Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces

  • Số trang: 66 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 22 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.212 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.212 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh- Sinh học HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Lê Thị Thu Hương, người đã hướng dẫn em từ bước đầu cho đến khi hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Cao Văn Thu đã cho em những góp ý về kiến thức cùng các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, trung tâm phổ ứng dụng viện Hóa học- Viện Hàn lâm khoa học Quốc gia đã giúp đỡ em trong thời gian làm thực nghiệm. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng là lời cảm ơn em gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thận có hạn, khóa luận này vẫn còn nhiều thiếu sót. Vì thế, em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Vũ Thị Vân Anh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về kháng sinh ................................................................................................. 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh ............................................................................. 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh [11],[16] .............................................................. 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16] ....................................................... 2 1.1.4. Cơ chế kháng kháng sinh [10],[16] .......................................................... 3 1.1.5. Vi sinh vật sinh kháng sinh [10] .............................................................. 3 1.1.6. Con đường và phương pháp tìm kiếm kháng sinh [10] ............................ 4 1.2. Tổng quan về xạ khuẩn. ................................................................................................... 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [5], [7] ................................................. 5 1.2.2. Đặc điểm tế bào xạ khuẩn [5], [7]............................................................ 6 1.2.3. Cơ sở phân loại xạ khuẩn và một số khóa phân loại thường dùng [5] ...... 6 1.3. Các phương pháp nghiên cứu về tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. ..................... 6 1.3.1. Tuyển chọn và bảo quản giống ................................................................ 6 1.3.2. Lên men tổng hợp kháng sinh [6],[10], [11] ............................................ 8 1.3.3. Nghiên cứu tách chiết và tinh chế kháng sinh [10], [11] ........................ 10 1.3.4. Nghiên cứu các đặc điểm của kháng sinh [1] ......................................... 12 1.4. Elaiomycins K và L, kháng sing anzoxy mới được tìm thấy ở Streptomyces sp. Tü 6399 [22] .............................................................................................................................. 13 1.5. Tăng hoạt tính cụm gen sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ở Streptomyces grieus bằng các gây đột biến rsmG. [24] ................................................. 14 1.6. Actinomycin X2, chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên men sinh tổng hợp Streptomyces microflavus [15]............................................................................ 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .................................................................................................. 16 2.1.1 Nguyên vật liệu ...................................................................................... 16 Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ............................................ 16 2.1.2. Thiết bị................................................................................................. 19 2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 20 2.3. Phương pháp thực nghiệm ............................................................................................. 20 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy, giữ giống .......................................................... 20 2.3.2. Nuôi cấy trên môi trường phân loại ISP để định tên xạ khuẩn. .............. 20 2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn ........... 22 2.3.4. Phương pháp lựa chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên ...................................................................................................... 23 2.3.5. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV .............................................. 24 2.3.6. Phương pháp lên men chìm. (hình P6.1, hình P6.2) ............................... 25 2.3.7. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp ........................... 26 2.3.8. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch kháng sinh ...................... 26 2.3.9. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ ........................... 27 2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký ........................................... 27 2.3.11. Phương pháp thu kháng sinh tinh khiết ................................................ 28 2.3.12. Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh .......................................... 29 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. .............................. 30 3.1. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy và chọn VSV kiểm định. .............................. 30 3.2. Kết quả nghiên cứu định tên khoa học. ...................................................................... 31 3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên. ........................................................................................ 31 3.4. Kết quả đột biến. .............................................................................................................. 32 3.4.1 Kết quả đột biến lần 1 ............................................................................ 32 3.4.2. Kết quả đột biến lần 2 ........................................................................... 33 3.5. Kết quả lên men chìm ..................................................................................................... 33 3.5.1. Kết quả lên men chìm chọn môi trường lên men thích hợp .................... 34 3.5.2. Kết quả lên men chìm chọn chủng có hoạt tính cao nhất ....................... 34 3.6. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt. .................................................................... 35 3.6.1 Độ bền pH .............................................................................................. 35 3.6.2 Độ bền nhiệt ........................................................................................... 35 3.7. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết kháng sinh. ................................................... 35 3.8. Kết quả sắc ký tách kháng sinh tinh khiết. ................................................................ 36 3.8.1. Kết quả sắc cột lần 1 ............................................................................. 37 3.8.2. Kết quả sắc ký cột lần 2......................................................................... 39 3.9. Kết quả xác định các đặc điểm của kháng sinh tinh khiết. ................................... 42 3.9.1 Đặc điểm vật lý của kháng sinh. ............................................................. 42 3.9.2. Phổ UV (hình P7.1, P7.2) ...................................................................... 42 3.9.3. Phổ IR ( hình P7.3)................................................................................ 42 3.9.4. Phổ khối (hình P7.4).............................................................................. 43 1. KẾT LUẬN ........................................................................................................................... 44 2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................................................... 45 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AND Acid 2’-deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic B. cereus Bacillus cereus ATCC 9946 B. pumilus Bacillus pumilus ATCC 10421 B. subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633 CW Cell wall (thành tế bào) DMHC Dung môi hữu cơ Dmm Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn (mm) ĐB Đột biến E. coli Escherichia coli ATCC 25922 G (+) Gram dương G (-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại ISP Chương trình Streptomyces quốc tế (International Streptomyces project) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể MS Phổ khối P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108 P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VN 201 (s) Độ lệch S. coelicolor Streptomyces coelicolor S. aureus Staphylococcus aureus ATCC 1228 S. typhi Salmonella typhi DT 220 S. lutea Sarcina lutea ATCC 9341 S. flexneri Shighella flexneri DT 112 SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG- ĐỒ THỊ - HÌNH VẼ Danh mục bảng: Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy định tên ISP Bảng 2.3 : Thành phần môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.4 : Các dung môi hữu cơ sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3.1 : Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trên các môi trường nuôi cấy Bảng 3.2 : Kết quả phân loại xạ khuẩn theo ISP Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS của các chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.4: Kết quả HTKS của các biến chủng sau đột biến lần 1 Bảng 3.5 :Kết quả HTKS của các biến chủng sau đột biến lần 2 Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS khi lên men ở các MTdt khác nhau Bảng 3.7: Kết quả thử HTKS của các chủng và biến chủng sau khi lên men chìm Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền với pH của dịch chiết kháng sinh Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền với nhiệt của dịch chiết kháng sinh Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS khi chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau Bảng 3.11: Kết quả sắc ký lớp mỏng khảo sát hệ dung môi Bảng 3.12: HTKS của các phân đoạn thu được sau SKC lần 1 Bảng 3.13: Kết quả SKLM của các phân đoạn thu được sau SKC lần 1 Bảng 3.14: Kết quả khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2 Bảng3.15: HTKS của các các phân đoạn thu được sau SKC lần 2 Bảng 3.16 : Kết quả SKLM của các phân đoạn sau thu được sau SKC lần 2 Danh mục hình –đồ thị Đồ thị 1: HTKS của các phân đoạn thu được sau sắc ký cột lần 1 Đồ thị 2: HTKS của các phân đoạn thu được sau sắc ký cột lần 2 Hình 1.1 : Tủ ấm Binder Hình 1.2: Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf Hình 1.3: Máy cất quay Buchi Waterbath B480 Hình 2: Nuôi cấy xạ khuẩn trên MT thạch Hình 3.1: Đánh giá HTKS của xạ khuẩn bằng phương pháp khối thạch Hình 3.2: Đánh giá HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc Hình 4.1: Hình ảnh bề mặt và kích thước bào tử Streptomyces. 183.212 Hình 4.2 : Hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn Streptomyces 183.212 Hình 5.1: Bình lên men chìm trên các MTdt sau 7 ngày. Hình 5.2: Dịch lọc lên men sau 7 ngày Hình 6.1: Phổ UV của kháng sinh Hình 6.2: Đỉnh hấp thụ UV và độ hấp thụ của kháng sinh Hình 6.3: Phổ IR Hình 6.4: Phổ MS 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Phát hiện kháng sinh là một trong những phát minh vĩ đại mở ra một bước tiến lớn trong việc điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra, đặc biệt là vi khuẩn. Trải qua nhiều năm tìm kiếm, nghiên cứu và sản xuất, đã có nhiều kháng sinh mới được phát hiện cũng như tổng hợp. Đã có nhiều loài có khả năng sinh kháng sinh được phát hiện, riêng xạ khuẩn đã có tới 660 loài với 3000 chất kháng sinh khác nhau. Ngoài ra công nghiệp hóa dược và sản xuất cũng góp sức tổng hợp nhiều kháng sinh mới. Tuy nhiên song song với đó, sự biến đổi nhanh chóng của vi sinh vật gây bệnh làm xuất hiện nhiều bệnh lý phức tạp, cũng như việc sử dụng kháng sinh tràn lan, không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng xuất hiện nhiều và đặc biệt hiện tượng kháng chéo (kháng các kháng sinh trong cùng một họ) đặt ra nhu cầu cần phải thực hiện nghiên cứu, tìm kiếm phát hiện các kháng sinh mới cũng như các chủng có khả năng sản xuất kháng sinh mạnh. Con đường quan trọng để tìm kiếm các kháng sinh mới vẫn là phương pháp sinh học: nghiên cứu các chủng VSV có khả năng tổng hợp kháng sinh. Chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183.212” tại bộ môn Vi sinh-Sinh học với các mục tiêu:  Sơ bộ định tên khoa học của xạ khuẩn.  Nghiên cứu cải tạo giống, làm tăng khả năng sản xuất kháng sinh của xạ khuẩn.  Xác định điều kiện lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh.  Xác định sơ bộ một số đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh, trong đó định nghĩa được coi là khá hoàn chỉnh cho rằng : “ Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt được nhận từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.” [11] 1.1.2. Phân loại kháng sinh [11],[16] Việc phân loại kháng sinh là cần thiết để các nhà khoa học nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng, độc tính… Kháng sinh được phân loại theo nhiều cách khác nhau : theo nguồn gốc, cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng… Trong đó, cách phân loại theo cấu trúc hóa học là cách phân loại khoa học nhất vì nó giúp người nghiên cứu nhanh chóng định hướng các đặc điểm của kháng sinh mới khi biết được cấu trúc hóa học. Theo cách phân loại này, kháng sinh được phân vào các nhóm như sau:[11]  Các kháng sinh có cấu trúc -lactam (penicillin, cephalosporin)  Các kháng sinh có chứa nhân thơm (chloramphenicol)  Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycoside (streptomycin, gentamicin)  Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)  Các kháng sinh polypeptide (polymyxin, bacitracin)  Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)  Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)  Các kháng sinh chống ung thư nhóm antracyclin (daunorubicin)  Các kháng sinh chống ung thư nhóm actinomycin (actinomycin D) 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16] 3 Kháng sinh có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn dựa trên một số cơ chế:  Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn  Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn  Ức chế tổng hợp acid nucleic (ADN và ARN) của vi khuẩn  Thay đổi tính thấm của màng tế bào  Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp acid folic) 1.1.4. Cơ chế kháng kháng sinh [10],[16] Kháng thuốc là hiện tượng VSV mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu. Thông thường VSV kháng kháng sinh dựa trên một số cơ chế:  Tạo enzyme phân hủy hoặc biến đổi kháng sinh  Thay đổi tính thấm màng tế bào  Thay đổi đích tác dụng  Hoạt hóa con đường trao đổi chất thay thế khác nhau mà hoạt chất không tác dụng. Thực tế cho thấy khi kháng sinh được sử dụng rộng rãi, tính kháng thuốc xuất hiện rồi được lan truyền rộng hơn và trở thành một vấn đề cần được quan tâm vì khi lượng VSV nhạy cảm với kháng sinh ngày càng giảm, số lượng VSV kháng kháng sinh ngày càng tăng. Để giảm thiểu hiện tượng này, ngoài việc sử dụng kháng sinh đúng cách, cần quan tâm nhiều hơn đến việc tìm kiếm các kháng sinh mới từ các VSV sinh kháng sinh. [10] 1.1.5. Vi sinh vật sinh kháng sinh [10] Trong các VSV có khả năng sinh kháng sinh, xạ khuẩn được quan tâm nhiều nhất vì khả năng sinh ra nhiều loại kháng sinh quan trọng. Nhóm xạ khuẩn sinh kháng sinh thường tìm thấy trong môi trường đất. Ngoài ra các loài thuộc chi Bacillus chiếm ưu thế trong môi trường đất, vì chúng có khả năng hình thành nội bào tử bền vững và 4 sản xuất kháng sinh quan trọng như bacitracin ức chế sự sinh trưởng các VSV khác. Trong nhóm VSV nhân thực (eukaryote) người ta quan tâm đến nhiều các loài thuộc nhóm vi nấm (nấm mốc). Nhiều chất kháng sinh quan trọng như penicillin, cephalosporin, griseofluvin… được tìm thấy và sản xuất ở quy mô công nghiệp. 1.1.6. Con đường và phương pháp tìm kiếm kháng sinh [10] Con đường để tìm kiếm một kháng sinh mới thường đi theo các bước sau:  Thu nhập các mẫu đất, nước, bùn hoặc mẫu thực vật từ môi trường sinh thái khác nhau sau đó phân lập trên môi trường thích hợp.  Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật đã thuần khiết để chọn chủng có hoạt tính ức chế hoặc tiêu diệt các VSV kiểm định.  Chọn chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao để nghiên cứu tiếp. Lên men để thu nhận lượng kháng sinh cao hơn, cô đặc và tinh chế kháng sinh. Xác định loài sinh kháng sinh và xác định các đặc điểm của kháng sinh xem đây có phải là kháng sinh mới.  Thử nghiệm độc tính và phổ kháng khuẩn của kháng sinh.  Nếu chất kháng sinh có thể là kháng sinh mới thì lên men ở mức độ cao hơn, thu nhận kháng sinh thô, tách chiết và tinh chế chất kháng sinh.  Xác định tính chất hóa học của các chất kháng sinh nhận được nếu đạt tiêu chuẩn làm thuốc chữa bệnh thì phải so sánh với các tiêu chuẩn đã liệt kê cho một số loại thuốc được phép dùng hay không. 1.2. Tổng quan về xạ khuẩn. Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố rộng trong đất, nước, bùn… và cả cơ chất mà vi khuẩn cũng như nấm mốc không phát triển được. Trung bình trong 1g đất có trên một triệu xạ khuẩn. [7] Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có tỉ lệ G+C>55%, dinh dưỡng kiểu hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (hay còn gọi là khuẩn ti). [5], [7] 5 Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều bởi những sản phẩm trao đổi chất do xạ khuẩn tạo ra có ý nghĩa quan trọng với con người. Trong số kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới, có đến 60% là do xạ khuẩn sinh ra. Ngoài ra, xạ khuẩn còn được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, vitamin, acid hữu cơ. [7] 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [5], [7] Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Khuẩn ti cơ chất là khuẩn ti cơ bản, còn khuẩn ti khí sinh phát triển mạnh hay yếu hay không phát triển còn tùy vào từng chi, loài. Đường kính của khuẩn ti khoảng 0,2 -1,0m đến 2-3m. Đa số khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc của khuẩn ti xạ khuẩn rất đa dạng : trắng, vàng, da cam, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen… Khuẩn ti cơ chất còn có khả năng tiết ra các sắc tố vào môi trường. Khuẩn ti cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh. Vì vậy, người ta còn gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp (khuẩn ti mọc từ khi bào tử nảy mầm). Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau (thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng (vòng đơn cấp hoặc hai cấp)), các đặc điểm này có ý nghĩa quan trọng khi định tên xạ khuẩn. Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử trong đó có các bào tử nang. Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn. Bào tử trần của xạ khuẩn có hình dạng và đặc điểm rất đa dạng: hình tròn, bầu dục, hình que, hình trụ… Bề mặt của bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông. Hình dạng và kích thước bào tử có vai trò quan trọng trong định tên xạ khuẩn. Khuẩn lạc xạ khuẩn có những đặc điểm riêng biệt: không trơn uớt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. Khuẩn lạc của xạ khuẩn khác biệt về kích thước so với nấm lạc của vi nấm (sợi khí sinh của vi nấm lớn hơn của xạ khuẩn 5-10 lần). 6 1.2.2. Đặc điểm tế bào xạ khuẩn [5], [7] Thành tế bào xạ khuẩn có dạng kết cấu lưới, dày 10-20nm. Căn cứ vào kết cấu hóa học, người ta chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:  Nhóm CW I: chứa L, L-DAP, glycin.  Nhóm VW II: chứa Mezo-DAP, glycin.  Nhóm CW III: chứa Mezo-DAP.  Nhóm CW IV: chứa Mezo-DAP, arabinose, galactose. 1.2.3. Cơ sở phân loại xạ khuẩn và một số khóa phân loại thường dùng [5] Có khá nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển, trong đó phải kể đến khóa phân loại của Waksman, Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze…Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn thành các lớp phụ (bộ) Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn. Lớp phụ Actinomycetales được chia thành các họ: Actinoplanacea, Actinomycetacea, Streptomycetacea, Micromonosporacea, Norcadiacea… Riêng với xạ khuẩn chi Streptomyces trong họ Streptomycetacea, được phân loại theo khóa phân loại Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gotlieb đề xuất. Khóa phân loại này dựa trên các đặc điểm về màu sắc, dinh dưỡng như:màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, tiêu thụ các đường khác nhau. Ngày nay, phân loại xạ khuẩn còn được dựa trên việc xác định trình tự gen 16S rADN, việc này đã được tiến hành phổ biến ở các phòng thí nghiệm hiện tại và cho kết quả đáng tin cậy. 1.3. Các phương pháp nghiên cứu về tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. 1.3.1. Tuyển chọn và bảo quản giống Việc nghiên cứu, tìm kiếm, thu thập các chủng có năng lực tổng hợp kháng sinh cao đã được triển khai mang lại hiệu quả kinh tế ngay từ những năm 40 của thế kỉ XX. 7 Việc “tuyển chọn” này là kết quả kết hợp hàng loạt các kĩ thuật chọn giống, tạo chủng và đặc biệt là có sự đóng góp của các kĩ thuật đột biến, dung hợp tế bào, tái tổ hợp và các giải pháp kĩ thuật gen [6].  Phân lập từ thiên nhiên: [10] Dựa trên từng môi trường phân lập khác nhau sẽ thu được chủng cần phân lập. Tùy từng chủng muốn phân lập sẽ sử dụng môi trường khác nhau. Tùy mẫu cần phân lập sẽ có các cách phân lập khác nhau: phân lập trong không khí hay phân lập các mẫu rắn.  Sàng lọc giống bằng phương pháp ngẫu nhiên [10], [11] Sàng lọc ngẫu nhiên là phương pháp lựa chọn giống dựa trên sự biến dị tự nhiên giữa các cá thể. Trong ống giống thuần khiết, các VSV có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau, HTKS có thể tăng lên 20-30%. Tiến hành sàng lọc để lựa chọn cá thể có hoạt tính cao nhất, giữ lại để nghiên cứu tiếp.  Cải tạo giống Để cải tạo giống, có thể sử dụng các phương pháp, kĩ thuật khác nhau: Gây đột biến: sử dụng các tác nhân đột biến tác động làm thay đổi khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn, phương pháp này dễ thực hiện và cho hiệu quả nhanh. Các tác nhân gây đột biến được chia thành các nhóm :[10], [11]  Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), dimethylsulphat hydroxylamine,…  Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia , . Trong đó, tác nhân hay được sử dụng nhất là sáng sáng UV. Ánh sáng UV, 253nm-280nm tác dụng lên acid nucleic dẫn đến dime hóa thymin (TT), thymin – cytosine (TC) hoặc cytosine (CC) tại vị trí C4 và C5. Hậu quả là sao chép bị sai lệch [5], [7], [9].  Tác nhân sinh học: phage Mu, transposon,… => Các tác nhân đột biến hóa học, vật lý với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có đột biến. Đột biến 8 này có thể làm tăng, giảm, không đổi hoặc mất khả năng tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn. Có thể tiến hành đột biến nhiều lần để thu được chủng có HTKS cao. Sử dụng các kĩ thuật di truyền để tạo chủng tái tổ hợp có hoạt tính kháng sinh cao: dung hợp tế bào trần, chuyển gen…. Các phương pháp này khó thực hiện so với gây đột biến nhân tạo  Bảo quản giống [10] Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn cũng như VSV nói chung không những phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản. Tùy theo trang thiết bị và loại VSV cần bảo quản mà có thể sử dụng một trong các phương pháp khác nhau:  Đông khô chủng giống : gồm đông khô VSV, đông khô dịch thể trực tiếp.  Giữ bào tử trong cát và các loại hạt vô trùng  Bảo quản trong tủ lạnh sâu, nhiệt độ âm.  Bảo quản ở nhiệt độ thấp (2oC): phương pháp này còn được gọi là giữ giống trên thạch nghiêng. Đây là phương pháp phổ biến và khá đơn giản. Tuy nhiên thời gian giữ giống không dài nên cần cấy truyền lại môi trường mới. 1.3.2. Lên men tổng hợp kháng sinh [6],[10], [11] Tất cả các quá trình lên men tổng hợp kháng sinh đều là quá trình lên men ái khí. Lên men ái khí được định nghĩa là các quá trình phân giải, chuyển hóa hydratcarbon trong điều kiện ái khí. Theo quan niệm chặt chẽ thì chỉ những quá trình lên men sản xuất các sản phẩm sơ cấp được đề cập như lên men sản xuất acid acetic, acid citric, acid glutamic…Theo nghĩa rộng, lên men ái khí được hiểu bao gồm tất cả các quá trình lên men chuyển hóa các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh và cả vitamin… là những lên men có sản phẩm ứng dụng hết sức quan trọng trong ngành Y-Dược. Trong bình lên men, VSV sinh trưởng theo quy luật. [5], [7] 9 Khi nghiên cứu quá trình sinh trưởng này của VSV, nhận thấy các sản phẩm trao đổi chất được chia làm 2 loại. Sản phẩm bậc một được tạo thành trong pha sinh trưởng đầu tiên của VSV. Trong khi đó sản phẩm bậc hai được tạo thành vào gần lúc kết thúc quá trình sinh trưởng, thường vào gần hoặc chính pha cân bằng. Kháng sinh thuộc sản phẩm trao đổi chất bậc hai. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng phát triển này sẽ giúp điều khiển sao cho VSV phát triển tốt nhất và tạo ra sản phẩm ta mong muốn. Công nghệ lên men phân loại phương pháp lên men thành các loại khác nhau: [6], [10], [11]  Lên men bề mặt: trong lên men bề mặt VSV phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng, oxy được cung cấp từ không khí. Phương pháp này không được phát triển trong công nghiệp sản xuất kháng sinh.  Lên men chìm: các VSV nuôi cấy trong môi trường dịch thể, đối với các VSV kị khí thì không cung cấp khí, còn đối với VSV hiếu khí thì cấp oxy để cho VSV phát triển. Đây là phương pháp sử dụng phổ biến trong công nghiệp để sản xuất các chế phẩm sinh học nói chung và kháng sinh nói riêng. Lên men chìm được phân loại thành các phương pháp khác nhau:  Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với một thể tích xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra các sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta tiến hành các công đoạn cần thiết để thu sản phẩm. Phương pháp lên men chu kì được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như amino acid, các chất kháng sinh.  Lên men có bổ sung : tương tự như lên men mẻ nhưng trong quá trình lên men có bổ sung dinh dưỡng và các yếu tố cần thiết nhằm làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Phương pháp này được áp dụng nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng bình lên men.  Lên men bán liên tục: là quá trình lên men VSV trong điều kiện xác định, khi VSV phát triển trong một thời gian đủ để tạo ra nồng độ sinh khối cần 10 thiết người ta lấy bớt đi một thể tích môi trường bao gồm cả sinh khối, đồng thời bổ sung thêm một thể tích môi trường mới bằng với lượng đã lấy đi. Như vậy với phương pháp này, chỉ cần truyền giống một lần vẫn có thể thu hoạch sản phẩm nhiều lần.  Lên men liên tục: là quá trình nuôi VSV trong thiết bị được cấu tạo đặc biệt để sao cho khi VSV đã phát triển đến giai đoạn hợp lý để lấy đi một thể tích môi trường lên men cùng tế bào và sản phẩm trao đổi chất của chúng, lại bổ sung đúng môt thể tích môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy lúc đó ta được trạng thái cân bằng động. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: [6], [11]  pH môi trường: pH của môi trường ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H+, OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc các cơ chế khác  Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng, kiểu sinh sản, hình thái, quá trình trao đổi chất và nhu cầu dinh dưỡng của VSV. Ở nhiệt độ thấp VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao làm biến tính protein, ARN, VSV có thể bị chết.  Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ làm phá vỡ trao đổi chất trong tế bào. Cần cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy tương đương với tốc độ sử dụng oxy của VSV. => Cần nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men và xác định điều kiện thuận lợi để thu được sản phẩm mong muốn. 1.3.3. Nghiên cứu tách chiết và tinh chế kháng sinh [10], [11] Sau khi kết thúc quá trình lên men VSV, giai đoạn chiết xuất thu lấy sản phẩm cũng vô cùng quan trọng. Các sản phẩm cần thu được thường kém bền và hàm lượng của chúng trong môi trường lên men hoặc nuôi cấy thường thấp. Vì vậy, để thu được
- Xem thêm -