Nghiên cứu khả năng tạo Bacteiocin của vi khuẩn Lactobacillus acidphilus

  • Số trang: 66 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 37 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: DS. Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Lê Ngọc Khánh, người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã đóng góp nhiều ý kiến quí báu và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài. Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đối với em trong suốt quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ em trong học tập và trong cuộc sống. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Phạm Nguyên Phương MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Khái quát về bacteriocin 3 1.1.1. Vài nét về lịch sử 3 1.1.2. Phân bố 3 1.1.3. Danh pháp và phân loại 3 1.1.4. Tình hình nghiên cứu 4 1.2. Bacteriocin của vi khuẩn lactic 6 1.2.1. Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 6 1.2.2. Phân loại 7 1.2.3. Tính chất 8 1.2.4. Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng 9 1.2.5. Đánh giá hoạt tính bacteriocin 11 1.2.6. Chiết xuất và tinh chế 11 1.2.7. Ứng dụng 13 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG 16 PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1. Chủng vi khuẩn 16 2.1.2. Hóa chất 16 2.1.3. Môi trường 16 2.1.4. Máy móc, dụng cụ 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi 18 khuẩn L. acidophilus ATCC 4653 2.2.2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn 18 L. acidophilus ATCC 4653 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 18 2.3.2. Phương pháp nhân giống L. acidophilus 19 2.3.3. Phương pháp xử lí sinh khối L. acidophilus 20 2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin theo cơ chế khuếch 20 tán qua giếng thạch 2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính 21 bacteriocin 2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính 22 bacteriocin 2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng chiết bacteriocin bằng 22 (NH4)2SO4 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi 23 khuẩn L. acidophilus ATCC 4653 3.1.1. Xác định bacteriocin trong dịch lên men 23 3.1.2. Xác định bacteriocin trong sinh khối 26 3.2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi 28 khuẩn L. acidophilus ATCC 4653 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L. 28 acidophilus ATCC 4653 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của 31 L. acidophilus ATCC 4653 3.2.3. Nghiên cứu khả năng chiết bacteriocin của L. acidophilus ATCC 34 4653 bằng phương pháp kết tủa (NH4)2SO4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 39 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC (American Type Culture Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Collection) Kì BC (Bacterial Cellulose) Cellulose vi khuẩn Dha Dehydroalanine Dhb Dehydrobutyrine FDA (U.S. Food and Drug Cục quản lí Thực phẩm và Dược Administration) phẩm Hoa Kì GC Guanine và Cytosine GRAS (Generally Recognized As Được công nhận chung là an toàn Safe) kDa kiloDalton LAB (Lactic Acid Bacteria) Vi khuẩn lactic Lan Lanthionine MeLan MethylLanthionine MRS de Man, Rogosa, Sharpe MRSA (Methicillin-Resistant Tụ cầu vàng kháng methicillin Staphylococcus aureus) PMF (Proton Motive Force) Động lực proton SDS (Sodium Dodecyl sulfate) Natri dodecyl sulfat sp. (species) Loài subsp. (subspecies) Phân loài VRE (Vancomycin-Resistant Cầu khuẩn ruột kháng vancomycin Enterococci) UV (Ultraviolet) Tia cực tím DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Phân loại bacteriocin của LAB 8 2.1 Các hóa chất sử dụng trong đề tài 16 2.2 Các máy móc sử dụng trong đề tài 17 3.1 Kết quả xác định bacteriocin trong dịch lên men của L. 24 acidophilus ATCC 4653 3.2 Kết quả xác định bacteriocin trong sinh khối của L. 26 acidophilus ATCC 4653 3.3 Hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 ở các 30 giá trị pH nghiên cứu trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis ATCC 6633 3.4 Hoạt tính bacteriocin của L. acidophilus ATCC 4653 sau 32 khi được xử lí nhiệt trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis ATCC 6633 3.5 Hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch thu được khi bổ sung (NH4)2SO4 vào dịch lên men của L. acidophilus ATCC 4653 với vi khuẩn kiểm định là B. subtilis ATCC 6633 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 Biểu đồ thống kê số lượng các công bố liên quan đến 5 bacteriocin trên Pubmed trong giai đoạn từ 1950 – 2010 3.1 Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L. acidophilus ATCC 26 4653 trên vi khuẩn kiểm định B. subtilis ATCC 6633 3.2 Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L. acidophilus ATCC 26 4653 trên vi khuẩn kiểm định E. coli ATCC 25922 3.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L. 31 acidophilus ATCC 4653 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của L. 33 acidophilus ATCC 4653 3.5 Sự thay đổi hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch theo nồng độ (NH4)2SO4 sử dụng 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc phát hiện ra các chất kháng sinh đánh dấu một bước tiến cách mạng của loài người trong cuộc chiến chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, công nghệ kháng sinh được đánh giá là một trong những thành tựu khoa học lớn nhất của thế kỉ XX [52]. Tuy nhiên, bước vào thế kỉ XXI, con người đang phải đối mặt với kỉ nguyên hậu kháng sinh với sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới trong khi các chủng vi khuẩn kháng thuốc không ngừng gia tăng [13]. Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển những hợp chất mới có tác dụng kháng khuẩn để giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh là hết sức cần thiết. Bacteriocin chính là một trong số đó [52]. Bacteriocin là những peptid hay protein có tác dụng diệt khuẩn do vi khuẩn sinh ra [34]. Chúng đã được phát hiện từ đầu thế kỉ XX nhưng mới được nghiên cứu rộng rãi trong một vài thập niên trở lại đây khi nhu cầu về những hợp chất kháng khuẩn nhằm thay thế kháng sinh và các chất bảo quản hóa học trở nên cấp thiết [26]. Với đặc tính an toàn đã được FDA xác nhận, vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn sinh bacteriocin thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học [52]. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng ức chế vi khuẩn có hại của các bacteriocin sinh ra bởi LAB [20]. Nisin – một bacteriocin của Lactococcus lactis spp. đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới như một chất bảo quản nguồn gốc sinh học an toàn và hiệu quả [23]. Thành công của nisin đã bước đầu cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn của bacteriocin từ LAB [22]. Tại Việt Nam, bacteriocin của LAB đã bắt đầu được nghiên cứu trong những năm gần đây, tuy nhiên số lượng nghiên cứu chưa nhiều và tập trung chủ yếu trong nhóm ngành thực phẩm và thú y. Với mong muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu bacteriocin của LAB ở Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu 2 khả năng tạo bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn L. acidophilus ATCC 4653. 2. Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi L. acidophilus ATCC 4653. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về bacteriocin 1.1.1. Vài nét về lịch sử Những báo cáo đầu tiên liên quan tới bacteriocin được cho là có từ cuối thế kỉ XIX khi các nhà khoa học nghiên cứu về tính đối kháng giữa các vi khuẩn (bacterial antagonism) [26]. Năm 1925, bacteriocin chính thức được Gratia tìm ra trên một chủng Escherichia coli [74], về sau chất này được biết đến với tên gọi colicin V [73] và nay là microcin V [28]. Năm 1953, thuật ngữ “bacteriocin” lần đầu được đề xuất và định nghĩa bởi Jacob và cộng sự, chủ yếu dựa trên các đặc tính của colicin [34]. Năm 1976, Tagg và cộng sự chỉ ra sự khác biệt giữa colicin và các bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+) [66], từ đó định nghĩa về bacteriocin được mở rộng và đến ngày nay, các peptid và protein do vi khuẩn sinh ra có tác dụng diệt khuẩn đều được gọi là bacteriocin [34]. 1.1.2. Phân bố Bacteriocin là sản phẩm phổ biến của giới vi khuẩn [34]. Chúng đã được tìm thấy ở nhiều nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) và cả trên vi khuẩn cổ (Archaebacteria) [59]. Đến nay, có khoảng 200 bacteriocin đã được mô tả [26]. Tuy nhiên số lượng bacteriocin trong thực tế được ước tính lớn hơn thế rất nhiều. Theo Klaenhammer, 99% các loài vi khuẩn có thể sinh ra ít nhất một bacteriocin [41]. 1.1.3. Danh pháp và phân loại a. Danh pháp Hiện nay chưa có hệ thống danh pháp quốc tế cho bacteriocin. Tên của bacteriocin thường xuất phát từ tên chi hay tên loài vi sinh vật đầu tiên được 4 phát hiện sinh ra bacteriocin đó. Ví dụ như colicin từ E. coli, pyocin từ Pseudomonas pyocynea, megacin từ Bacillus megaterium … [25] b. Phân loại Hệ thống phân loại quốc tế dành cho bacteriocin chưa được chính thức xây dựng và hiện vẫn đang là chủ đề tranh luận trong giới khoa học [26]. Riley và Wertz nghiên cứu bacteriocin theo 3 nhóm: bacteriocin của vi khuẩn Gram (-), bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) và bacteriocin của vi khuẩn cổ [59]. Chi tiết hơn, theo Desriac và cộng sự, bacteriocin được phân loại căn cứ nhiều tiêu chí, trong đó các tiêu chí cơ bản bao gồm: họ vi khuẩn sinh bacteriocin, trọng lượng phân tử, trình tự chuỗi acid amin và cấu trúc của đoạn gen (gene cluster). Các tác giả chia bacteriocin làm 2 nhóm lớn: nhóm thứ nhất là các bacteriocin bản chất protein (protein-bacteriocin), thường được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (-), tiêu biểu là các vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriae); nhóm thứ 2 là các bacteriocin bản chất peptid (peptidbacteriocin), thường được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+), tiêu biểu là các vi khuẩn lactic (LAB). Mỗi nhóm lại được chia thành nhiều lớp và phân lớp [26] (Phụ lục 1). 1.1.4. Tình hình nghiên cứu a. Thế giới Dù được tìm ra từ khá sớm (1925) nhưng thời gian đầu số lượng các nghiên cứu về bacteriocin không nhiều và hầu hết tập trung vào các bacteriocin của vi khuẩn Gram (-). Cho đến những năm 60 của thế kỉ XX, mới chỉ có 3 chi vi khuẩn Gram (+) được đi sâu nghiên cứu về khả năng sinh bacteriocin là Bacillus, Listeria và Staphylococcus [26]. Tuy nhiên, cũng trong giai đoạn này, nisin và subtilin – 2 bacteriocin quan trọng từ vi khuẩn Gram (+) đã được phát hiện. Roger và cộng sự công bố nghiên cứu đầu tiên về nisin vào năm 1928 [60], trong khi subtilin được Jansen và Hirschmann 5 phát hiện vào năm 1944 từ vi khuẩn Bacillus subtilis [37]. Đến đầu những năm 70, trình tự chuỗi acid amin của 2 bacteriocin này mới được xác định rõ [29] [75]. Kể từ những năm 80, số lượng các nghiên cứu về bacteriocin có sự gia tăng đáng kể, bao gồm cả các nghiên cứu trên colicin và trên các bacteriocin khác [26]. Tiếp đó, việc nisin được FDA công nhận đạt tiêu chuẩn GRAS vào năm 1988 [58] đã thúc đẩy sự quan tâm của các nhà khoa học đối với các bacteriocin của LAB bởi tiềm năng ứng dụng to lớn trong công nghệ thực phẩm, y tế, thú y... Kết quả tất yếu là sự bùng nổ các nghiên cứu về bacteriocin của LAB vào những thập niên cuối thế kỉ XX và đầu thế kỉ XXI [26] (Hình 1.1). Hình 1.1: Biểu đồ thống kê số lượng các công bố liên quan đến bacteriocin trên Pubmed trong giai đoạn từ 1950 – 2010 [26] Trong 20 năm gần đây, trên toàn thế giới có 706 bằng sáng chế liên quan tới bacteriocin của LAB đã được cấp, trong số đó có 421 bằng trong lĩnh vực công nghệ bảo quản thực phẩm và 124 bằng về chất trợ sinh (probiotic) cho động vật [26]. Các khả năng ứng dụng khác của bacteriocin như ngăn ngừa 6 nhiễm trùng khu trú [64], làm chất bảo vệ thực vật [33], làm chất thay thế kháng sinh [38]… cũng đã được đề xuất và nghiên cứu bước đầu. Microcin và bacteriocin từ vi khuẩn biển (marine bacteria) là 2 nhóm bacteriocin mới được đưa ra gần đây [26]. Microcin có nguồn gốc từ vi khuẩn đường ruột như colicin [28] nhưng khối lượng phân tử nhỏ hơn và phần lớn được biến đổi sau dịch mã, tương tự nhóm lantibiotic ở vi khuẩn Gram (+) [35]. Các bacteriocin từ vi khuẩn biển đến nay vẫn chưa được nghiên cứu nhiều tuy nhiên được dự báo là sẽ phát triển mạnh trong tương lai gần [26]. b. Việt Nam Ở Việt Nam, bacteriocin bắt đầu được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây, đặc biệt là bacteriocin của LAB [8]. Bên cạnh các nghiên cứu lí thuyết [1] [2] [8], một số công trình đã bước đầu đưa bacteriocin vào ứng dụng trong thực tiễn. Năm 2008, các tác giả Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An đã sử dụng màng mỏng BC hấp phụ dịch bacteriocin của Lactococcus lactis để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu, giúp tăng thời gian bảo quản từ 1 lên 3 ngày [3]. Việc ứng dụng các kĩ thuật tiên tiến như cố định tế bào [3], tái tổ hợp gen [6] [7] nhằm mục tiêu sản xuất bacteriocin đạt hiệu quả cao cũng đang được nghiên cứu. 1.2. Bacteriocin của vi khuẩn lactic 1.2.1. Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin Vi khuẩn lactic (LAB) được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram (+), gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (nonaerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men carbohydrat. LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [43]. Các LAB đều không di động, catalase âm tính, tỉ lệ GC thấp dưới 50% [61]. LAB ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy từng loài, dao 7 động từ 28 đến 45oC. LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn. Nguồn carbohydrat có thể là glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng tinh bột như Lactobacillus amylophilus và L. amylovorus [5]. LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy trong một số loại thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt và rau quả lên men, bột nhào chua…), trên thực vật, trong đường tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của người và động vật [61]. LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men vì các tác động có lợi về mặt dinh dưỡng, cảm quan và tuổi thọ sản phẩm, nhất là với các sản phẩm dễ hỏng như sữa, thịt, cá, một số loại rau quả [43] [69]. Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao sức khỏe với nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc ung thư… [61] Tác dụng kháng khuẩn là một đặc điểm rất đáng chú ý của LAB. LAB sinh ra nhiều loại chất có tác dụng kháng khuẩn: acid lactic, acid acetic, ethanol, acid béo, H2O2, diacetyl… và đặc biệt là bacteriocin. Mặc dù bacteriocin có thể được tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn khác, bacteriocin sinh ra bởi LAB vẫn thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà khoa học bởi tính an toàn và tác dụng ức chế nhiều vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes… [20] Trong số khoảng 200 bacteriocin đã được mô tả cho đến nay, bacteriocin từ LAB chiếm tới 90% [26]. 1.2.2. Phân loại Bacteriocin sinh ra bởi LAB rất đa dạng, trong việc phân loại chúng cũng tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Cách phân loại phổ biến nhất do 8 Klaenhammer và cộng sự đề xuất vào năm 1993 [26], chia bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) nói chung, của LAB nói riêng làm 3 lớp [42]. Đặc điểm của 3 lớp này được tóm tắt trong bảng 1.1. Một số tác giả đã đề xuất lớp thứ 4 gồm các bacteriocin phức tạp trong cấu trúc có carbohydrat hoặc lipid; tuy nhiên dữ liệu về các bacteriocin loại này còn rất hạn chế nên cần được nghiên cứu thêm [34]. Bảng 1.1: Phân loại bacteriocin của LAB [26] [34] [71] Lớp I II III Đặc điểm - Còn gọi là các lantibiotic - Peptid nhỏ (thường < 5 kDa) - Bền nhiệt - Biến đổi mạnh sau dịch mã, dẫn tới sự tạo thành các acid amin hiếm gặp: Lan, MeLan, Dha, Dhb - Chia làm 2 typ: typ A và typ B - Peptid nhỏ (thường < 10 kDa) - Bền nhiệt - Ít biến đổi sau dịch mã, không chứa Lan - Chia làm 4 phân lớp: IIa, IIb, IIc, IId - Protein kích thước lớn (thường > 30 kDa) - Kém bền nhiệt Ví dụ Nisin, lactocin S, epidermin… Pediocin PA-1, lactacin F, enterocin AS48… Helveticin J, millericin, enterolysin… 1.2.3. Tính chất Trừ một số ít các bacteriocin thuộc lớp III là các protein, bacteriocin của LAB đa phần là các peptid [26]. Chúng thường mang điện (+), có tính sơ nước (hydrophobic) hoặc lưỡng thân (amphiphilic) nhưng đa phần là lưỡng thân, gồm từ 20 đến 60 acid amin [50] [71]. Giống như nhiều bacteriocin của vi khuẩn Gram (+), chúng có thể tồn tại dưới dạng các kết tập có khối lượng lớn (30 – 300 kDa) [54] [66]. Dạng kết tập làm giảm hoạt tính của 9 bacteriocin, đồng thời dễ gây nhầm lẫn trong việc xác định khối lượng phân tử của bacteriocin tinh khiết. Để phá vỡ các kết tập này, có thể sử dụng các tác nhân phân tách như urê, SDS, các biện pháp như siêu lọc, chiết loại lipid bằng dung môi hữu cơ [54]. Độ ổn định là một tiêu chí quan trọng khi nghiên cứu về bacteriocin, nó liên quan tới khả năng sản xuất và đưa bacteriocin vào ứng dụng trong thực tế. 3 yếu tố ảnh hưởng thường được đánh giá là nhiệt độ, pH và enzym [54]; ảnh hưởng của các yếu tố này với mỗi bacteriocin có thể rất khác nhau [66]. Đa số bacteriocin của LAB khá bền nhiệt (trừ lớp III), chịu pH acid tốt hơn pH kiềm [66], dễ bị bất hoạt bởi các enzym phân giải protein như proteinase K, pronase, pepsin, trypsin [54]. Ngoài một số nét chung, các bacteriocin của LAB có những đặc điểm riêng rất đa dạng. Một số tính chất cơ bản của các bacteriocin tiêu biểu từ LAB được giới thiệu trong Phụ lục 2. 1.2.4. Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng a. Sinh tổng hợp Bacteriocin được tổng hợp tại ribosom dưới dạng tiền chất không hoạt động, chúng chỉ trở nên có hoạt tính sau khi được biến đổi nhờ các phản ứng enzym đặc hiệu [51]. Theo Tagg và cộng sự, các bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) có thể tồn tại dưới dạng ngoại bào (extracellular form) hoặc gắn với tế bào (cell-associated form), tỉ lệ mỗi dạng phụ thuộc vào đặc điểm môi trường [66]. Môi trường sống của vi khuẩn còn có ảnh hưởng lớn tới lượng bacteriocin sinh ra, trong đó các yếu tố chủ yếu là thành phần môi trường, nhiệt độ và pH. Các yếu tố này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự sản sinh bacteriocin hoặc gián tiếp thông qua sự sản xuất sinh khối do bacteriocin được coi là sản phẩm trao đổi chất bậc 1 của vi khuẩn [20]. 10 b. Phổ tác dụng Phổ tác dụng của các bacteriocin nhìn chung rất khác nhau (Phụ lục 2). Căn cứ phổ tác dụng, có thể chia bacteriocin của LAB làm 2 nhóm. Nhóm thứ nhất là các bacteriocin chỉ có tác dụng trên các loài gần gũi với loài sinh ra nó, ví dụ như lactobin A sinh ra bởi Lactobacillus amylovorus chỉ ức chế một số Lactobacillus sp. gần gũi. Nhóm thứ 2, ít gặp hơn, có phổ tác dụng rộng, ví dụ như nisin sinh ra bởi một số dòng Lactococcus lactis subsp. lactis có khả năng ức chế nhiều vi khuẩn Gram (+). Nói chung, các bacteriocin của LAB thường ít thể hiện hoạt tính trên vi khuẩn Gram (-) [54]. Bacteriocin có thể có tác dụng diệt khuẩn hoặc kìm khuẩn trên các chủng vi khuẩn nhạy cảm, mức độ tác dụng khác nhau do ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nồng độ, mức độ tinh sạch bacteriocin, các điều kiện thực nghiệm… [17] c. Cơ chế tác dụng Cơ chế tác dụng của bacteriocin rất đa dạng, một bacteriocin có thể có nhiều hơn một cơ chế tấn công tế bào đích [52]. Một số cơ chế đã được đề xuất: thay đổi hoạt tính enzym nội bào, ức chế bào tử nảy mầm, tạo lỗ trên màng tế bào… Nhìn chung, lớp vỏ tế bào được coi là đích tác dụng chính của các bacteriocin từ LAB. Bacteriocin phá vỡ tính toàn vẹn của lớp vỏ tế bào vi khuẩn nhạy cảm, gây mất các chất nội bào, tiêu hao PMF, cuối cùng gây chết tế bào [54]. Cơ chế tác dụng cụ thể của bacteriocin ở từng lớp là khác nhau. Các bacteriocin lớp I (lantibiotic) ức chế tổng hợp vách tế bào và / hoặc tạo lỗ trên màng tế bào bằng cách gắn vào lipid II [52]. Các bacteriocin lớp II có cấu trúc xoắn ốc và lưỡng thân nên có thể xen vào màng tế bào đích, từ đó tạo lỗ, khử cực và làm chết tế bào [18]. Cơ chế tác dụng của các bacteriocin lớp III nói chung chưa rõ [54]; một số tác giả cho rằng đó là các lysin tiêu khuẩn hay tiêu 11 khuẩn tố (bacteriolysin), tác động trực tiếp lên vách tế bào đích gây phá hủy tế bào [18]. 1.2.5. Đánh giá hoạt tính bacteriocin Có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin, về cơ bản chúng đều dựa trên việc đánh giá tác dụng đối kháng của mẫu thử đối với các chủng vi sinh vật chỉ thị [66]. Một số ví dụ: phương pháp “spot-on-lawn”, phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [56], phương pháp đo độ đục [40]… (Phụ lục 3). Ảnh hưởng của các tác nhân ức chế khác không phải là bacteriocin như pH, H2O2… cần được loại trừ bằng phương pháp thích hợp [66]. Gần đây một số phương pháp mới để đánh giá hoạt tính bacteriocin đã được đề xuất. Năm 2001, Mugochi và cộng sự đưa ra phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin bằng cách đo nồng độ ion K+ giải phóng từ vi khuẩn chỉ thị [48]. Phương pháp này được cho là có hiệu quả sánh ngang với phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [34]. 1.2.6. Chiết xuất và tinh chế Do tính chất của các bacteriocin rất đa dạng nên không có phương pháp hay qui trình chiết tách chung [32]. Vấn đề thường gặp trong quá trình chiết xuất và tinh chế bacteriocin là sự hao hụt bacteriocin và sự giảm hoạt tính ức chế vi sinh vật [66]. Một qui trình sản xuất bacteriocin chỉ được coi là lí tưởng khi có thể áp dụng với qui mô lớn, cho hiệu suất thu nhận bacteriocin trên 50% và độ tinh sạch khoảng 90% [54]. a. Chiết xuất Bacteriocin có thể được chiết xuất bằng nhiều cách, tiêu biểu trong số đó là các phương pháp: kết tủa bằng amoni sulfat, hấp phụ - giải hấp phụ và chiết bằng dung môi hữu cơ [56]. - Kết tủa bằng amoni sulfat
- Xem thêm -