Tài liệu Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết xuất Rotundin từ củ Bình vôi

Bộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • LÊ HOÀNG QUÂN NGHIÊN CỨU LựA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIÉT XUẤT ROTUNDIN TỪ củ BÌNH VÔI KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHÓA 2005 - 2010 Người hướng dẫn: KS.DS. Nguyễn Thị Việt Hưong Nơi thực hiện: BM Công nghiệp dược ĐH Dược HN Thời gian thực hiện: Từ 02/2010 đến 05/2010 KLim:xụ HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN! Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo KS.DS. Nguyễn Thị Việt Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp dược đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận đúng thời hạn. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và chỉ bảo em trong những năm tháng học tập ở trường. Cuối cùng, em xin cảm on gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn nhiều hạn chế nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo của các thầy cô và sự góp ý của bạn bè. Em xỉn chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2010. Sinh viên Lê Hoàng Quân MỤC LỤC Trang Chú giải chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Đặt vấn đề................................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................................ 2 1.1. Cây bình vôi...................................................................................................... 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật...........................................................................................2 1.1.2. Phân bố và sinh thái........................................................................................4 1.1.3. Bộ phận dùng và chế biến............................................................................... 6 1.1.4. Thành phần hóa học........................................................................................ 6 1.1.5. ứng dụng của củ bình vôi............................................................................... 7 1.2. Sản phẩm - rotundin.......................................................................................... 8 1.2.1. Công thức hóa học và tính chất.......................................................................8 1.2.2. Định tính và định lượng.................................................................................. 9 1.2.3. Tác dụng dược lý và ứng dụng....................................................................... 9 1.2.4. Một số chế phẩm có rotundin......................................................................10 1.3. Chiết xuất rotundin từ củ bình vôi................................................................11 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚXJ.......................... 12 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị................................................................................. 12 2.1.1. Nguyên liệu................................................................................................. 12 2.1.2. Hóa chất, dung môi..................................................................................... 12 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ......................................................................................... 12 2.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 12 2.2.1. Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết xuất.................................................... 12 2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ chiết..............................................................13 2.2.3. Nghiên cứu lựa chọn số lần chiết................................................................... 13 2.3. Phương pháp thực nghiệm.............................................................................. 13 2.3.1. Phương pháp định lượng................................................................................13 2.3.2. Phương pháp chiết xuất.................................................................................15 Chương 3. THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................21 3.1. Định lượng rotundin trong dược liệu củ bình vôi............................................. 21 3.2. Lựa chọn dung môi chiết xuất..........................................................................21 3.2.1. Tiến hành phưoTig pháp chiết với dung môi là nước acid..............................21 3.2.2. Tiến hành phương pháp chiết với dung môi là ethanol 96®............................23 3.2.3. Tiến hành phương pháp chiết với dung môi là dầu hỏa.................................25 3.2.4. Bàn luận....................................................................................................... 29 3.3. Lựa chọn nhiệt độ chiết................................................................................... 30 3.4. Lựa chọn số lần chiết....................................................................................... 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XƯẨT................................................................................... 37 Kết luận.................................................................................................................. 37 Đề xuất................................................................................................................... 37 Tài liệu tham khảo CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT dd................................. dung dịch. DĐVN IV.................... Dược điển Việt Nam IV. pp................................. phương pháp. TB................................ trung bình. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Hàm lượng rotundin trong dược liệu............................................................. 21 Bảng 3.2. Khối lượng sản phẩm ở pp chiết bằng nước acid........................................... 23 Bảng 3.3. Hàm lượng rotundin trong sản phẩm của pp chiết bằng nước acid................ 24 Bảng 3.4. Khối lượng sản phẩm ở pp chiết bằng ethanol 96^........................................ 24 Bảng 3.5. Hàm lượng rotundin trong sản phẩm của pp chiết bằng ethanol 96®............... 25 Bảng 3.6. Khối lượng sản phẩm ở pp chiết bằng dầu hỏa.............................................. 26 Bảng 3.7. Hàm lượng rotundin trong sản phẩm của pp chiết bằng dầu hỏa................. 26 Bảng 3.8. Khối lượng sản phẩm tương ứng với các pp chiết xuất.................................. 27 Bảng 3.9. Hiệu suất tương ứng với các pp chiết xuất..................................................... 27 Bảng 3.10. Hàm lượng rotundin trong sản phẩm ở các pp chiết xuất............................. 28 Bảng 3.1 ỉ. Khối lượng sản phẩm ở các nhiệt độ chiết tương ứng.................................. 31 Bảng 3.12. Hàm lượng rotundin trong sản phẩm ở các nhiệt độ chiết tương ứng.......... 31 Bảng 3.13. Hiệu suất tương ửng ở các nhiệt độ chiết..................................................... 32 Bảng 3.14. Khối lượng rotundin thô ở 5 lần chiết của mỗi mẻ dược liệu....................... 34 Bảng 3.15. Tỷ lệ % khối lượng rotundin thô của mỗi lần chiết so với tổng khối lưọng... 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐÒ THỊ Trang Hình 3.1. Hiệu suất tương ứng với các pp chiết xuất.................................................... 28 Hình 3.2. Hiệu suất tương ứng ở các nhiệt độ chiết...................................................... 32 Hĩnh 3.3. Tỷ lệ % khối lượng rotundin thô của mỗi lần chiết so với tổng khối lượng.... 35 ĐẶT VẤN ĐÈ • Hiện nay, nhu cầu về các loại thuốc an thần, gây ngủ, chống co giật ở nước ta ngày càng lớn. Phần lớn các thuốc có tác dụng này đều có nguồn gốc hóa dược và phải nhập ngoại. Trong đó Seduxen và các dẫn chất của nó chiếm tỷ trọng cao: Seduxen, Valium, Mekoluxen 5 mg,... Tuy nhiên, Seduxen lại có nhược điểm lớn là gây nghiện nên việc phân phối và sử dụng được Bộ Y tể quản lý rất chặt chẽ. Do đó, nhu cầu về một loại thuốc an thần, gây ngủ, chống co giật nhưng không gây nghiện để sử dụng cho bệnh nhân ngày càng trở nên cấp thiết. Rotundin là một alcaloid được chiết từ củ của một số loài cây có tên gọi chung là bình vôi. Rotundin có tác dụng an thần, giảm đau, gây ngủ rất tốt, ít có tác dụng phụ so với các thuốc nguồn gốc hóa dược và không gây nghiện. Hiện nay, đã có nhiều cơ sở trong nước sản xuất các sản phẩm thuốc từ rotundin như: Rotunda (Dopharma), Rotundin 30 mg (Pharbaco),... Các sản phẩm này đang được tiêu thụ khá nhiều trên thị trường. Tuy nhiên, khả năng đáp ứng về rotundin dược dụng trong nước còn ít, phần lớn phải nhập từ Trung Quốc, trong khi nguồn dược liệu củ bình vôi ở nước ta khá phong phú. Do đó, vấn đề đặt ra là phải nghiên cứu, xây dựng được một quy trình chiết xuất rotundin đạt hiệu quả cao, có khả năng ứng dụng trong công nghiệp để tận dụng nguồn dược liệu sẵn có. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết xuất rotundin từ củ bình vôi với mong muốn góp phần vào việc tìm ra một phương pháp chiết xuất rotundin có thể áp dụng vào thực tế sản xuất. Đề tài gồm các mục tiêu sau: 1. Lựa chọn dung mồi để chiết rotundin cho hiệu suất cao, quá trình chiết dễ thưc hiên. • • 2. Lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp với dung môi đã chọn. 3. Lựa chọn số lần chiết thích hợp. Chương 1. TỎNG QUAN 1.1. Cây bình vôi. Nguồn dược liệu để chiết xuất rotundin ở Việt Nam là củ của cây bình vôi. - Tên khoa học: Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi Stephanỉa Lour., họ Tiết dê {Menỉsperamaceae) [4]. - Tên khác: Cây củ một, củ mối tròn, dây mối trơn, củ gà ấp,... - Hàm lượng rotundin trong củ bình vôi dao động trong khoảng từ 0,21% đến 3,55% tính theo dược liệu khô [4'. 1.1.1. Đặc điểm thực vật của cây bình vôi [4], + Loài Stephanỉa glabra (Roxb.) Miers: Thân leo, phát triển từ củ hình tròn, củ thưÒTig nằm ở khe đá, vỏ củ có các nốt sần, đôi khi có những rãnh nhỏ ngang dọc. Nhựa từ thân lá và lá không mang màu. Lá đơn, mọc so le, mép lá nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá. Toàn thân và lá không có lông. Cuống lá dài từ 6 - 25 cm, gốc hơi phình lên và cong. Phiến lá hình tim, ngọn lá thuôn nhọn, mặt dưới xanh lợt. Lá có từ 9 —11 gân xếp tỏa tròn do cuống lá dính vào 1/3 phiến lá tính từ gốc lá. Cụm hoa đực dạng tán kép, cuống cụm hoa dài 3 - 12 cm, mỗi cuống cụm hoa gồm nhiều tán, mỗi tán lại có nhiều tán cấp II, mỗi cuống tán cấp 2 mang 4 tán cấp III, kết thúc gồm 3 hoa với cuống của hoa rất ngắn. Hoa đực gồm 6 đài rời xếp thành 3 vòng (3 + 3), kích thước gần như bằng nhau. Đài hình trứng hẹp, chiều dài 1,5 mm. Ba cánh hoa hình trứng màu xanh khi còn trong nụ và chuyển màu vàng khi hoa nở, gốc cánh hoa đôi khi có thể tuyến. Bộ nhị hàn liền thành 1 trụ với 6 bao phấn màu vàng nhạt xếp thành vòng tròn, trên 1 trụ do chỉ nhị hàn liền tạo thành cột ngắn 0,5 - 1 mm. Khi hoa nở các bao phấn mở nắp ngang ra xung quanh. Hạt phấn nhỏ màu vàng. Cụm hoa cái dạng xim tán, cuống các bông hoa rất ngắn nên các bông hoa xếp sít vào nhau thành dạng đầu. Mỗi đầu gồm 2 0 - 7 0 bông hoa (sau cho 2 0 - 7 0 quả). Cuống cụm hoa dài 2 - 5 cm. Hoa cái bất đối xứng. Mỗi hoa có 1 lá đài hình cánh hoa xếp lệch về 1 phía của hoa. Bầu hình trứng, núm nhụy chia 4 - 5 thùy dạng gai nhỏ và hầu như không có vòi nhụy. Quả hạch hình trứng ngược dài 5 - 6 mm, rộng 4 - 5 mm. v ỏ quả ngoài nhẵn, lúc non màu xanh, chuyển sang màu vàng rồi đỏ sẫm khi chín. Hạt hình trứng ngược, cụt một đầu, vỏ hạch cứng chia nhiều vạch ( 1 7 - 2 0 vạch). Giá noãn có lỗ thủng ở giữa. Mùa hoa: Tháng 2 - 4 , mùa quả tháng 5 - 6 . + Loài Stephanỉa kuinanensis H. s. Lo et M. Yang: Thân leo dài 2 - 3 m, củ tròn, bề mặt vỏ củ có nhiều nốt sần. Toàn cây không có lông, lá có cuống, phiến lá dạng tam giác, chóp lá nhọn, gốc lá thay đổi từ từ đến gần bằng ít khi hơi lõm nông và rộng. Gân chính 9 - 1 0 chiếc, xếp dạng chân vịt, hệ gân phụ dạng mạng rõ. Cụm hoa đực xim tán kép mọc ở nách lá, cuống cụm hoa dạng sợi nhỏ dài 1 - 3 , 5 cm. Đỉnh cuống cum hoa có 6 - 1 cuống tán giả (xim tán) dài 0,6 0.8 cm. Gốc mỗi cuống tán giả có 1 lá bắc hình mác nhỏ dạng vạch. Mỗi tán giả có 5 - 6 xim nhỏ. Mỗi xim nhỏ có 5 - 6 hoa. Hoa đực nhỏ có cuống ngắn 0,5 mm, có 6 lá đài xếp 2 vòng, 3 lá đài vòng ngoài hình mác đảo hẹp, dài khoảng 1 mm, rộng 0,3 mm, 3 lá đài vòng trong hình thìa dài khoảng 1,5 mm, rộng 0,5 mm, 3 cánh hoa hình quạt gần tròn, cong lõm đều, cao khoảng 0,8 1 mm, rộng 1 - 1,5 mm, phía trong gốc cánh hoa có 2 tuyến. Nhị đính thành cột ngắn, bao phấn dính liền thành đĩa, nứt ngang. Cụm hoa cái gần dạng đầu có cuống sợi nhỏ dài 1 - 1 , 5 cm. Đỉnh cuống cụm hoa có 6 - 7 xim nhỏ. ở gốc mỗi xim nhỏ có 1 lá bắc dạng gai nhỏ, mềm. Mỗi xim nhỏ có 6 hoa. Hoa cái nhỏ, gần như không cuống, có 1 lá đài hìh trứng ngược cao 1 - 1 , 2 mm, rộng 0,5 - 0,7 mm. Hai cánh hoa gần tròn, cong dạng vỏ hến, đường kính 1,5 mm. Bầu hình trứng, đưÒTig kính 4 5 mm, núm nhụy có 5 thùy dạng gai nhỏ mềm ngả ra phía ngoài. Chùm quả nhỏ, ít quả. Quả hạch hình trứng ngược, khi chín có màu hồng, v ỏ quả trong hình trứng ngược, dài 5,5 - 6,5 mm, rộng 5,5 mm. Trên lưng có 2 hàng vân ngang dạng trụ. Hai đầu trụ tù tròn, tạo thành 4 hàng vân hạt trên lưng vỏ quả trong. Giá noãn có lỗ. Mùa hoa: tháng 3 - 5 , mùa quả tháng 6 - 7 . + Stephania pỉerrei Diels: Ngọn có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác. Hoa đực không có cánh hoa. + Stephanỉa haỉnanensỉs H. s. Lo. et Y. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt. + Stephanỉa cambodiana Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác. + Stephania dielsiana Y. c. Wu; Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau có màu tím hay tím hồng. + Stephanỉa exentrỉca H. s. Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14 cm. Giá noãn có lỗ lệch 1 bên. + Stephanỉa cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ. + Stephanỉa sínica Diels: Giá noãn không có lỗ. 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh thái. Stephanỉa Lour, là chi có khoảng 45 loài dây leo, thưòng xanh hoặc rụng lá, trong đó có nhiều loài có rễ phình to thành củ. ở Malaysia, có 12 hoặc 13 loài, Trung Quốc có hơn 10 loài, Ấn Độ có 9 loài, ở Việt Nam có ít nhất 1 0 - 1 2 loài, trong đó có 8 - 9 loài có rễ củ to thường gọi chung là củ bình vôi [15 . Các loài bình vôi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Thường gặp ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Hòa Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu,... Một số loài thường chỉ gặp ở vùng núi đất và biến như s. pierreỉ Diels, s. brachyandra, s. hainanensis H.s Lo. Riêng loài s. pỉerreỉ Diels tập trung chủ yếu ở các tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận [4]. Loài Stephanỉa sínica Diels có vùng phân bố rộng rãi nhất ở các tỉnh phía Bắc nhất là Thanh Hóa, Ninh Bình, Hà Nam, Hòa Bình và các tỉnh khác ở vùng Đông Bắc cũng như Tây Bắc. Loài này còn có ở Trung Quốc và Lào. Bình vôi là cây ưa sáng, khi còn nhỏ cây có thể chịu bóng, thường mọc trong các quần thể dây leo nhỏ ở vùng rừng núi đá vôi ẩm. Độ cao phân bố phổ biến ở Việt Nam từ vài chục đến vài trăm mét. Chưa phát hiện thấy cây ở độ cao 1000 m trở lên. Hàng năm, bình vôi có hiện tượng rụng lá vào cuối thu, đầu đông. Đến cuối mùa xuân (khoảng đầu tháng 4), cùng với việc ra lá non trên các chồi vụ thu - đông thấy xuất hiện hoa. Là loại cây có hoa khác gốc, việc thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng. Sau khi quả chín, rụng xuống hạt mắc vào các hốc mùn của núi đá, hạt sẽ nảy mầm vào cuối xuân hoặc đầu hè năm sau. Để có 1 củ bình vôi nặng 3 - 5 kg có lẽ cây phải có độ tuổi khoảng 10 năm. Hiện nay ta đang thu hái củ bình vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang. Khi thu về đem cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô hoặc đem chiết lấy L - tetrahydro palmatin. Có thể trồng bằng hạt. Thu hái quả chín, sấy hạt đem gieo. Ngoài ưom cây giống bằng hạt có thể lấy các đoạn thân cây hoặc cắt phần đầu của củ đem trồng [4]. Trữ lượng bình vôi ở Việt Nam trước đây rất phong phú. Gần 10 năm trở lại đây, do bị khai thác ồ ạt để bán qua biên giới và sử dụng trong nước nên nguồn dự trữ này đã bị cạn kiệt nhanh chóng, vấn đề bảo vệ và khai thác hợp lý các loài bình vôi ở Việt Nam đang là vấn đề cấp thiết hiện nay. 1.1.3. Bộ phận dùng và chế biến. - Bộ phận dùng: Củ (Tuber Stephaniae) đã cạo sạch vỏ nâu đen [4]. + Để đảm bảo chất lượng dược liệu và bảo vệ tồn sinh cho cây, chỉ thu hoạch những củ có trọng lượng từ 800 g đến 1000 g trở lên. + Để củ có hàm lượng hoạt chất cao nhất nên thu hoạch vào mùa th u -đ ô n g [15’. - Chế biến: Khi thu về đem cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô đem chiết lấy rotundin [4 . 1.1.4. Thành phần hóa học. Trong củ bình vôi có các alcaloid. Các loài bỉnh vôi ta đang khai thác có alcaloid chính là L - tetrahydro palmatin (rotundin). Hàm lượng alcaloid toàn phần cũng như L - tetrahydro palmatin thay đổi tùytheo loài và vùng thu hái. Hàm lượng L - tetrahydro palmatin có thể thay đổi từ 0,21% ở loài s. pỉerrei Diels (thu hái ở Tây Nguyên) cho tới 3,55% ở loài s. brachyandra Diels (thu hái ở Hoàng Liên Sơn) [4]. Ngoài L - tetrahydro palmatin, trong củ bình vôi còn 1 số alcaloid khác như: palmatin, roemerin, stepharin, cepharanthin, cycleanin, stepholidin,... Trong thân cây cũng có chứa L - tetrahydro palmatin và các alcaloid khác nhưng hàm lượng thấp hơn nhiều lần hàm lượng có trong củ [13\ Ngoài ra, trong củ bình vôi còn có tinh bột, đường và acid hữu cơ. 7 1.1.5. ứng dụng của củ bình vôi. ■ Trong y học cổ truyền: Củ bình vôi (ngải tượng) là một vị thuốc đã được nhân dân ta dùng từ lâu để chữa các bệnh như mất ngủ, ho hen, sốt, lỵ, đau bụng, ... - Tính vị quy kinh: vị đắng, tính hàn; quy vào 3 kinh tâm, can, tỳ [7^. - Công năng, chủ trị [7]: + An thần: dùng trong các trường họp suy nhược thần kinh, dẫn đến mất ngủ, hoặc bệnh động kinh, điên giản, phối hợp câu đằng, thiên ma. + Kiện vị, giảm đau: dùng trong các trường họp loét dạ dày, hành tá tràng, lỵ, đau răng, đau dây thần kinh, đau do sang chấn. + Giải độc, tiêu viêm, trừ ung thũng, phối họp với thổ phục lỉnh, kim ngân. + Thanh phế, chỉ ho: dùng đối với bệnh viêm nhiễm đường hô hấp, viêm họng, viêm khí quản mạn tính, ho lao. - Liều dùng: 4 - 112 g, dưới dạng thuốc sắc hoặc bột [7]. - Một số bài thuốc sử dụng củ bình vôi [15]: + Chữa phong thấp tê đau, phù thận, ho hoặc nôn ra máu: Củ bình vôi (Stephania cepharantha) 6 - 9 g, sắc nước uống. + Chữa đau bụng đầy hơi, sốt r é t : Củ bình vôi (Stephania kwangsỉensis) 1,5 g, sắc nước uống hoặc dạng bột. ■ Trong chiết xuất hoạt chất: Củ bình vôi chủ yếu được dùng làm nguyên liệu để chiết xuất rotundin hoặc cepharanthin tùy theo loài [4'. Hiện nay các thuốc an thần, gây ngủ được bào chế từ rotundin như Rotunda (Dopharma), Rotundin 30 mg (Pharbaco), Stilux-60 (Trapharco),... 8 đang được tiêu thụ nhiều trên thị trưòng. Nhu cầu rotundin dược dụng ở nước ta khá lớn, tuy nhiên khả năng đáp ứng trong nước vẫn còn ít, phần lớn phải nhập từ Trung Quốc, trong khi nguồn dược liệu củ bình vôi ở nước ta khá phong phú. Vì vậy, chiết xuất rotundin từ củ bình vôi là một hưÓTig có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển trong thời gian tới. 1.2. Sản phẩm - rotundin 1.2.1. Công thức hóa học và tính chất. ■ Công thức hóa học: Năm 1941, ở Việt Nam Bonnet và Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi Stephania rotunda một alcaloid đặt tên là rotundin. Năm 1965, nó được xác định là L - tetrahydro palmatin [15’. - Công thức cấu tạo [6 ]: OCH. 'OCH 3 - Tên khoa học: 5,8,13,13a —tetrahydro - 2,3,9,10 —tetramethoxy - 6H - dỉbenzo[a,g] quỉnolỉzỉn. - Tên khác: rotundin, gindarin, caseanin, hyndarin. - Công thức phân tử: C21H 25NO 4 ■ Tính chất: - Lý tính: + Rotundin là alcaloid ở thể rắn, có màu trắng, không mùi, không vị. Bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiêt [6 '. + Tính tan: không tan trong nước, ít tan trong ethanol và ether, tan được trong chloroform, dễ tan trong acid sulfuric loãng [6 ]. + Năng suất quay cực: [ơ]d^° = - 291° (C = 0,8 ; ethanol 95®). + Điểm chảy: nip = 141V - 144°c [6]. + Phổ IR đặc trưng. - Hóa tính [2]: + Hóa tính của N bậc 3: phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid, tạo muối với các acid vô cơ. + Mạch kép: rotundin (màu trắng) đemoxy hóa bằng iod sẽchuyển thành palmatin có màu vàng. - Bảo quản; trong lọ kín, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng. 1.2.2. Định tính và định lượng. Theo Dược điển Việt Nam IV, trang 551 [6 ]. 1.2.3. Tác dụng dược lý và ứng dụng. ■ Tác dụng dược lý [4, 14]: - Rotundin có tác dụng an thần, gây ngủ, hạ nhiệt, hạ huyết áp, kéo dài thời gian ngủ của các thuốc ngủ barbituric trên súc vật thí nghiệm. Với liều cao có tác dụng chống co giật do corasol, strychnin và sốc điện gây nên. - Tác dụng giãn cơ trơn, do đó làm giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn. - Tác dụng điều hòa đối với tim và bổ tim nhẹ. - Còn có tác dụng điều hòa hô hấp có thể dùng để chữa hen hay chữa nấc. Tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc. Trên lâm sàng rotundin được áp dụng rộng rãi từ 1944 và trong suốt cuộc kháng chiến chống Pháp điều trị có kết quả một số trường họp 10 như: đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như: độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hóa chất. Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tương đưofng với 7,5 g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc 1998) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD 50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn là khá cao của chế phẩm. ■ ứ ng dụng [4]: Rotundin chủ yếu được dùng trong y học để làm thuốc trấn kinh, an thần, dùng trong các trường hợp: mất ngủ, trạng thái căng thẳng thần kinh, một số trường hợp rối loạn tâm thần, ... Rotundin còn được dùng làm thuốc giảm đau trong điều trị loét dạ dày hành tá tràng, đau dây thần kinh, điều tri hen do co thắt phế quản. 1.2.4. Một số chế phẩm có Rotundỉn: Rotundin có thể được bào chế dưới dạng đơn thành phần hoặc phối hợp với các hoạt chất khác. Bao gồm [9]: ■ Dạng đơn thành phần: + Viên Rotundin 30 mg (Pharbaco), Ronxen-30 (XNDP Hà Nội), Rotunda (Dopharma), Rudexen (Mediplantex), Stilux-60 (Trapharco), Rotundin 30 (Saokimpharma), An thần rotundin (XNDP 120),... + Ống tiêm Rotundin Sulfat 60 mg/2 ml (Pharbaco). + Siro An Thần (Công ty CPDP & TBYT Thanh Hóa). 11 ■ Dạng phối họp: + Sen Vông: Viên bao có 50 mg cao khô lá sen, 60 mg cao khô lá vông và 30 mg D,L - Tetrahydro palmatin. Chỉ định: Thuốc an thần, điều tri hội chứng suy nhược thần kinh, trị các chứng mất ngủ, hồi hộp gốc thần kinh. + Sen Vông R (Dopharma): Viên bao phim có 50 mg cao khô lá sen, 60 mg cao khô lá vông, 15 mg rotundin. Chỉ định: Điều trị các chứng mất ngủ, đau nội tạng, đau đầu, đau kinh, đau dạ con sau khi đẻ. + Secluren (Công ty CPDP & TBYT Cà Mau): Viên nén bao phim có thành phần gồm bột thô rotundin, cao đặc lạc tiên, cao đặc tâm sen. 1.3. Chiết xuất rotundin từ củ bình vôi Chiết xuất rotundin từ củ bình vôi có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào dung môi chiết xuất có thể phân loại thành 2 phưong pháp chung sau: - Phương pháp chiết bằng dung môi phân cực: nước, nước acid, cồn,... - Phương pháp chiết bằng dung môi ít phân cực: chloroform, dầu hỏa,... Với mục đích của đề tài là lựa chọn được một phưoTig pháp chiết xuất rotundin từ củ bình vôi đạt hiệu suất cao và có thể áp dụng trong thực tế sản xuất nên chúng tôi tiến hành khảo sát cả 2 phương pháp chiết trên. 12 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu: Củ bình vôi thái lát mỏng, phơi khô thu mua tại phố Lãn ông (có nguồn gốc từ Hòa Bình) đo độ ẩm được 9,23 % theo phương pháp cân. 2.1.2. Hóa chất, dung môi: - NaiCOs khan. - Ethanol96°. - Dầu hỏa. - Than hoạt. - Dung dịch H2SO4 đậm đặc. - Ether dầu hỏa (60 - 90). - Nước cất. - - - Dung dịch NH 3 đậm đặc. Chloroform. Giấy chỉ thị vạn năng. 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ: - Tủ sây. - Bình cầu thủy tinh 1500ml. - Bộ đun sôi hồi lưu. - Bình định mức lOOml. - Máy cất quay. - Bình chiết nguội. - Nồi cách thủy. - Cân kỹ thuật và cân phân tích. - Bình Soxhlet lOOml. - MáyHPLC. - Máy hút chân không và phễu Buchner. - Các dụng cụ khác: cốc có mỏ các loại lOOml, 250ml, 500ml,lOOOml; ống đong, pipet. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết xuất. Đẻ lựa chọn dung môi chiết xuất thích hợp, chúng tôi tiếnhành khảo sát 3 phương pháp chiết tương ứng với 3 dung môi khác nhau: - pp 1: dung môi là nước acid. - pp 2: dung môi là ethanol 96^. L3 - pp 3: dung môi là dầu hỏa. Đánh giá ưu nhược điểm của từng phương pháp dựa trên hiệu quả chiết xuất, chất lượng sản phẩm, khả năng ứng dụng trong thực tế. Từ đó lựa chọn phương pháp ứng với dung môi chiết xuất tối ưu. 2.2.2. Nghiên cứu lưa chon nhiềt ~ • • • đô • chiết. Trên cơ sở dung môi đã được lựa chọn, chúng tôi tiến hành khảo sát chiết ở các nhiệt độ khác nhau. Dựa trên hiệu quả chiết xuất ở các nhiệt độ đó để lựa chọn nhiệt độ chiết xuất thích hợp. 2.2.3. Nghiên cứu lựa chọn số ỉần chiết. Trên cơ sở dung môi và nhiệt độ chiết xuất thích hợp đã lựa chọn, tiếp tục khảo sát lựa chọn số lần chiết thích họp. 2.3. Phương pháp thực nghiệm 2.3.1. Phương pháp định lượng. 2.3.1.1. Định lượng rotundin trong nguyên iiệu củ bình vôi khô: Bằng phương pháp HPLC theo DĐVNIV [6 ]. - Pha động: Dung dịch đệm pH 4,5 - aceton (70 : 30), điều chỉnh nếu cần. Lọc qua màng lọc có cỡ lỗ 0,45 )Lim, lắc siêu âm. - Dung dịch chuẩn: Hoà tan L-tetrahydropalmatin chuẩn trong pha động để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 0,05 mg/ml. - Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu chuyển vào một túi giấy lọc. Thấm ẩm bằng 0,5 ml dung dịch amoniac 6 N (TT), để yên trong 30 phút. Chuyển túi giấy lọc vào bình Soxhlet dung tích 100 ml, thêm 30 ml cloroform (TT), chiết trong 4 giờ đến hết alcaloid. Lấy dịch chiết cô trên cách thuỷ tới cắn, hòa tan cắn trong dung dịch acid sulílirric 5 N (TT) (5 lần, mỗi lần 10 ml). Lọc qua giấy lọc vào bình gạn. Kiềm hoá dịch lọc bằng amoniac đặc (TT) đến pH 10. Chiết bằng cloroform (TT) 4 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bốc