Tài liệu Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan gấm (anoectochilus setaceus blume)

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này Trước hết tôi xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và Th.s Nguyễn Trọng Lực – Trưởng phòng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và các anh chị trong Trung Tâm Ứng Dụng và Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiên, động viên, khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua Nha trang, ngày tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Huỳnh Uyên i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................v KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................................................. vi LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................3 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................3 1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) ................................3 1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào ...................................................................3 1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào .................................4 1.1.2.3. Sự trẻ hoá ............................................................................................4 1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ......................................5 1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ...............................6 1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV ....................................................6 1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng...................................................................7 1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo. .................................................................................7 1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn. ..........................................................8 1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast .............................................................................9 1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời .............................................................9 1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn ..........................................................................10 1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV ..............................................................10 1.1.6.1. Khoáng đa lượng..............................................................................11 1.1.6.2. Khoáng vi lượng ................................................................................12 1.1.6.3. Nguồn cacbon .................................................................................12 1.1.6.4. Các vitamin .......................................................................................13 1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác ...........................13 ii 1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ............................................14 1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................18 1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị ...........................................................................18 1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy ......................................................18 1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh.......................................................................19 1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ...........................................................19 1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm ......................................20 1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV ............20 1.1.8.1. Điều kiện vô trùng .............................................................................20 1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ .........................................................................22 1.1.8.3. pH môi trường ...................................................................................23 1.2. Giới thiệu về cây lan gấm ..............................................................................23 1.2.1. Phân loại thực vật ....................................................................................23 1.2.2. Đăc điểm thực vật ...................................................................................24 1.2.3. Sự phân bố ..............................................................................................26 1.2.4. Tính dược liệu và công dụng..................................................................26 1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm........................................................27 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................28 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy ..................................................................................28 2.2. Nội dung nghiên cứu. ...................................................................................29 2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu..........................................30 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu. ...........................................................................30 2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. .............................................................30 2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm ................30 2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. ...........................32 2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi ....................................................................................33 iii 2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi ......................................................................33 2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh .................................35 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu............................................................................36 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................37 3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm ...........................................37 3.1.1. Khử trùng bằng Javen ............................................................................37 3.1.2. Khử trùng bằng chlorine ........................................................................39 3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin .....................................................40 3.2. Tái sinh chồi ..................................................................................................42 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm ........................................................................................................45 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi ............................................................................................46 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi. ...........................................................................................................................47 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. ...................................................................................................................49 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi ..........50 3.5. Khảo sát quá trình nhân nhanh ..................................................................53 3.6. Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm .....................................................55 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................57 4.1. Kết luận .........................................................................................................57 4.2. Kiến nghị .......................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................58 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu .........................................................................31 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của vật liệu nuôi cấy ........................................................................................................33 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi. ................................34 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. .....34 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi. .........35 Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh ................................................................36 Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen ......................................37 Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine .................................39 Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. ............................40 Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. ...............41 Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy ...............................................................42 Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm. .............45 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi...................47 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi ..........................49 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51 Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh ...............................................................53 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume ............................................25 Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. ..............41 Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng ..............................................................................42 Hình 3.3. Sự tái sinh chồi .........................................................................................44 Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng ........................46 Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau ....................48 Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau .....................50 Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau ..........................52 Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh ................................................................54 Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm ..............................................55 Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm...............................................................56 vi KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT TBTV : Tế bào thực vật DNA : Deoxyribonucleotic acid RNA : Ribonucleotic acid MS :Murashige&Skoog VW :Vaccine và Went KC :Kundson C LS : Linsmainer và Skoog ATP : Adenosine triphosphate GA3 : Acid ascorbic ĐTD : Đơn tử diệp STD : Sông tử diệp 1 LỜI MỞ ĐẦU Thế kỉ 21 được coi là thế kỷ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó dược liệu là tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo. Nắm được, phát huy được tài nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai. Dùng thế mạnh dược liệu đẩy tộc.Từ lâu, người phương đông đã tôn hoa Lan là “ vương giả chi hoa” và người phương tây cũng tôn hoa Lan là “ nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa Lan đã chinh phục người phương Đông và người phươngTây không chỉ cấu trúc kì diệu và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà còn bỡi giá trị làm thuốc của nó. Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không ngừng tăng lên của thị trường.. Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp mà còn vì giá trị làm thuốc của nó. Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng 2 huyết áp, đau nhức khớp xương…Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này. Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus. Blume là loại thảo dược có giá trị và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007. Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. 3 Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng [3] Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác… Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước: - Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn. - Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.[3] 1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi . Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào 4 bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.[7] 1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa. Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào. Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa. Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc. 1.1.2.3. Sự trẻ hoá Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu. Trong nuôi cấy mô TBTV( hay còn gọi là nuôi cấy in vitro), các mẫu non trẻ có sự 5 phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn.[7] 1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau: - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi được nuôi cấy từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây. - Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp. - Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống. - Nâng cao chất lượng cây giống: cây được nuôi cấy đã được loại trừ các mầm bệnh như virus, nấm, vi khuẩn … nên cấy giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh. Vì vậy, cây giống tạo ra có sức sinh trưởng và phát triển tốt, năng suất cây trồng tăng 15-30% so với phương pháp truyền thống. - Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau có thể tạo ra từ phương pháp nuôi cấy môTBTV như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ. - Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế. 6 - Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.[4] 1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp nuôi cấy mô TBTV còn có những nhược điểm: - Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều năng lượng… nên giá thành sản xuất của cây giống cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. - Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. [4] 1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm : - Cấy cây : nuôi cấy cây con và cây lớn hơn - Cấy phôi : gồm nuôi cấy các phôi cô lập đã trưởng thành và chưa trưởng thành - Cấy cơ quan : cấy các cơ quan thực vật tách rời - Cấy mô hoặc mô sẹo : cấy các loại mô tách ra từ một phần nào đó của một cơ quan thực vật - Cấy tế bào và huyền phù tế bào : cấy các tế bào cô lập hoặc cụm tế bào rất nhỏ trong môi trường lỏng - Cấy tế bào trần : cấy teé bào trần thực vật là nuôi cấy những tế bào không có thành (vách) được dùng trong kỹ thuật di truyền - Cấy túi phấn (thể đơn bội) : cấy túi phấn hoặc những hạt phấn chưa trưởng thành để thu được tế bào đơn bội hay mô sẹo trong kỹ thuật di truyền.[3] Trong các phương pháp được liệt kê như trên, các phương pháp thường được áp dụng phổ biến như sau: 7 1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Trong nuôi cấy mô TBTV, một phương thức đơn giản và thường hay được sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, có kích thước từ 0,1 –0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường không cao, Phương pháp này được ứng dụng tạo cây con sạch bệnh virus.[16] Trên thực tế người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm. Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách. Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó, có thể có ba khả năng: - Cây phát triển từ chồi ngọn - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ - Cây phát triển từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ hạ diệp của cây mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho rất nhiều mầm trên mô cấy và một số mầm sau đó sẽ phát triển thành chồi và sau đó sẽ thành cây invitro hoàn chỉnh. 1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo. Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…). Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ cây con vô trùng trong ống nghiệm, rễ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng. Không phải tất cả mọi tế bào trong mẫu cấy đều góp phần hình thành mô sẹo và chỉ có một số loại mô sẹo nhất định mới có khả năng tái tạo lại các cơ quan có tổ chức. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên. Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình: 8 - Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi. - Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn STD dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở các loài cây cỏ hay dây leo. - Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được ưu tiên áp dụng ở ĐTD (đơn tử diệp), vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản phân hoá so với STD (song tử diệp). Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh… Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây. Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy.[16] 1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tử, các hạt phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù cảu bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn khác nhau. Vì vậy mỗi chồi hoa phải kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy. Có hai phương pháp cơ bản trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là : 9 - Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn. - Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng.[16] 1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast Nuôi cấy protoplast được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông là người đầu tiên dùng enzyme để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào rễ cà chua. Trong điều kiệ nuôi cấy phù hợp protoplast có thể táo sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Do không có thành tế bào nên protoplast trở thành một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene.[4] 1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi nho dai, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn. Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng (nitơ, phospho, kali, canxi) và vi lượng (magiê, sắt, mangan, cobê, kẽm,…). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3…) và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới. Dối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đôi với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ ở dạng acid amine, có đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh 10 trưởng có vai trò quan trọng hơn vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp chất này. [4] 1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX. Tế bào đợn có thể ghi nhân bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng enzyme. Mỗi loiạ cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hóa của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.[4] 1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS (Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi trường thích hợp để phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật. 11 Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ bản sau : + Các khoáng đa lượng + Các khoáng vi lượng. + Nguồn cacbon + Các vitamin + Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác + Các chất điều hòa sinh trưởng. + Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar 1.1.6.1. Khoáng đa lượng Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm tức là 30mg/l. Những nguyên tố đó là : N, Fe, P, K, Ca, Mo. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng - Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium và nitrate. Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và trạng thái phát triển của mô. Nitrogen được cung cấp dưới NO3 -, NH4+ [3] - Phospho ( P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng. Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4 - và HPO4 2- còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy. - Kali ( K): K+ là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trò chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ hấp thu photphate. Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat (KNO3), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH2PO4) [3] - Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự có mặt của Ca2+ rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm. Sự ổn định 12 của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bỡi ion Ca 2+. Sự thiếu hụt Ca2+ sẽ làm tăng quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào. Canxi được cung cấp dưới dạng canxi nitrat ( Ca(NO3)2.4H2O) canxi clorua (CaCl2.6H2O) - Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme lien quan trong biến dưỡng cacbonhydrat sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu hết ion Mg2+ đều đc sử dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân bằng anion và cation. Nếu thiếu hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA. Kết quả là cấu trúc và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra thiếu hụt Mg, là yếu tố không thể thiếu trong quá trình trao đổi năng lượng cảu thực vật bỡi vì nó có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP. Mg được cung cấp dưới dạng magiê sunphat ( MgSO4.7H2O) - Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6). Hiện nay hầu hết các phòng phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng tư từ ra môi trường theo nhu cầu mô thực vật.[3] 1.1.6.2. Khoáng vi lượng Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi trường nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng. Các dung dịch vi lượng thường dùng là : Nistch (1951), Heller (1953), Murashige – skoog ( 1962).[7] 1.1.6.3. Nguồn cacbon Trong nuôi cấy mô TBTV, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung các hợp chất hydratcacbon. Nguồn hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường 13 saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V). Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol,... rất ít dùng [7] 1.1.6.4. Các vitamin Thông thường thực vật tổng hợp các vitamincần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy invitro một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamine thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 – 10mg/l. Acid nicotini và pyridixine thường được bổ sung vào môi tường nuôi cấy nhưng cũng không cần thiết cho sự tăng trưởng của nhiều loài thực vật. Acid nicotinic được sử dụng với nồng độ từ 0,1 – 5 mg/l. Pyrdoxine thường được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10mg/l. Myo-inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù đây là một cacbonhydrate chứ không phải là vitamin nhưng nó cũng được chứng minh là kích thích sự tăng trưởng tế bào đa số loài thực vật.[4] Các vitamin khác như biotine, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E … cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy. Inositol cũng được đề cập tới như một loại vitamin có tác dụng kích thich sự sinh trưởng và phát triển của cây một cách đáng kể.[13] 1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các aminoacid cần thiết nhưng sự bổ sung các aminoacid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào và tế bào trần. Amino acid cung cấp cho thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ.[3] Các nguồn nitrogen thường sử dụng trong nuôi cấy mô TBTV là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adnine.