Nghiên cứu một số loại thảo dược phòng bệnh vi khuẩn aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm (chitala chitala)

  • Số trang: 63 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 10 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM MINH KHÁ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC PHÒNG BỆNH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM MINH KHÁ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC PHÒNG BỆNH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala chitala) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. TỪ THANH DUNG 2013 Lời cảm tạ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Bộ môn Bệnh Học Thủy SảnTrường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt đề tài. Cảm ơn cha mẹ, gia đình và người thân của tôi đã ủng hộ rất nhiều về mặt tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập. Cảm ơn anh Nguyễn Bảo Trung, Chị Trần Thị Mỹ Hân, bạn Nguyễn Minh Thuật lớp NTTS TT- K35 và tập thể lớp Bệnh học thủy sản K36 đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ và chia sẻ với tôi trong suốt quá trình học tâp cũng như trong thời gian tôi thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn! Phạm Minh Khá i Tóm tắt Đề tài nhằm tìm hiểu hoạt tính kháng khuẩn của ba loại thảo dược (Diệp hạ châu, cỏ mực và lá ổi) nhằm đánh giá khả năng dùng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá. Xác định tính kháng khuẩn của thảo dược với vi khuẩn A. hydrophila được thực hiện với 3 loại dược (Cỏ mực, diệp hạ châu, lá ổi) và pha loãng ở 3 nồng độ khác nhau 25, 50 và 100%. Thí nghiệm được thực hiện bằng hai phương pháp là khuếch tán và đục lỗ trên đĩa thạch, trong đó chỉ có phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch cho được kết quả tốt với diệp hạ châu có vòng kháng khuẩn mạnh nhất là 15mm ở nồng độ 50 và 100%, thấp nhất là lá ổi không có vòng kháng khuẩn. Cá thát lát còm giống khỏe sau khi được thuần trong bể thì tiến hành bố trí thí nghiệm, bao gồm 6 nghiệm thức có bổ sung thảo dược (Cỏ mực 3ml, 6ml; diệp hạ châu 3ml, 6ml; lá ổi 3ml, 6ml) và một nghiệm thức đối chứng (Không thảo dược). Trong thí nghiệm này tiến hành thu mẫu 2 đợt để phân tích các chỉ tiêu huyết học là sau 3 tuần bổ sung thảo dược và sau khi cảm nhiễm. Kết quả ở các nghiệm thức bổ sung thảo dược thì tế bào hồng cầu tăng sau 3 tuần và giảm sau khi cảm nhiễm, tổng tế bào bạch cầu và bạch cầu đơn nhân thì tất cả đều tăng trước và sau khi cảm nhiễm. Bên cạnh đó, tỉ lệ chết đối với cá có bổ sung thảo dược có số cá chết thấp hơn nghiệm thức không bổ sung thảo dược, thấp nhất là ở nghiệm thức cỏ mực 15% so với cá không có bổ sung thảo dược là 65%. ii Mục lục Lời cảm tạ ..................................................................................................................... i Tóm tắt ......................................................................................................................... ii Mục lục........................................................................................................................ iii Danh sách bảng và hình ............................................................................................... v Danh mục từ viết tắt .................................................................................................... vi CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1 1.1 Giới thiệu ........................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài .................................................................................................... 2 1.3 Nội dung đề tài ................................................................................................... 2 Chương II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .......................................................................... 3 2.1 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng và sinh sản của cá thát lát còm ........................ 3 2.1.1 Đặc điểm phân loại...................................................................................... 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng, sinh sản ................................................... 3 2.2 Một số bệnh trên cá thát lát còm ........................................................................ 4 2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila ....................................................................... 5 2.4 Tổng quan về cây diệp hạ châu, cây cỏ mực, lá ổi và ứng dụng ........................ 6 2.4.1 Cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) .................................................... 6 2.4.2 Cây cỏ mực (Eclipta alba) .......................................................................... 7 2.4.3 Cây ổi (Psidium guajava)............................................................................ 8 2.4.4 Chiết xuất thảo dược ................................................................................... 9 2.4.5 Các nghiên cứu về thảo dược ...................................................................... 9 2.5 Các chỉ tiêu huyết học ...................................................................................... 12 2.5.1 Hồng cầu ................................................................................................... 12 2.5.2 Bạch cầu .................................................................................................... 13 2.5.3 Các nghiên cứu về các chỉ tiêu huyết học ................................................. 14 Chương III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 16 3.1.1 Thời gian ................................................................................................... 16 3.1.2 Địa điểm thực hiện .................................................................................... 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 17 3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn ......................................................... 17 3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá ........................................................................... 17 3.3.3 Định danh vi khuẩn ................................................................................... 17 3.3.4 Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila. ........................................................................... 17 3.3.5 Thí nghiệm tác dụng của thảo dược phòng bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm ....................................................... 18 3.3.5 Định lượng và định tính hồng cầu và bạch cầu ......................................... 20 3.4 Phương pháp xử lý số liệu................................................................................ 22 Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23 4.1 Kết quả kiểm tra tính nhạy của thảo dược trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila ................................................................................................................................ 23 4.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây diêp hạ châu, cỏ mực, lá ổi lên các chỉ tiêu huyết học của cá thát lát còm ................................................................................. 24 4.2.1 Hồng cầu ................................................................................................... 25 4.2.2 Bạch cầu .................................................................................................... 26 4.3 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila ...................................... 29 iii 4.4 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây diêp hạ châu, cỏ mực, lá ổi lên các chỉ tiêu huyết học của cá thát lát còm cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila .......... 30 4.4.1 Hồng cầu ................................................................................................... 30 4.4.2 Bạch cầu .................................................................................................... 31 4.5 Kết quả tái định danh vi khuẩn ........................................................................ 32 Chương V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................... 34 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 34 5.2 Đề xuất ............................................................................................................. 34 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 35 Phần phụ lục ............................................................................................................... 39 Phụ lục 1..................................................................................................................... 39 Phụ lục 2..................................................................................................................... 43 Phụ lục 3..................................................................................................................... 45 Phụ lục 4..................................................................................................................... 46 Phụ lục 5..................................................................................................................... 47 Phụ lục 6..................................................................................................................... 48 Phụ luc 7..................................................................................................................... 50 Phụ lục 8..................................................................................................................... 52 Phụ luc 9..................................................................................................................... 54 iv Danh sách bảng và hình Hình 2.1: Cá thát lát cườm………………………………………….………….........3 Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila………………….…....5 Hình 2.2 Aeromonas hydrophila……………….……………………………….........5 Hình 2.3 Diệp hạ châu…………………………………………………......…………6 Hình 2.4 Cỏ mực…………………………………………………………….......…...7 Hình 2.5 Lá ổi……………………………………………………………………...…8 Hình 3.1 A. Bố trí thí nghiệm cho ăn; B. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm……….…....20 Hình 3.2 Thao tác lấy mẩu máu và trải mẫu………………………………………...21 Hình 3.3 Buồng đếm hồng cầu……………………………………………………...22 Hình 4.1 (A)Vi khuẩn Aeromonas hydrophila, (B) nhuộm Gram vi khuẩn ………..23 Hình 4.2 Kiểm tra thảo dược với vi khuẩn Aeromonas hydrophila……………..…23 Hình 4.3 Kết quả kiểm tra thảo dược với vi khuẩn Aeromonas hydrophila. (A) diệp hạ châu, (B) cỏ mực ……………………………………………………………..….24 Hình 4.4 Hồng cầu trên cá thát lát còm (100X)……………………………………..25 Hình 4.5 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược………………………….…………………………….......26 Hình 4.6 Các loại bạch cầu trên cá thát lát còm (100X)…………………………….27 Hình 4.7 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược………………………….…………………..........27 Hình 4.8 Bạch cầu đơn nhân (100X)………………………………………………..28 Hình 4.9 Biểu đồ về sự thay đổi số lượng bạch cầu đơn nhân giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược……………………………….……….........…28 Hình 4.10 Tỉ lệ cá chết tích lũy (%) theo giờ cảm nhiễm…………………………...29 Hình 4.11 Sự thay đổi số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila .....................................................................................................................................31 Hình 4.12 Sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila………………………………………………………...…………………32 Hình 4.13 Sự thay đổi số lượng bạch cầu đơn nhân giữa các nghiệm thức bổ sung và không bổ sung thảo dược không và sau cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila………………………………………..……………………………….....32 Hình 4.14 Cá thát lát còm có dấu hiệu xuất huyết…………………………..………33 Hình 4.15 (A) Nhuộm Gram vi khuẩn A.hydrophila, (B) test chỉ tiêu O/F của vi khuẩn A.hydrophila………………………………………………………. ……......34 v Danh mục từ viết tắt ĐBSCL ĐVTS NTTS NA TSA BHI-B NaCL CFU DHC TBC BCĐN Đồng bằng sông cửu long Động vật thủy sản Nuôi trồng thủy sản Nutrient agar Tryptic soy agar Brain heart infusion broth Natri clorua Colony Forming Units Diệp hạ châu Tổng bạch cầu Bạch cầu đơn nhân vi CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Việt Nam là nước có nền kinh tế nông nghiệp pháp triển lâu đời. Bên cạnh ngành nông nghiệp lúa nước thì thủy sản cũng góp phần đáng kể trong phát triển kinh tế với kinh ngạch xuất khẩu đạt 6,13 tỷ USD (Vasep, 2012). Trong đó, nghề nuôi cá thát lát còm cũng đã giúp nhiều cho sự phát triển của ngành nuôi thủy sản. Theo số liệu thống kê diện tích nuôi cá thát lát ở Hậu Giang hiện đang tăng dần theo từng năm. Điển hình là ở huyện Phụng Hiệp (2011) toàn huyện có khoảng 1,3 ha thì đến năm 2013 toàn huyện đã có khoảng 10 ha. Phong trào nuôi cá thát lát còm phát triển trên nhiều tỉnh thành ở ĐBSCL như: Hậu Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An,…nhưng khu vực phân bố tự nhiên cá thát lát còm nhiều hơn có lẽ là vùng thuộc tỉnh Hậu Giang hiện nay. Ngoài giá trị làm thực phẩm, cá thát lát còm còn được nuôi để làm cá cảnh. Tình hình nuôi ngày càng phát triển đòi hỏi chúng ta phải có thêm nhiều nghiên cứu về sản xuất giống, thức ăn, chăm sóc, quản lý môi trường cũng như dịch bệnh. Tuy nhiên, với tình hình nuôi thâm canh ngày càng phổ biến, dịch bệnh đang là vấn đề gây khó khăn cho các hộ nuôi. Cho đến nay, các bệnh trên cá thát lát còm chưa được quan tâm và đầu tư nghiên cứu đúng mức. Kết quả nghiên cứu còn rời rạc, các công trình nghiên cứu về bệnh trên đối tượng này còn hạn chế. Mức độ thiệt hại, tình trạng bộc phát bệnh, cũng chưa được ghi nhận nhiều. Hiện nay, trên thực tế khi bệnh xuất hiện thì đa số người nuôi chủ yếu sử dụng các loại hóa chất và thuốc kháng sinh để điều trị là phổ biến. Nhưng việc sử dụng không đúng cách không mang lại hiêu quả trong việc điều trị mà ngược lại gây ra hiện tượng kháng thuốc ngày càng nghiêm trọng. Việc điều trị bệnh như vậy, không những ảnh hưởng đến môi trường mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng do sự tồn lưu thuốc trong sản phẩm thủy sản. Bên cạnh đó việc nghiên cứu sử dụng cây cỏ, thảo dược thay thế thuốc kháng sinh, bổ sung vào thức ăn cho động vật thủy sản đang rất được quan tâm. Năm 2010, Nguyễn Quang Linh tạo ra được một chế phẩm sinh học từ lá trầu không với tên gọi Bokashi- trầu có khả năng phòng trị một số bệnh cho ĐVTS, an toàn sinh học và thân thiện với môi trường. Chế phẩm từ thảo dược thường là hỗn hợp các chất chiết xuất từ nhiều loại thảo dược khác nhau. Các hoạt chất trong thảo dược hoạt động như là một chất kháng khuẩn hay chất chống oxy 1 hóa. Nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong thú y và người vì đây là các sản phẩm tự nhiên, an toàn cho người sử dụng mà còn rất có giá trị. Theo Từ Thanh Dung (1996), đã nghiên cứu cảm nhiễm A. hydrophila với các loại thảo dược đinh hương, cây chó đẻ, xiên tâm liên, cây nhọ nồi và một số cây bản địa tại Thái Lan. Hiện nay hầu hết các nghiên cứu về thảo dược trong nuôi trồng thủy sản chủ yếu tập trung vào cải thiện sức khỏe và bảo vệ gián tiếp cho tôm chống lại các dịch bệnh và mầm bệnh, còn việc sử dụng thảo dược để phòng và trị bệnh trên cá thì còn khá hạn chế. Xuất phát từ những thực tế đó, đề tài “Nghiên cứu một số loại thảo dược phòng bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá thát lát còm (Chitala chitala)” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Tìm hiểu hoạt tính kháng khuẩn của một số loại thảo dược nhằm đánh giá khả năng dùng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá. 1.3 Nội dung đề tài Kiểm tra tính nhạy của thảo dược (Lá ổi, cỏ mực, diệp hạ châu) trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Thí nghiệm tác dụng của thảo dược phòng bệnh xuất huyết trên cá thát lát còm (Chitala chitala). 2 Chương II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng và sinh sản của cá thát lát còm 2.1.1 Đặc điểm phân loại Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), cá thát lát còm thuộc hệ thống phân loại như sau: nghành có dây sống Chordata, lớp cá xương Osteichthyes, bộ Osteoglossiformes, họ Notopteridae, giống Chitala, loài Chitala chitala. Tên khoa học khác: Notopterus chitala (Hamilton, 1822). Tên địa phương: Cá thát lát cườm, cá nàng hai, cá còm,… Hình 2.1 Cá thát lát còm (nguồn: diendancacanh.com) 2.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh trưởng, sinh sản Cá thát lát còm hay cá nàng hai có nhiều ưu điểm hơn các loài cá thát lát khác: kích thước lớn, tăng trưởng nhanh, thời gian nuôi ngắn, thịt có chất lượng cao. Cá thát lát còm có dạng: thân dẹp ngang viền lưng cong rất rõ, viền bụng có gai, đầu nhỏ nhưng miệng tương đối rộng, vây bụng bị thoái hóa, vây lưng nhỏ nằm khoảng giữa thân, vi hậu môn dài liền với vây đuôi tạo thành một đường viền mỏng. Vẩy tròn nhỏ, đường hoàn toàn. Cá có phần thân giữa to, nhỏ ở phần đầu và đuôi. Phần đầu nhỏ, chỉ chiếm khoảng 1/8 cơ thể cá. Đầu và lưng cá có màu xanh rêu, hai bên hông và bụng màu trắng, có một đôi râu mũi ngắn, mắt nằm lệch về phía lưng của đầu. Cá thát lát còm phân bố ở nhiều nước như Ấn Độ, Thái Lan, Myanma, Campuchia và Nam Bộ của Việt Nam. Ở Việt Nam loài cá này không có ở các tỉnh phía Bắc chỉ phân bố ở các tỉnh Nam Bộ. Cá thát lát còm còn nhỏ thích ăn các loài sinh vật phù du, sau đó chuyển sang ăn động vật phù du là chính, cá lớn ưa thích ăn động vật. 3 Cá có kích thước khá lớn, có thể đạt tới chiều dài 80-100 cm (Trong khi cá thát lát chỉ đạt tới 40 cm (Raiboth, 1991). Tuổi thọ của cá thát lát còm có thể đạt tới trên 10 năm. 2.2 Một số bệnh trên cá thát lát còm Theo Từ Thanh Dung (2005) cá thát lát nuôi thường gặp một số bệnh: Bệnh nhiễm khuẩn huyết Aeromonas: cá bệnh thường có hiện tượng cơ thể xuất hiện từng mảng đỏ với nhiều khối u, bụng có hiện tượng sẩm màu từng vùng , lưng có nhiều vết thương. Đuôi và vây bị hoại tử, mắt mờ đục, lồi và sưng phù. Hậu môn sưng to, cá bỏ ăn, nổi lờ đờ trên mặt nước và cuối cùng là chết. Bệnh nhiễm khuẩn Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ): Cá bị bệnh cơ thể thường hay xuất hiện nhiều đốm đỏ, rỉ máu và tiết ra nhiều dịch nhờn. Xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt nhung không xuất huyết vây và hậu môn. Bệnh trắng đuôi: Đuôi có đốm trắng, sau đó lan dần ra toàn thân, làm cho cá bị mất nhớt và làm vẩy bị bong ra. Vây và đuôi điều bị xuất huyết. Cá bị bệnh ít ăn, bỏ ăn từ từ. Các tia vây bị rách và cụt dần. Bệnh trùng quả dưa (Bệnh đốm trắng): Thân cá có nhiều trùng bám tạo thành hạt lấm tắm nhỏ, có màu trắng đục có thể nhìn thấy bằng mắt thường và cá mắc bệnh này thường hay nổi lờ đờ trên mặt nước, giảm ăn hoặc bỏ ăn, nếu bệnh nặng có thể làm cá chết. Bệnh nấm thủy mi: Da cá xuất hiện vùng trắng xám có những sợi nấm nhỏ mềm, sợi nấm phát triển mạnh đan chéo nhau thành búi như bông gòn có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Ngoài ra còn có một số bệnh kí sinh khác: Bệnh trùng bánh xe, bệnh sán lá đơn chủ, bệnh giun sán và bệnh do giáp xác,…Trong những loại bệnh trên thì bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra là phổ biến nhất. Theo Nguyễn Chung (2006) bệnh xảy ra chủ yếu trên cá thát lát còm là do vi khuẩn và nấm. Chúng được xem là nguyên nhân gây bệnh thứ cấp ( tác nhân gây bệnh cơ hội): Bệnh do vi khuẩn chủ yếu là do vi khuẩn Aeromonas spp với dấu hiệu bệnh thường gặp là cá bỏ ăn, nổi nghiêng, bơi lội uể oải, bơi lờ đờ chậm chạp trên mặt nước, xuất huyết ở vây, đuôi, hậu môn. Bệnh do nấm chủ yếu là nấm thủy mi do 2 giống Saprolenia và Achlya thường có trong nước, nhất là trong nước bẩn và trong bùn ao, dấu hiệu trên da xuất hiện những vùng trắng xám, có những sợi nấm nhỏ như sợi bong bám vào da, có thể nhìn thấy bằng mắt thường, nhất là khi cá bơi trong nước. 4 2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila Theo Bùi Quang Tề (2005) giống vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi khuẩn di động bao gồm (A. hydrophila, A. caviae, A.sorbia). Đặc tính chung của 3 loài vi khuẩn này là di động nhờ vào tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, hai đầu hơi tròn, phản ứng oxidase dương tính, kháng với O/129. Hình 2.2 Vi khuẩn A.hydrophila (nguồn: tepbac.com) Theo Từ Thanh Dung (2008) Aeromonas hydrophila là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que ngắn dài 2- 3µm, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, hai đầu hơi tròn, oxidase dương tính, kháng với O/129 bao gồm A. hydrophila, A.caviae, A.sorbia. Nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28- 30oC, sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2 Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila Đặc điểm A. hydrophila Đặc điểm Di động (<= 25°C) + Nitrate Phát triển Glucose 25°C + Sucrose 35°C Ornithine Catalase + Adonitol Oxidase + Maltose Voges-Proskauer + Urease Indole H2 S Salicin + Histidine & Arginine A. hydrophila + + + + + Năm 1979, Lewis & Plumbcho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên. 5 Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu…Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (theo Bergey 1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005). Năm 2006, Theo Bùi Quang Tề cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn treo râu. 2.4 Tổng quan về cây diệp hạ châu, cây cỏ mực, lá ổi và ứng dụng 2.4.1 Cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) Diệp hạ châu (tên khoa học Phyllanthus amarus) còn có tên gọi thông dụng là cây chó đẻ. Tên khác: lão nha châu, diệp hòe thái, Prak phú (tiếng Campuchia). Diệp hạ châu là loại cây mọc hàng năm, cao thường 30cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, thường có màu đỏ. Lá mọc so le, lưỡng bộ trong như lá kép, phiến lá Hình 2.3 Diệp hạ châu (nguồn: dantri.com.vn) thuôn, dài 5- 15mm, rộng 2- 5mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên thủy nhưng hơi có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới màu xanh lơ, không cuống. Hoa mọc ở kẻ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính, hoa đực, hoa cái cùng gốc, đực ở đầu cành, cái ở dưới. Hoa không cuống hoặc có cuống rất ngắn. Thành phần hóa học: chúng chứa chất Phyllanthin (C24H34O6), Niranthin (C24H32O7), Nirtetralin (C24H30O7), Phyteralin (C24H34O6), Hypophyllathin (C24H30O7). Đây là những chất có tính kháng vi sinh vật rất cao (luanvan.net.vn). Sản phẩm chiết xuất từ cây diệp hạ châu đã dược tiến hành sản xuất thử nghiệm và đưa sản phẩm vào ứng dụng trong nuôi tôm sú, góp phần giảm thiểu bệnh do virus đốm trắng gây ra, bảo vệ môi trường và nâng cao chất lượng, sản lượng tôm nuôi phục vụ cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu (viện nghiên cứu NTTS II). Sử dụng sản phẩm diệp hạ châu cho tôm sú trong suốt chu kỳ nuôi có khả năng phòng được bệnh đốm trắng bằng cách cho tôm ăn thức ăn có trộn chiết xuất từ diệp hạ châu với liều lượng 8 g/kg thức ăn/ngày là hiệu quả nhất. Bởi khi được ăn thức ăn có trộn diệp hạ châu tôm có 6 thể ức chế được sự nhân lên của virus đốm trắng trong cơ thể chúng. Các ao nuôi có sử dụng diệp hạ châu đều có thể nuôi đến khi tôm được trên 4 tháng so với các ao không sử dụng phải thu hoạch sớm hơn hoặc bị thiệt hại hoàn toàn do bệnh đốm trắng. Ngay cả khi ao nuôi đã bị nhiễm bệnh đốm trắng nếu tôm đã được cho ăn thức ăn có chiết xuất từ diệp hạ châu thì tỷ lệ tôm sống vẫn khá cao và có thể kéo dài đến khi có thể thu hoạch được. Sản phẩm này không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, sản lượng tôm nuôi. Mặt khác khi sử dụng sản phẩm diệp hạ châu liên tục trong 3 tháng thì chi phí nuôi tôm tăng không đáng kể, trung bình tăng từ 500 đồng đến 1.000 đồng/kg tôm so với không sử dụng. Vì vậy người nuôi tôm có thể tìm hiểu, sử dụng các sản phẩm dùng trong nuôi tôm với chiết xuất từ diệp hạ châu để phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi nhằm hạn chế sự xuất hiện, lây lan dịch bệnh này. Đồng thời nâng cao năng suất, sản lượng nuôi, đạt hiệu quả kinh tế cao. 2.4.2 Cây cỏ mực (Eclipta alba) Hình 2.4 Cỏ mực (nguồn: nongnghiep.vn) Cỏ mực (Rau mực) có tên khoa học là Eclipta alba, thuộc họ cúc Asteraceae. Tên đồng nghĩa là Eclipta prostrata. Gọi là cỏ mực vì khi vò nát có nước chảy ra như mực đen. Người ta còn gọi nó là cây nhọ nồi, dể gây nhầm lẫn với vị thuốc nhọ nồi lấy từ cây nồi chảo. Tên chữ hán là hạ liên thảo (Cây có đài quả như sen). Cỏ mực sống một hay nhiều năm, mọc đứng hay mọc bò, cao 30–40 cm, có thể cao đến 80 cm. Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lông cứng. Lá mọc đối, gần như không cuống, mép khía răng rất nhỏ, hai mặt lá có lông dài 2-8 cm, rộng 5-12 mm. Hoa hình đầu, màu trắng, mọc ở kẽ lá hoặc ngọn thân, lá bắc thon dài 5-6 mm cũng có lông, gồm hoa cái ở ngoài và hoa lưỡng tính ở giữa (Đỗ Tất Lợi, 2004). Theo Christybapita et al., (2007). Tác dụng kích thích miễn dịch của cây thuốc chiết xuất từ lá cỏ mực đã được nghiên cứu trong cá rô phi (Oreochromis mossambicus). Với mục đích này, cá được cho ăn cho 1, 2 hoặc 3 tuần với chế độ ăn có chứa lá chiết xuất lá cỏ mực ở 0, 0,01, 0,1 và 1%. Sau mỗi tuần, dịch thể không đặc hiệu (Lysozyme, antiprotease và chất bổ sung) và hiệu ứng tế bào (Chứa myeloperoxidase, sản xuất oxy và nitơ) và khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila đã được xác định. Kết quả cho 7 thấy dung dịch nước chiết xuất từ lá cây cỏ mực có thể dùng làm thức ăn bổ sung giúp tăng cường đáng kể hầu hết các thông số miễn dịch không đặc hiệu. Trong số các phản ứng dịch thể không đặc hiệu, hoạt động lysozyme tăng lên đáng kể sau khi ăn với dung dịch chiết xuất trong 1, 2 hoặc 3 tuần. Không có sự thay đổi đáng kể phản ứng của tế bào sau 3 tuần cho ăn. Trong khi đó, có sự tăng cường đáng kể oxy và myeloperoxidase sau 1 tuần cho ăn với dung dịch chiết xuất. Khi gây cảm nhiểm với A. hydrophila sau 1, 2 hoặc 3 tuần cho ăn, tỉ lệ cá chết giảm đáng kể. Với liều cao nhất 1% giúp bảo vệ tốt hơn so với các liều khác với tỉ lệ sống tương đối (RPS) khoảng 64, 75 và 32 sau khi thức ăn cho 1, 2 và 3 tuấn tương ứng. Kết quả cho thấy chế độ ăn kết hợp dung dịch chiết xuất lá cỏ mực giúp cá tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng bệnh của O. mossambicus lại vi khuẩn A. hydrophila. 2.4.3 Cây ổi (Psidium guajava) Vấn đề nghiêm trọng xuất hiện trong nuôi trồng thủy sản là dịch bệnh, đặc biệt là bệnh do vi khuẩn và virus gây ra chết hàng loạt. Nhiều phương pháp trị liệu được áp dụng cho việc trị bệnh do vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi sử dụng, chúng ta phải đối mặt với một vấn đề khác là dư luợng thuốc trong sản phẩm. Thảo dược được xem là một cách khác cho việc điều trị bệnh do vi khuẩn và vi rút trên động Hình 2.5 Lá ổi (nguồn: eva.vn) vật thủy sản. Đây là sản phẩm tự nhiên và rất an toàn cho người tiêu dung, có nhiều loại thảo dược còn được dùng như một loại thực phẩm, trong đó có lá ổi. Theo y học cổ truyền Thái Lan, ổi còn được dùng để điều trị bệnh tiêu chảy và các vết thương trầy xướt. Tên khoa học của ổi là Psidium guajava L., trong dân gian còn gọi là phan thạch lựu, thu quả, kê thỉ quả, phan nhẫm, bạt tử, lãm bạt, phan quỷ tử,…thuộc họ Sim Myrtaceae, chi Psidium. Cây ổi cao chừng 3-5 m, cành nhỏ thì vuông cạnh, lá mọc đối xứng, có cuốn ngắn hình bầu dục, nhẵn hay hơi có lông ở mặt trên, mặt dưới có lông mịn, khi soi lên có thấy túi tinh dầu trong. Hoa màu trắng mọc đơn độc ở kẽ lá. Quả nhiều hạt, hình thận, không đều (Đỗ Tất Lợi, 2006). Quả và lá đều chứa Sitosterol, Quereetin, Guaijaverin, Leucocyanidin và Avicularin, lá còn có Volatile oil, Eugenol.. Theo dược học cổ truyền, lá ổi vị đắng sáp, tính ấm, có công dụng tiêu thũng giải độc, thu sáp chỉ huyết. Trong lá ổi có chứa 7-10% tanin, pyrogalic, axit psiditanic, khoảng 3% nhựa và khoảng 0,36% tinh dầu chủ yếu là caryophyllene, β-bisabolene. 8 Theo Direkbusarakom et al.,(1997). Chiết xuất ổi (Psidium guajava) đã được xác định sử dụng MIC của các chiết xuất chống lại 24 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm: vi khuẩn Vibrio harveyi (9 chủng), V. splendidus (7 chủng), V. parahaemolyticus (2 dòng) và 1 dòng của mỗi V. mimicus, V. vulnificus, V. fluvialis, V. chorelae, V. alginolyticus và Aeromonas hydrophila. 2.4.4 Chiết xuất thảo dược Thời gian thu hoạch thảo dược là lúc cây vừa ra hoa (Từ 1 - 6 tháng tùy vào cách trồng và loại cây). Thảo dược được chiết tách bằng hệ thống Soxhlet cải tiến (Nguyễn Thanh Tâm, 2011). Tóm tắt quy trình: (1) cân khối lượng thảo dược cần chiết tách, (2) phối trộn thảo dược và dung môi cồn 96o với tỉ lệ thảo dược: ethanol là 1:3, (3) cho hỗn hợp vào hệ thống Soxhlet ly trích trong 3h, (4) thu hồi dung môi, loại bỏ cồn đi bằng cách bay hơi trong 24h ở nhiệt độ 90oC, (5) thảo dược được thu ở dạng cao và đem cân, (6) hòa tan cao thảo dược với nước theo tỉ lệ thảo dược: nước là 1:3, (7) đóng chai dạng nén khí CO2 để bảo quản. 2.4.5 Các nghiên cứu về thảo dược Nghiên cứu nước ngoài Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt khuẩn của tỏi. Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá hồ đào với đối tượng Bacillus anthracis. Năm 1944, nhà bác học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Thuốc kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 tetracillin có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi và tiêu diệt nhiều loại sâu bọ ký sinh trùng và nấm độc. Ở Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu trong qui mô phòng thí nghiệm với 3 loại thảo mộc Ocimum sanctum (Os), Withania somniera (Ws) và Myristik fragrans (Mf) có ảnh hưởng kháng lại loài vi khuẩn Vibrio harvey gây bệnh trên cá mú (Epinephelus tauvina). Thí nghiệm được tiến hành với cá mú có trọng lượng 30±0,5g, ba loại thảo mộc nêu trên được tách chiết trộn vào thức ăn cho cá ăn với các nồng độ tăng dần (100, 200, 400 và 800mg/kg thức ăn). Các lô thí nghiệm đối chứng cho thấy tỷ lệ cá chết lên đến 100%, các lô thí nghiệm cho ăn với nồng độ 100, 200 đã giảm tỷ lệ chết 5%. Vậy bước đầu đã có kết quả tốt trong việc sử dụng Os, Ws, Mf có tính kháng vi khuẩn Vibrio harvey. Năm 2004, tại Bangladesh, Muniruzzaman và Chowdhury nghiên cứu tác dụng của chiết xuất 26 loại thảo dược với 3 vi khuẩn Aeromonas hydrophila, 9 Edwardsiella tarda và Pseudomonas fluoescens gây bệnh trên cá. Kết quả có 21 loài thảo dược (80,76%) có tác dụng với A. hydrophila, 24 loài thảo dược (92,3%) có tác dụng với P.fluoescens tốt nhất và lá cây Bồng bồng (Calotropis gigantea) diệt vi khuẩn E. tarda tốt nhất. Một nghiên cứu khác cho thấy chất chiết từ lá ổi và quả ổi có tác dụng chống lại các loài vi khuẩn Staphilococcus, Shigella, Salmonella, Pacilus, E. Coli, Cloestridium và Pseudomonas. Năm 2004, Hasnabana đã nghiên cứu sử dụng Azadirachta indik, Allium sativum và Poligonum hidropiper là 3 loại thảo mộc dùng để kháng khuẩn. Theo Zheng el al., (2009) chứng minh tinh dầu cây lá thơm oreogano (Origanium heracleoticum) khi bổ sung vào thức ăn cho cá nheo bị nhiễm A.hydrophila thì cá vẩn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (p<0,005), chức năng gan và cơ quan nội tạng cũng được cải thiện, hoạt động chống oxy hóa của cá cũng tăng cường. Trung Quốc, người ta đã nghiên cứu hiệu quả của 2 loại thảo mộc (Astragalus radix và Scutellavia radiis) lên tính miễn dịch không đặc hiệu của cá rô phi. Kết quả cho thấy Astragalus radix cho ăn với nồng độ 0,1 và 0,5% trong thời gian 3 tuần là nồng độ và thời điểm có hiệu quả tối ưu nhất. Riêng Scutellavia radiis cần có thêm thí nghiệm để tìm ra nồng độ và thời gian cho ăn thích hợp. Năm 2007 cũng tại Trung Quốc thêm một nghiên cứu khác về tính miễn dịch của cá Chép, trộn lẫn một số loại thảo mộc với nhau như Astragalus mempranaceus (phần rễ và thân), Poligonum multiflorum (phần rễ), Isatis tinctoria (phần rễ), Glycyrrhida grabra (phần thân) cho cá Chép ăn 0,5% và 1% trong thời gian 30 ngày, kết quả cho thấy thảo dược giúp tính miễn dịch của cá tăng lên đáng kể (2007). Nghiên cứu trong nước Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam – nguồn tài nguyên sinh học quý giá – có trên 12.000 loài, trong số đó có tới hơn 3.200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong y học dân gian. Đây là một lợi thế to lớn đối với ngành công nghiệp hóa dược nước ta. Tuy nhiên, trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản việc nghiên cứu và sử dụng cây thuốc nam và các hợp chất chiết xuất từ thảo dược còn rất mới. Do đó việc nghiên cứu có hệ thống việc sử dụng cây thuốc, vị thuốc trong phòng trị bệnh cho ĐVTS là rất cần thiết. Ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu sử dụng chiết xuất thảo dược để phòng bệnh nhiễm khuẩn ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực 10 hiện. Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và ctv đã nghiên cứu thành công hai loại thảo dược VTS1-C và VTS1-T phối chế từ các hoạt chất chiết tách từ tỏi (Allium sativum) và sài đất (Weledia calendulacea) sử dụng phòng bệnh cho tôm cá kết quả cho thấy chúng đều có tác dụng với 6 loại vi khuẩn: Vibrio parahaemolyticus, V.harveyi, V.alginolyticus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda và Hafnia alvei gây bệnh ở nước lợ, ngọt, mặn. Ở miền Bắc, Hà Ký (1995) đã nghiên cứu một số loại thảo dược điều trị bệnh cho cá. Bước đầu đã chọn được 9 loại cây khác nhau: Rau nghề (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca oleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cây cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendulacea), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium indicum), cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản. Theo Đỗ Tất Lợi (1968), dịch chiết xuất từ cây bạch hoa xà có thể ngăn chặn sự tăng trưởng của chủng E. coli và vi khuẩn Shigella với MIC: 0,64-10,24 ppm. Ngoài ra, khi chiết xuất cây bạch hoa xà bằng ethyl acetate, dịch chiết thu được có tác dụng ức chế vi khuẩn Helicobacterpylori trong ống nghiệm (Abdul và Rachender, 1995). Theo Nguyễn Quang Linh (2010), lá trầu không được chiết xuất, tạo ra chế phẩm sinh học với tên gọi Bokashi- trầu, có khả năng phòng trị một số bệnh cho động vật thủy sản, an toàn sinh học và thân thiện với môi trường. nhằm thay thế nhiều loại kháng sinh, chế phẩm lần đầu tiên được sản xuất trong nước này được kết hợp từ các vi sinh vật hữu ích Em (Effective microorganisms) với chất chiết xuất từ lá trầu ( có tên khoa học là Piper betle) để phòng ngừa và trị bệnh cho một số loài động vật thủy sản. Chế phẩm này có khả năng ức chế và tiêu diệt 2 loài vi khuẩn Vibrio Parahaemoliticus và Aeromonas hydrophila, đây là 2 loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật thủy sản nước ngọt và nước lợ. Nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2010) đã sử dụng 30 loại thảo dược thường được dùng trong dân gian như: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), Bàng (Terminalia catappa), Ổi (Psidium guajava), Từ bi (Pluchea indica),…để thử hoạt tính kháng khuẩn trên 3 loại vi khuẩn E. ictaluri, E. tarda và Aeromonas hydrophila cho thấy các cây thuốc này đều có khả năng kháng khuẩn (MIC=16-2048 µg/ml). Hoạt phổ mạnh trên cả 3 loại vi khuẩn là Bàng, Ổi, Trầu không, Tràm (MIC=64-512 µg/ml). Tác động mạnh nhất trên E. ictaluri là Sâm đại hành (MIC=16 µg/ml), E. tarda là Rau mương (MIC=32 µg/ml), 11 Aeromonas hydrophila là Bàng (MIC=128 µg/ml). Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu sử dụng bột lá xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum) bổ sung vào thức ăn của cá tra với liều 15g/kg thức ăn và cho cá ăn trong 1 tháng thì cá tăng trọng hơn nghiệm thức đối chứng là 27%. Ở nghiệm thức cho ăn bổ sung bột lá xuân hoa liều 20g/kg thức ăn thì tỉ lệ sống là 98,3% cao hơn so với lô đối chứng (88,3%). Khi gây cảm nhiễm cá tra khỏe với vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết và vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan thì tỉ lệ chết (11,67% và 15%) ở các nghiệm thức cho ăn thức ăn bổ sung bột lá xuân hoa (Liều 20g/kg thức ăn) thấp hơn cá ở lô đối chứng (28,33% và 33,33%). Chất chiết xuất từ cây Hoàng kỳ cũng được thử nghiệm bổ sung vào thức ăn cho cá tra (20- 30g/con) để tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch của cá tra (Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Yến Nhi, 2011). Cá tra khỏe (20-30g/con) được cho thức ăn bổ sung 0,5% chiết chất Hoàng kỳ trong 5 tuần thì số lượng hồng cầu, tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu tăng so với cá ăn thức ăn không bổ sung chiết chất Hoàng kỳ. Sau khi gây cảm nhiễm cá tra khỏe với vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết và vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mũ gan thì số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu ở các nghiệm thức đều giảm trong khi bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tăng. Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá cảm nhiễm cao hơn cá khỏe, khả năng diệt khuẩn của huyết thanh của cá ăn thức ăn bổ sung Hoàng kỳ cao hơn so với cá ăn thức ăn không bổ sung Hoàng kỳ. 2.5 Các chỉ tiêu huyết học Máu là thành phần quan trọng trong hệ thống tuần hoàn của tất cả các cơ thể sống, chịu trách nhiệm cung cấp oxy, thức ăn cho các mô khác của cơ thể và loại bỏ dioxit carbon cũng như chất thải ra khỏi các mô (Trịnh Hồng Thái, 2002). Ở cá chiễm 5% trong lượng cơ thể (Robert, 1989). Thành phần các tế bào máu của hệ tuần hoàn bao gồm tế bào hồng cầu, tế bào lympho, tế bào tiểu cầu, các tế bào mono và các loại bạch cầu trung tính có hạt. 2.5.1 Hồng cầu Tế bào hồng cầu trưởng thành của cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt màu đậm và kích thước từ 10 x 13µm – 12 x 13µm. Đường kính nhân 4- 5µm. Hồng cầu chưa trưởng thành ít được tìm thấy trong vòng tuần hoàn máu, kích thước giống hồng cầu trưởng thành nhưng nhân lớn hơn. Tế bào chất bắt màu xanh nhạt hoặc xam bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut el al.,1991). 12
- Xem thêm -