Nghiên cứu một số dược liệu có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase

  • Số trang: 59 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 62 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THU TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM LIPOXYGENASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THU TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM LIPOXYGENASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Hoàng Quỳnh Hoa Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Thực vật 2. Bộ môn Vật lý – Hóa lý Trường Đại Học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa,người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên, kĩ thuật viên Bộ môn Thực vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian làm thực nghiệm tại Bộ môn Thực vật. Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Vật lý – Hóa lý đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình sử dụng máy đo quang phổ tại bộ môn Vật lý – Hóa lý. Tôi xin cảm ơn toàn thể cán bộ, giảng viênTrường Đại học Dược Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới bố mẹ, người thân và bạn bè của tôi – những người đã luôn động viên, chăm sóc và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Đào Thu Trang MỤC LỤC Trang DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ …...……………………………………….………………. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………..………………………… 3 1.1. T ổng quan về enzym Lipoxygenase ….…………………………… 3 Đị 1.1.1. nh nghĩa….…………………………………………………. ……3 1.1.2. P hân loại enzym LOX...……………………………………….. ……3 1.1.3. C ơ chế phản ứngcủa enzym LOX và cơ chất……………….……..4 1.1.4. V ai trò của LOX trong động thực vật …...……………………….… 5 1.1.5. C ác chất ức chế LOX ..………………………………………… ...…6 1.1.6. C ơ chế ức chế LOX….…………………………………………. …...7 1.2. C ác mô hình thử tác dụng ức chế LOX………………………......... 7 1.2.1. N guyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX…………... 7 1.2.2. C ác mô hình thử tác dụng ức chế LOXdựa trên phương pháp đo độ hấp thụ…………………………………………………………......... 9 1.3. T ổng quan vềrutin và các dược liệu thực hiện nghiên cứu……….. 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….. 18 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị trong nghiên cứu…….…………………….. 18 2.2. Nội dung nghiên cứu…..…………………………………………….. 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………. 20 2.3.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu……………….………………… 20 2.3.2. Phương pháp lựa chọn điều kiện nghiên cứu……………….…….. 20 2.3.3. Phương pháp khảo sát tương tác enzym – chất ức chế……….…… 23 2.3.4. Lựa chọn mô hình thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu….…… 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …….…… 27 3.1. Lựa chọn điều kiện nghiên cứu…………………………..…………. 27 3.1.1. Xác định hoạt độ enzym …………………………….……….…… 27 3.1.2. Lựa chọn nồng độ enzym………… ………………..……..…….. 27 3.1.3. Lựa chọn nồng độ cơ chất……………………………….…….….. 29 3.1.4. Lựa chọn thời gian ủ………………………………….………..….. 31 3.2. Khảo sát tương tác enzym – chất ức chế…………………...…….…. 33 3.3. Thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu theo mô hình 6 cuvet.……. 33 3.4. Bàn luận……………………………………………………….…….. 35 3.4.1. Về mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang ………………………………………………………………… 35 3.5.2. Về kết quả thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu……………… 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AST Aspartate aminotransferase ALT Alanine aminotransferase DMSO Dimethylsulfoxid LOX Enzym Lipoxygenase LDL Low Density Lipoprotein % ƯC Phần trăm ức chế DANH MỤC CÁC BẢNG STT Số bảng 1 1.1 2 2.1 3 3.1 4 3.2 5 3.3 6 3.4 Tên bảng Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của Cayman Danh mục các mẫu nghiên cứu Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 5 nồng độ enzym Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 6 nồng độ cơ chất Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng theo thời gian ủ Kết quả khảo sát tương tác enzym – chất ức chế Trang 11 18 28 30 32 33 7 3.5 8 3.6 Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của chè dây DANH MỤC CÁC HÌNH STT Số hình 1 1.1 Cơ chất thường gặp của LOX 3 2 1.2 Cấu trúc của 15-LOX ở thỏ 4 3 1.3 Cơ chế xúc tác của LOX 5 4 1.4 5 1.5 Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman 11 6 1.6 Cấu trúc hóa học của rutin 14 Tên hình Phương pháp đo độ hấp thụ của hydroperoxid Trang 9 34 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong cơ thể người, enzym lipoxygenase (LOX) đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng viêm, dị ứng và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên quan nhiều bệnh như hen phế quản [23], xơ vữa động mạch [40], [48], ung thư [56], viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm cầu thận [17] và bệnh vẩy nến [32]. Các chất ức chế LOX đã được chứng minh có tác dụng ngăn cản nguy cơ ung thư [59] và đã được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ dày [66], ung thư vú [25],ung thư gan di căn [28] và ung thư miệng [45], v.v. Một số chất ức chế LOX đã được sử dụng để điều trị hen mạn tính [52], phổi tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22], [51],viêm khớp gối [29]và bệnh da liễu [15]. Có nhiều chất ức chế LOX đã được nghiên cứu có nguồn gốc từ cây cỏ. Đây là một hướng nghiên cứu rất tiềm năng trong việc sàng lọc và phát triển các sản phẩm chữa bệnh theo cơ chế ức chế enzym LOX. Nhiều phương pháp đã được tìm ra để thử hoạt tính của LOX như: Sử dụng điện cực oxygen [14], gắn đồng vị phóng xạ 14C [16] hay phương pháp đo màu [65], [38]. Những phương pháp trên yêu cầu các thiết bị chuyên dụng đồng thời lại phức tạp nên không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu. Phương pháp đo quang dựa trên cơ chế hình thành hydroxyperoxid (sản phẩm tạo thành trong phản ứng enzym – cơ chất) có nối đôi liên hợp hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ởbước sóng 234nm là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm nhất để đánh giá hoạt tính của LOX [27]. Tuy nhiên, cho tới nay, chúng tôi chưa thu thập được tài liệu nào công bố tại Việt Nam về phương pháp này. Trên thế giới, cũng chưa có một mô hình thống nhất để thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang, đồng thời các tài liệu đều 2 không đưa ra vấn đề khảo sát để tìm ra nồng độ enzym, cơ chất hay thời gian ủ phù hợp nhất. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu một số dược liệu có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase” với hai mục tiêu sau: Mục tiêu 1: Xây dựng mô hình thử tác dụng dụng ức chế enzym lipoxygenase của dịch chiết dược liệu bằng phương pháp đo quang. Mục tiêu 2: Áp dụng mô hình vừa xây dựng để khảo sát tác dụng ức chế enzym lipoxygenase của dịch chiết các dược liệu: chè dây, dâu tằm, lá móng, kim ngân, cườm rụng, cúc áo, mã đề, xạ đen. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan vềenzym lipoxygenase 1.1.1. Định nghĩa Lipoxygenases (LOX)là một nhóm các enzyme phức tạp. Thành phần cấu tạo gồm có phần protein và phần nhóm ngoại chứa sắt. LOX xúc tác cho phản ứnggắn phân tử oxy vào các acid béo có nhóm cis, cis-1,4-pentadien. Hai acid béo acid linoleic và acid arachidonic là những cơ chất thường gặp của LOX trong động thực vật [19], [26]. Hình 1.1. Cơ chất thường gặp của LOX 1.1.2. Phân loại enzym LOX LOX có trong thực vật, động vật và nấm. Có nhiều loại LOX, nếu phân loại dựa trên vị trí hydroperoxide hóa thì có các loại LOX sau: LOX-1, LOX3, LOX-5, LOX-9, LOX-12, LOX-13, LOX-15. Trong đó chỉ có LOX-5, LOX-12, LOX-15 được tìm thấy trên người. Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra cấu trúc của LOX-1 và LOX-3 từ đậu nành, LOX-15 từ thỏ[58]. 4 Hình 1.2. Cấu trúc của LOX-15 ở thỏ [18] Trong cấu trúc của LOX-15 được mô tả ở hình 1.2, có 2 phần riêng biệt: phần màu xanh là phần gắn với acid béo do có cấu trúc tương tự một phần cấu trúc lipase tụy người, phần còn lại là phần xúc tác, vị trí màu tím là trung tâm hoạt động của enzym. 1.1.3. Cơ chế phản ứng của enzym LOX và cơ chất Ở bước đầu tiên của phản ứng, 1 H được tách ra khỏi –CH2– nằm giữa 2 nối đôi trong phân tử acid béo. Gốc carbon còn lại sẽ mang một điện tử tự do. Một phân tử oxygen sẽ gắn vào nguyên tử Cacbon ở vị trí +2 và -2 tạo thành một acid béo chưa no có gốc peroxy và 2 nối đôi liên hợp. Gốc peroxy không bền nên sẽ bị hydrogen hóa tạo thành dạng hydroperoxid [61]. 5 Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của LOX 1.1.4. Vai trò của LOX trong động thực vật Trong thực vật, LOX tham gia vào các hoạt động sinh lý khác nhau bao gồm sinh trưởng phát triển (LOX là một loại protein dự trữ cho quá trình phát triển, đặc biệt là trong hạt lúc nảy mầm [24]), phản ứng khi bị thương, thiếu nước [49], sâu bệnh [47]. Ở động vật có vú, LOX là một trong những enzym chính trong quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng viêm, dị ứng và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên quan đến các bệnh hen phế quản [23], xơ vữa động mạch do làm tăng sự oxy hóa LDL 6 trong máu [40],[48], ung thư [56],viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm cầu thận [17] và bệnh vẩy nến [32]. Các chất ức chế LOX có tác dụng ngăn cản nguy cơ ung thư [59] và đã được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ dày [66], ung thư vú [25],ung thư gan di căn [28], ung thư miệng [45], hen mạn tính [52], phổi tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22], [51],viêm khớp gối [29] và bệnh da liễu [15]. Bên cạnh đó, các chất ức chế LOX cũng có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm. Sự xúc tác quá trình oxy hóacác acid béo trong thực phẩm của LOX là một trong những nguyên nhân gây ôi thiu thực phẩmvà làm thay đổi hương vị, màu sắc của thực phẩm. Nước chè đã được ứng dụng để bảo quản cá do các hợp chất polyphenol trong chè có tác dụng ức chế LOX tốt [61]. 1.1.5. Các chất ức chế LOX Cho tới nay, các nhà khoa học đã tìm ranhiều chất có tác dụng ức chế LOX bao gồm cả các chất có nguồn gốc thiên nhiên và các chất tổng hợp hóa học. Trong số các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên, flavonoid chiếm đa số, bao gồm: Rutin [60], quercetin [30], baicalein, esculetin [54], artemitin và casticin [20]. Ngoài ra còn có tanin như epigallocatechin gallate [31] và nhiều hợp chất phenolic tự nhiên khác như acid boswellic [25], acid caffeic, curcuminoid [39], eugenol [50], acid nordihydroguiaretic [64], daidzein và genistein [63]. Các chất tổng hợp hóa học có tác dụng ức chế LOX gồmzileuton, tebufelone, darbufelone, phenidone, docebenone và lonapalene [18]. Các chất đã liệt kê ở trên đều đã được nghiên cứu trên invitro cho kết quả ức chế LOX tốt, zileuton còn được ứng dụng trên lâm sàng dùng để điều trị hen mạn tính và phổi tắc nghẽn mạn tính [52], [15]. Một số chất đã được thử nghiệm trên người và cho thấy kết quả điều trị tốt như acid boswellic 7 chiết xuất từ cây Boswellia serratatrong điều trị ung thư vú [25] và viêm đại tràng [29], baicalein trong điều trị ung thư dạ dày [66]... Bên cạnh đó, rất nhiều dịch chiết thực vật đã được chứng minh có tác dụng ức chế lipoxygenase tốt nhưng chưa phân lập chất tinh khiết như: Bidens pilosa, Solanum nigrum, Justicia flava, Galinsoga parviflora, Oxygonum sinuatum, Chenopodium album, Cleome monophylla, Physalis viscosa [60],Embrica ribes, Terminala chebula, Symplocos racemosa, Rosa demacena [13],Thespesia lampas [41], Woodfordia fructicosa [42], Mahonia aquifolium [46], Camellia sinensis, Theobroma cacao [61],… 1.1.6. Cơ chế ức chế LOX Enzym LOX được ức chế bằng 2 cách chính: (1) tạo phức chelat với ion ở vị trí hoạt động của enzym, (2) chuyển enzym từ dạng ferric (dạng có hoạt tính) thành dạng ferrous (bất hoạt) [35]. Các chất ức chế LOX có thể hoạt động theo một trong 2 cách trên. Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX 1.2. 1.2.1. Nguyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX Các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase có thể dựa trên lượng oxy tiêu thụ, lượng cơ chất tiêu thụ hoặc lượng sản phẩm hydroperoxid tạo thành. - Dựa trên lượng oxy tiêu thụ: xác định lượng oxy tiêu thụ sử dụng điện cực oxygen [14]. Phương pháp tuy chính xác nhưng lại yêu cầu thiết bị chuyên dụng và không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu. - Dựa trên lượng cơ chất tiêu thụ:sử dụng acid linoleic gắn đồng vị phóng xạ 14C, sản phẩm tạo thành gắn đồng vị phóng xạ sẽ được tách ra bằng phương pháp sắc ký [16]. Phương pháp này phức tạp và không nhanh. - Dựa trên lượng sản phẩm hydroperoxide tạo thành: 8 Sản phẩm đầu tiên của phản ứng biến đổi acid linoleic dưới xúc tác của lipoxygenase là một acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-cis, trans-1,3pentadien liên hợp [19], [26].Việc xác định lượng hydroperoxid tạo thành được thực hiện dựa trên 2 nguyên tắc đo màu và đo độ hấp thụ. o Phương pháp đo màu: sản phẩm hydroperoxid tạo thành phản ứng với I– giải phóng I2, thêm hồ tinh bột, định lượng sản phẩm có màu tạo thànhdo hồ tinh bột kết hợp với I2bằng phương pháp đo màu [65].Một số tác giả khác cho sản phẩm hydroperoxide oxy hóa Fe2+ thành Fe3+ , sau đó cho Fe3+phản ứng với thiocyanat và định lượng sản phẩm có màu tạo thành bằng phương pháp đo màu [38]. Bên cạnh đó, một số tác giả lại cho hydroperoxid oxy hóa cặp 3-methyl-2-benzothiazolinon và 3-(dimethylamino)benzoic acid dưới xúc tác của hemoglobin tạo thành sản phẩm có màu rồi định lượng bằng phương pháp đo màu [27]. Phương pháp đo màu đơn giản, tuy nhiên không phù hợp với các mẫu có màu. o Phương pháp đo độ hấp thụ: Sản phẩm hydroperoxid tạo thành có nối đôi liên hợp, hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 234nm [27] nên có thể xác định lượng sản phẩm tạo thành qua sự thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 234nm.Đa số các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase đều áp dụng phương pháp này vì đơn giản, nhanh chóng.Thiết bị là máy đo quang phổ UV-VIS sử dụng cuvet hoặc máyquang phổ Elisasử dụng đĩa nhiều giếng. LOX Acid béo + O2 → Hydroperoxidcủa acid béo (R-O-O-H) 9 Có cis, cis-1,4-pentadien Acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxycis,trans-1,3-pentadien liên hợp Có nối đôi liên hợp hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 234 nm [27] → Đo được hydroperoxid tạo thành bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV Hình 1.4. Phương pháp đo độ hấp thụ của hydroperoxid Phương pháp đo độ hấp thụ của sản phẩm hydroperoxid tạo thành có nhiều mô hình đo khác nhau. 1.2.2. Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX dựa trên phương pháp đo độ hấp thụ 1.2.2.1. Mô hình của Sigma – Aldrich [57] Mô hình của Sigma – Aldrich sử dụng máy quang phổ spectrophotometer UV – VIS và cuvet thạch anh, đọc độ hấp thụ ở bước sóng 234nm. Đơn vị hoạt tính enzym được sử dụng là Unit, được định nghĩa như sau: 1 unit enzym tương ứng sự tăng của độ hấp thụlà 0,001mỗi phút ở bước sóng 234nm, pH9,0, nhiệt độ 25oC, cơ chất sử dụng là acid linoleic, tổng thể tích dung dịch trong cuvet là 3ml, bề dày dung dịch là 1cm, 1unit tương ứng với sự oxy hóa 0.12µmol acid linoleic. 10 Phương pháp xác định hoạt tính enzym là phương pháp đo quang. Phản ứng thực hiện trong cuvet. Có 2 cuvet: cuvet chứa mẫu thử và cuvet chứa mẫu trắng. Mẫu thử bao gồm 900µl đệm borat, 2ml dung dịch cơ chất, 100µl dung dịch enzym. Mẫu trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất. Nồng độ dung dịch cơ chất là 536µM, nồng độ dung dịch enzym là 5000 – 10000U/ml và đệm borat pH9,0. Ở 25oC, bước sóng 234nm, đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắngtại thời điểm 5 phút. Hoạt độ thực sự của dung dịch enzym được tính theo công thức: Trong đó: ΔA là độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng. df là độ pha loãng 0,001 là độ hấp thụ tăng lên mỗi phút tương ứng với 1 unit enzym 5 là 5 phút Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện nhưng nhược điểm là mỗi lần đo chỉ đo được một mẫu. 1.2.2.2. Mô hình của Cayman [19] Mô hình của Cayman sử dụng máy quang phổ Elisa microplate reader và đĩa 96 giếng, ngừng phản ứng bằng chromogen, đọc độ hấp thụ ở bước sóng 490 – 500 nm.Mô hình đĩa 96 giếng được trình bày trong hình 1.4. Bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng 1.1. 11 Hình 1.5. Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman Bảng 1.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của Cayman Các bước phản ứng Bắt đầu phản ứng Ngừng phản ứng B 100µl đệm 10µl cơ chất + * 10µl đệm 90µl 15-LO 10µl methanol 90µl 15-LO 10µl cơ chất 10µl cơ chất Lắc đĩa trong 5 phút 100µl 100µl 100µl chromogen chromogen chromogen Lắc đĩa trong 5 phút Đọc độ hấp thụ ở 490 – 500nm 1-45 90µl 15-LO 10µl chất ức chế 10µl cơ chất 100µl chromogen
- Xem thêm -