có nƣớc, nƣớc có thể tác dụng với nhóm gốc có mang điện trong kết cấu protide và những ion Na+, Cl- hình thành tác dụng hợp nƣớc phụ của collagen, khiến collagen trong môi trƣờng acid, kiềm có độ hút nƣớc cao hơn trong nƣớc nguyên chất. Ngoài ra acid và kiềm có thể làm cho collagen biến đổi nhƣ sau: + Na+ - OH H+ H3N OOC + H3N NH3+ COONH3+ HO- H+ Cl- H+ OH- Na HO- H+ Cl- H+ OH- H+ OH- - Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa -NH3+…COO-) làm đứt mạch peptide trong mạch chính. - Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc -CO…NH- của mạch xung quanh nó. - Làm acid amin bị phân hủy giải phóng amoniac. Cùng với những biến đổi đó, điểm đẳng điện của collagen hạ xuống thấp, (vì những biến đổi đó mang tính chất thủy phân làm cho các nhóm gốc có tính hoạt động tăng lên nhiều)[7]. Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen, nhƣng sự phân hủy của collagen cho tới nay vẫn chƣa có khái niệm chính xác. Để biểu thị sự biến đổi chính xác của collagen dƣới tác dụng của acid, kiềm nói chung đều dùng độ keo phân giải làm chỉ tiêu. Độ keo phân giải là chỉ số keo sinh thành sản phẩm có thể tan trong nƣớc (thƣờng là trong điều kiện đun nóng), những sản phẩm này dƣới nồng độ tƣơng ứng tiến hành làm lạnh có thể biến thành keo. Theo kết quả nghiên cứu tác dụng của vôi đối với collagen có thể làm tăng độ phân giải của nó rất mạnh, trong điều kiện nhiệt độ thƣờng thời gian dài có thể 10 xúc tiến sự phân giải của collagen (tùy độ phân giải của nó rất thấp) lúc nhiệt độ tăng lên hoặc xử lý bằng kiềm thì độ phân giải tăng lên[6]. Collagen phân giải biến thành gelatin, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành nhƣ sau: C102H149N31O38 + H2O (Collagen) to ;xt C102H151N31O39 (Gelatin) Lúc xử lý ở nhiệt độ cao trong nƣớc, keo dễ tiếp tục thủy phân thành: C102 H151N31 O39 + 2H2O to C55 H85 N17O22 + C47 H70O19 + 7N2 (Gelstose) (Gletone) Từ đó thấy rằng trong quá trình trích ly gelatin cần thiết phải khống chế nhiệt độ và thời gian thích hợp để đảm bảo chất lƣợng của gelatin. Ngoài ra, Collagen trong dung dịch muối trung tính cùng với gốc -COOH và -NH2 tạo thành các hợp chất muối. Tác dụng phân giải collagen của NaCl so với Na2SO4 mạnh hơn (do độ điện ly của NaCl lớn hơn). Nhiều thực nghiệm cho thấy rằng tác dụng của trypsine đối với collagen đã xử lý (nhƣ đun nóng, ngâm acid, kiềm, muối, tác dụng của pepsin, tác dụng cơ học,...) thì nó có tác dụng phân giải, với điều kiện thích hợp nhất là ở nhiệt độ 370C, pH = 8.1 – 8.2. 2.3.3. Sự biến tính Dƣới tác dụng của các chất hóa học nhƣ axit, bazơ, muối, các dung môi nhƣ ancohol, các tác nhân vật lý nhƣ khuấy trộn cơ học, nghiền, tia cực tím,… Cấu trúc xoắn bậc ba của collagen bị biến đổi làm cho các liên kết hydro, các liên kết ion bị phá vỡ nhƣng không phá vỡ đƣợc liên kết peptid, tức là cấu trúc bậc một vẫn giữ nguyên[2]. Sau khi bị biến tính Collagen thƣờng có các tính chất sau : - Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ H2O vốn ở bên trong phân tử protein. Tức là khi collagen chƣa biến tính, các acidamin có các nhóm kỵ nƣớc nằm bên trong phân tử collagen. Khi bị biến tính, phân tử Collagen lúc này chỉ là trình tự sắp xếp các acid amin mạch thẳng, làm cho các nhóm kỵ nƣớc lộ ra ngoài nên độ hòa tan cả collagen bị giảm đi. - Khả năng giữ nƣớc giảm, cấu trúc bậc bốn giúp cho collagen có khả năng hydrat hóa tạo thành màng hydrat bao quanh. Khi biến tính mất đi cấu trúc bậc bốn thì khả năng hydrat hóa không còn, vì thế nên collagen giữ nƣớc kém. 11 - Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi. Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học của một protein đƣợc quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn. Khi cấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptid, và không có hoạt tính sinh học[4]. - Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease. - Tăng độ nhớt hiện tại. - Mất khả năng kết tinh, collagen có khả năng kết tinh trong các môi trƣờng muối hoặc cồn. Ở các điều kiện pH nhất định dung dịch collagen không bền và kết tinh gọi là pH đẳng điện. Khi bị biến tính điểm đẳng điện của protein không còn và chúng khó có thể kết tinh. 2.3.4. Tính kỵ nước Do các gốc kỵ nƣớc của acidamin trong chuỗi polypeptid của collagen hƣớng ra ngoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ H2O. Độ kỵ nƣớc có thể giải thích là do các acidamin có chứa gốc R-không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nƣớc[1]. Tính kỵ nƣớc sẽ ảnh hƣởng rất nhiều đến tính tan của collagen. 2.3.5. Tính chất của dung dịch keo Khi hòa tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm[5]. Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo là : - Sự tích điện cùng dấu của các protein. - Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein. Khi dung dịch keo không bền, sẽ có hai dạng kết tủa : kết tủa thuận nghịch và kết tủa không thuận nghịch. - Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền nhƣ ban đầu. - Kết tủa không thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững nhƣ trƣớc nữa. Dung dịch collagen có độ nhớt cao trong khoảng pH = 2 -5, trong đó pH = 2 cho độ nhớt cao nhất, điều này giúp cho việc nghiên cứu, tách chiết collagen[3]. 2.3.6. Tính chất Hydrat hóa của collagen Trong quá trình hydrat hóa, protein tƣơng tác với nƣớc qua các nối peptid hoặc các gốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro. Nồng độ protein, pH, nhiệt độ, thời 12 gian, lực ion, sự có mặt của các thành phần khác là những yếu tố ảnh hƣởng đến các phản ứng protein - protein và protein - nƣớc. Khi nồng độ protein tăng thì lƣợng nƣớc hấp thụ tống số tăng, pH thay đổi dẫn đến thay đổi mức độ ion hóa và sự tích điện trên bề mặt phân tử Collagen, làm thay đổi lực hút và lực đẩy giữa các phân tử này và khả năng liên kết với nƣớc[7]. Khi nhiệt độ tăng thì khả năng giữ nƣớc của Collagen giảm do làm giảm các liên kết hydro. Ngoài ra, bản chất và nồng độ các ion gây ảnh hƣởng đến lực ion trong môi trƣờng và sự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử Collagen nên cũng ảnh hƣởng đến khả năng hydrat hóa. Ngƣời ta nhận thấy có sự cạnh tranh của phản ứng giữa nƣớc, muối và các nhóm ngoại của acid amin. Khi nồng độ muối thấp, tính hydrat hóa của protein có thể tăng do sự đính thêm các ion giúp mở rộng mạng lƣới protein. Tuy nhiên khi nồng độ muối cao, các phản ứng muối - nƣớc trở nên nổi trội hơn, làm giảm liên kết protein - nƣớc và protein bị “sấy khô”[2]. 2.4. Ứng dụng của collagen Collagen là một dạng protein cấu trúc sợi dài và hầu hết các chức năng của nó khác với dạng dạng protein phổ biến khác nhƣ enzym. Những bó collagen hay còn gọi là những sợi collagen là thành phần chính của thể nền màng tế bào cấu tạo nên hầu hết các mô và cấu trúc bên ngoài của tế bào, nhƣng collagen cũng đƣợc tìm thấy bên trong của tế bào. Collagen có cƣờng độ kéo đứt rất lớn và là thành phần chính của băng trong y học, gân, sụn, xƣơng, dây chằng và da. Cùng với keratin mềm, là nguyên nhân tạo ra độ dẻo dai và đang hồi của da và nếu nó thoái hóa sẽ gây ra nếp nhăn dẫn đến tuổi già. Nó tạo nên độ bền của thành mạch máu và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển mô tế bào. Nó có trong giác mạc, thủy tinh thể của mắt. Collagen cũng đƣợc dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ và phẫu thuật bỏng. Collagen đã thủy phân có thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh cân nặng, giống nhƣ protein khi ta dùng nó có cảm giác cung cấp đủ năng lƣợng[4]. Collagen thủy phân gọi là collagen hydrolysate. Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen có các ứng dụng khác nhau. Collagen hydrolysate đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, và công nghiệp nhiếp ảnh. Chúng đƣợc sử dụng nhƣ chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm. Chúng đƣợc dùng nhƣ chất thay thế cao su, keo dán, xi măng, mực in lụa nhân tạo, là chất tạo kết dính trong diêm quẹt. Chúng đƣợc dùng trong bộ lọc sáng cho đèn thủy ngân,… 13 2.4.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.4.1.1. Ứng dụng của collagen trong công nghệ sản xuất bánh kẹo Collagen đƣợc dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dƣỡng, thực phẩm chức năng. Dĩ nhiên chúng phải trải qua một quá trình chế biến để đạt đƣợc những tính chất ứng dụng mong muốn, nhƣ tính tan chảy ở nhiệt độ cao và đông đặc ở nhiệt độ thấp, lúc này collagen đóng vai trò một chất keo bảo vệ ngăn chặn sự kết tinh của đƣờng. Chính vì vậy mà trong các ứng dụng ngƣời ta thƣờng sử dụng chủ yếu là dạng thủy phân của collagen, đƣợc gọi là collagen hydrolysate. Công nghiệp sản xuất bánh kẹo có lẽ là lĩnh vực có nhiều ứng dụng của collagen hydrolysate nhất tính cho đến hiện nay. Collagen hydrolysate đƣợc sử dụng trong các sản phẩm bánh kẹo ngọt nhƣ: “winegums”, “gummy bears”, “fruit chews”, “marshmallow” và “licoride”. Chức năng của collagen hydrolysate phụ thuộc vào loại sản phẩm. Chẳng hạn nhƣ trong “marshmallows”, collagen đóng vai trò làm bền bọt. Trong “fruit chews” và “licoride”, collagen tham gia tạo cấu trúc, độ dai cho sản phẩm,... 2.4.1.2. Ứng dụng của collagen trong sản xuất sữa Trong công nghiê ̣p sản xuấ t sƣ̃a collagen hydrolysate đƣợc sử dụng nhƣ một phụ gia tạo cấu trúc trong công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa. Chức năng của chúng là: - Tạo các mối liên kết với nƣớc: collagen có khả năng trƣơng nở để tạo liên kết gấp 5 lần khối lƣơng của chúng với nƣớc. Nó giúp ngăn cản sự rỉ nƣớc trong các sản phẩm sữa[8]. - Củng cố cấu trúc cho các sản phẩm sữa : collagen không tạo phản ứng với các thành phần của sữa và phụ thuộc vào hàm lƣợng sử dụng, collagen có thể làm chặt cấu trúc cream, tạo lớp gel chắc từ dịch lỏng[3]. Ngoài ra nó còn giúp ổn định các bọt khí của các sản phẩm từ sữa có bọt ở nhiệt độ thấp và ngăn cản sự hỏng cấu trúc cho sản phẩm trong suốt quá trình tồn trữ. - Giống nhƣ các loại protein khác, collagen có khả năng tao bọt tốt khi có mặt của đƣờng và sữa. Sự có mặt của chất béo có xu hƣớng ngăn cản sự tạo bọt, vì vậy cần phải sử dụng thêm các phƣơng pháp vật lý nhƣ : bơm không khí, khí CO 2, khí N2 để tăng thể tích và tạo bọt cho các sản phẩm sữa có bọt. Và chính collagen cũng tham gia vào quá trình ổn định, sự bền chặt cho các sản phẩm sữa có bọt. 14 - Collagen không mùi do đó không ảnh hƣởng đến mùi vị của sản phẩm. Nó không chịu sự tấn công của tác nhân oxy hóa, có khả năng ngăn cản sự biến tính và lƣu giữ đƣợc mùi trái cây cho sản phẩm. - Collgen đóng vai trò nhƣ một chất keo làm nhiệm vụ bảo vệ vì sự đông tụ của sữa và casein sẽ hoàn toàn hơn và đồng nhất hơn khi có mặt của collagen. Đồng thời khi có mặt một hàm lƣợng nhỏ của collagen trong các sản phẩm sữa thì cấu trúc của sản phẩm sẽ trở nên mềm mại hơn[4]. Bột collagen hydrolysate sẽ đƣợc hòa trộn với các thành phần khác nhƣ : đƣờng, các chất tao hƣơng, một số chất ổn định khác rồi đƣa vào dung dịch sữa. Hỗn hợp sữa nguội này đƣợc khuấy trộn, khi đó collagen sẽ trƣơng nở và hấp thu một lƣợng nƣớc gấp 10 lần khối lƣợng của chúng, trong quá trình thanh trùng thì collagen sẽ đƣợc hòa tan. Tuy nhiên, khi sữa đƣợc lọc trƣớc quá trình thanh trùng thì tốt nhất nên đƣa collagen vào dƣới dạng dung dịch nếu không thì quá trình lọc sẽ loại bỏ những hạt collagen còn đang trƣơng nở. Dung dịch collagen cũng có thể thêm vào sữa nguội kèm theo sự khuấy trộn liên tục. Collagen có thể thêm vào sữa trƣớc khi cấy giống mà không ảnh hƣởng đến các điều kiện lên men, collagen không phản ứng với các thành phần của sữa và không tạo kết tủa. Collagen là một loại protein, do đó nó có khả năng bị thủy phân bởi các tác nhân nhƣ : nhiệt độ, acid, kiềm, các tia phóng xạ, enzyme, vi sinh vật. Nhƣng nhìn chung độ mạnh của gel bị phá hủy khi collagen chịu tác dụng đồng thời của pH (nhỏ hơn 4) và nhiệt độ (lớn hơn 60oC) trong một khoảng thời gian đủ lớn. Do đó quá trình tiệt trùng, thanh trùng độ acid của sản phẩm từ sữa thƣờng không ảnh hƣởng nhiều đến tác dụng của collagen trong sản phẩm[8]. 2.4.1.3. Ứng dụng collagen trong công nghiệp sản xuất đồ uống Các thức uống nhƣ rƣợu, rƣợu trái cây, các sản phẩm nƣớc quả chƣa lên men có chứa các thành phần không hòa tan làm đục sản phẩm thƣờng không đạt hiệu quả cao nếu dùng phƣơng pháp lọc để loại bỏ. Từ thời nên văn minh La Mã hoặc cũng có thể là vào trƣớc đó, collagen hydrolysate đƣợc sử dụng cho quá trình lọc trong rƣợu. Collagen hydrolysate là tác nhân tinh sạch phổ biến trong quá trình sản xuất rƣợu vang đỏ. Khi đƣợc bổ sung vào sản phẩm collagen hydrolysate có tác dụng nâng cao thời gian bảo quản sản phẩm, với khả năng tạo tủa nhanh và tạo cho rƣợu có màu sáng mà không biến đổi màu đặc trƣng của sản phẩm[2].