Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic

  • Số trang: 73 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 26 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

1 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bacteriocin là một loại protein được tổng hợp bởi vi khuẩn. Nó có khả năng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự. Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925. Ông thực hiện công trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này tác động mạnh đến sự phát triển của chất kháng sinh và chất kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn [45]. Bacteriocin đa dạng về cấu trúc, chức năng, sinh thái. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Vì vậy bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi [16]. Vi khuẩn lactic hiện nay được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh tổng hợp nên bacteriocin. Vì thế việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic và bacteriocin là một vấn đề hết sức thiết thực và có ý nghĩa to lớn trong cuộc sống con người[40]. Vi khuẩn lactic được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng có khả năng sinh axit, tạo hương và kháng một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin[3]. Trong công nghiệp thực phẩm, việc nghiên cứu tuyển chọn cũng như tạo ra những chủng vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp bacteriocin cao để sử dụng trong quá trình lên men lactic không chỉ nhằm mục đích bảo quản 2 mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại sản phẩm có tính chất và hương vị mong muốn[41]. Các hướng ứng dụng của bacteriocin chủ yếu gồm: - Bảo quản thực phẩm - Bảo quản các sản phẩm sữa - Bổ sung vào thức ăn gia súc - Muối chua rau quả Bên cạnh đó vi khuẩn lactic còn được sử dụng để sản xuất chế phẩm Probiotic - là sản phẩm chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có lợi cho hệ tiêu hoá. Chúng có khả năng cải thiện hệ thống vi sinh trong đường ruột, tác dụng tốt đến sức khoẻ con người hay động vật. Các chủng vi khuẩn được sử dụng tạo chế phẩm như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei..[47]. Trong ngành mỹ phẩm bacteriocin được sử dụng trong thành phần của một số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm[17]. Những năm gần đây những nghiên cứu trên thế giới đã xác định được bản chất của bacteriocin đồng thời xác định được một số loại bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh ra và khả năng ứng dụng của nó. Những công trình này đã có những đóng góp tích cực , nâng cao chất lượng cuộc sống con người. Đã có những nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm dến việc sử dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic tổng hợp để bảo quản thực phẩm, thay thế các loại hoá chất bảo quản độc hại đồng thời tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao. Tuy nhiên để có thể thu nhận bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa những củng vi khuẩn có khả năng tổng hợp cao tiến tới có thể tạo dựng bằng kỹ thuật sinh học những chủng mới thích hợp phục vụ cho sản xuất công nghiệp. Từ những vấn đề cấp thiết trên việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin (chất kháng khuẩn) của một số chủng vi khuẩn lactic là một trong 3 những vấn đề quan trọng trong việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic. Chính vì vậy, tôi mạnh dạn chọn đề tài: ‘Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic’. Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như dưa chua, nem chua, sữa chua.. trong đó tôi chọn nem chua làm nguồn để phân lập vi khuẩn lactic cho việc nghiên cứu. 2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao. -Khảo sát một số đặc điểm sinh lý và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp bacteriocin của chủng tuyển chọn. - Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh và tìm hiểu về bản chất của bacteriocin thu nhận. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập được vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. - Xác định tính chất đối kháng của bacteriocin với một số loại vi sinh vật gây bệnh. -Xác định được điều kiện nuôi cấy tốt nhất để vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacteriocin cao. - Bước đầu tìm hiểu về bản chất của bacteriocin 4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Đẩy mạnh hướng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong việc sản xuất các chất bảo quản dùng cho thực phẩm. 5. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Luận văn bao gồm các chương mục sau: Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng và hình vẽ 4 Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục 5 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1.Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Hầu hết các vi sinh vật sinh axit lactic đều thuộc về họ Lactobacillaceae và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc.. Vi khuẩn lactic có thể lên men dễ dàng các loại đường đơn như glucose, galactose, mannose ..và đường kép như saccharose, maltose, lactose..được đồng hóa một cách chọn lọc hơn. Còn polysacarit (dextrin, tinh bột, inulin ..) thì chỉ được lên men lactic bởi một vài loài vi khuẩn [4]. Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Để sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn cacbon chúng cần nitơ, axit amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng. Trong quá trình lên men, axit lactic tự do được sinh ra sẽ kìm hãm quá trình sinh trưởng cho nên sự có mặt của một chất đệm là cần thiết để duy trì quá trình lên men [4]. Vi khuẩn lactic thường đòi hỏi đạm hữu cơ (protein, peptit, axit amin). Chỉ có một số ít loài có khả năng sinh trưởng trên môi trường có đạm vô cơ là nguồn đạm duy nhất. Muốn phát triển bình thường vi khuẩn lactic thường đòi hỏi một số chất sinh trưởng. Có những loại vi khuẩn lactic (Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus casei, Lactobacillus arabinosus..) có tính mẫn cảm cao đối với một loại chất sinh trưởng nào đó. Người ta thường sử dụng chúng để tiến hành định lượng các chất sinh trưởng này. Về mặt hình thái vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu hoặc thành chuỗi [4]. Streptococcus lactic là loại vi khuẩn có hình bầu dục thường đứng thành đôi hay thành từng chuỗi ngắn. Chúng phát triển thích hợp nhất ở 30- 6 35oC. Khi phát triển trong sữa chúng có thể làm tích lũy khoản 0.8-1.0% axit lactic tức là khoảng 110-120ot (1ot là lượng axit chứa trong 100ml sữa được trung hòa bởi 1ml NaOH 0.1N). Streptococcus cremoris là loại cầu khuẩn xếp thành hình chuỗi, phát triển tốt nhất ở 25-30oC, không có khả năng lên men maltose và dextrin, khả năng tích lũy axit lactic tương tự như Streptococcus lactic, gram dương và không sinh bào tử. Lactobacillus bulgariccus là loại trực khuẩn hình que dài, phát triển tốt ở 40-48oC, có khả năng tích lũy đến 3-3.5% axit lactic, gram dương và không sinh bào tử. Lactobacillus acidophillus có hình dạng tương tự như Lactobacillus bulgariccus. Chúng cũng phát triển tốt ở 40oC, không sinh bào tử. Vi khuẩn Lactobacillus delbruckii là loại trực khuẩn hình que ưa nhiệt, chúng thích hợp phát triển ở 48-52 oC và có khả năng tích lũy axit lactic, gram dương và không sinh bào tử. S .citrovorus, S. paracitrovorus, S. diaxeli lactic và S. thermophilus có tế bào thường xếp thành hình chuỗi, gram dương và không sinh bào tử. L. lactic, L. thermophilus là những trực khuẩn không tạo bào tử, gram dương không di động. L. casei và L. plantarium là những trực khuẩn xếp thành từng chuỗi, gram dương và không sinh bào tử. 1.1.2.Quá trình lên men lactic [5] Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic và các sản phẩm khác được thực hiện nhờ vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành mà các quá trình lên men lactic được chia làm hai loại: lên men đồng hình và lên men dị hình. Trong quá trình lên men đồng hình, sản 7 phẩm chính là axit lactic. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ axit bay hơi, rượu ethanol và các sản phẩm khác. Quá trình lên men lactic đồng hình được biểu diễn như sau: C6H12O6 CH3COCOOH Glucose CH3CHOHCOOH + Q axit piruvic axit lactic Ở quá trình lên men dị hình, axit lactic không phải là sản phẩm chủ yếu mà còn có nhiều sản phẩm khác như axit acetic, ethanol, CO 2, H2 cũng được tạo thành với lượng đáng kể. Quá trình lên men lactic dị hình được biểu diễn như sau: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + Glucose axit lactic rượu etylic COOHCH2CH2COOH + CH3COOH+ CO2 +H2 axit sucxinic axit acetic Số lượng các sản phẩm phụ hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, thông thường axit lactic chiếm 40%, axit sucxinic chiếm khoảng 20%, rượu etylic chiếm khoảng 10%, axit acetic chiếm khoảng 10% và các loại khí chiếm khoảng 20%. Trong số các loại vi khuẩn lên men lactic điển hình cần phải kể đến các loài: Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, Lactobacillus bulgariccus, Lactobacillus (thermobacterium cereale), acidophillus, Lactobacillus Lactobacillus plantarum, delbruckii Lactobacillus cucumeris fermentatic. Còn thuộc loại vi khuẩn lên men lactic không điển hình có các loài trong giống Leuconostoc (Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextraniccus) và giống phụ beta bacterium. 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic[4][8] 1.1.3.1. Nguồn cacbon Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đường, còn các polisacarit thì thực chất không thể lên men. Tốc độ lên men các loại đường monosacharit, 8 disacharit và oligosacharit là khác nhau. Nếu khi nhân giống người ta dùng một loại đường thông thường thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó và về sau chúng phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này mà không làm ảnh hưởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon khác. 1.1.3.2. Vitamin Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Vitamin B6 một vitamin rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp các axit amin ở các vi khuẩn lactic cũng có thể được thay thế bởi một số axit amin khác. Tuy nhiên tuỳ thuộc vào từng loại vi khuẩn lactic, nhiều loại axit amin được coi là các axit amin không thay thế, tức là buộc phải có mặt trong môi trường. Sự phụ thuộc của tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic vào nồng độ các vitamin có thể được định lượng bởi các phép thử. Vì vậy việc xác định loại vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng của từng loại vi khuẩn lactic khác nhau là rất quan trọng trong nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic. 1.1.3.3. Nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Tuỳ thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sinh trưởng, vi khuẩn lactic được chia làm 2 loại: loại ưa nhiệt và loại ưa ấm. Loại ưa nhiệt gồm có: L. bulgaricus, L. thermophilus, L. delbrueckii..phát triển tốt ở 45-62oC. Loại ưa ấm gồm có L. causasicus, L. lactis, L. helveticus, L. acidophilus, L. bifidus phát triển tốt ở 37-45oC. L. casei, L. plantarum, L.leichmanii, L. brevis, L. buchneri, L. pastorianus.. phát triển tốt ở 28-32oC. 9 1.1.3.4. Muối khoáng Photphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu. Các muối amôn không thể được dùng làm nguồn nitơ duy nhất song chúng gây một ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hoá một số axit amin. Sự có mặt của một số loại muối khoáng không phải là bắt buộc và hàm lượng có sẵn của chúng trong các môi trường phức hợp đã là đầy đủ. 1.2.TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 1.2.1.Giới thiệu chung về Bacteriocin [34], [45] Bacteriocin là một loại protein được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn. Nó có khả năng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự. Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn. Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả năng tiêu diệt E.coli. Những năm gần đây, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn gram âm, trong đó điển hình là colicins. Tuy nhiên những nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương cũng đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo đã cung cấp những thông tin về vấn đề này. Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi khuẩn khác có rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin... Người ta đã đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được dùng trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa những loại bacteriocin khác nhau. Những tiêu chí như sau: - Phạm vi ức chế đối với những loại khác - Sự có mặt của loại protein hoạt động 10 - Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn - Loại tế bào mà nó tác dụng - Những yếu tố di truyền - Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế 1.2.2. Tính đối kháng và phương pháp xác định tính đối kháng [34] Tính đối kháng là khả năng ức chế sự phát triển của một vi sinh vật nào đó. Hiện nay người ta đã xác đinh được nhiều chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật như bacteriocin, chất kháng sinh, virus xâm nhiễm vi khuẩn... Vì vậy trong nghiên cứu bacteriocin thì vấn đề quan trọng là phải xác định xem loại vi khuẩn mà mình nghiên cứu có tính đối kháng đối với một loài vi sinh vật nào đó hay không. Hiện nay người ta đã xác định được một số loại bacteriocin có thể kháng đồng thời nhiều loại vi sinh vật. 1.2.2.1.Phương pháp xác định tính đối kháng Để xác định tính đối kháng, việc thử nghiệm được tiến hành trên môi trường rắn có chủng chỉ thị. Tính đối kháng thể hiện khi chủng chỉ thị bị ức chế trên môi trường đó. Hai phương pháp xác định tính đối kháng thường được sử dụng là phương pháp đối kháng đồng thời và phương pháp đối kháng dần dần. Phương pháp đối kháng đồng thời đơn giản nhất do A.Gratia đưa ra. Trong phương pháp này chủng thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi cấy trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên đĩa thạch và cho chủng thử nghiệm đã được nuôi ủ vào giếng. Phương pháp này thích hợp đối với kiểm tra những khuẩn lạc riêng lẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền. Phương pháp đối kháng dần dần do Fredericq đưa ra sau đó được cải tiến 11 thêm. Trong phương pháp này, chủng thử nghiệm được nuôi ủ trên đĩa thạch trong một khoảng thời gian. Tiếp đó chủng chỉ thị được trải lên bề mặt của đĩa thạch có chủng thử nghiệm. Phương pháp này có độ nhạy hơn so với phương pháp đối kháng đồng thời và phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian và điều kiện nuôi ủ của chủng chỉ thị và chủng thử nghiệm. Một điểm hạn chế của phương pháp này là yếu tố gây ức chế có thể bị bất hoạt do chất gây mê. Cần kiểm tra cả hai phương pháp này để nhận biết một chủng có hoạt tính kháng khuẩn hay không. Điều kiện tối thích cho chủng thử nghiệm phát triển không cần thiết bằng điều kiện để chủng đó sinh tổng hợp chất kháng khuẩn nhiều nhất. Việc áp dụng những phương pháp này có thể xác định được loại vi khuẩn nào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Hạn chế của những phương pháp này là không xác định cụ thể hoạt tính của bacteriocin. Cần loại bỏ những yếu tố gây ức chế mà không có bản chất là bacteriocin. 1.2.2.2.Quan hệ giữa tính đối kháng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Khi nghiên cứu bacteriocin cần loại bỏ những hiện tượng giống bacteriocin. Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh ra kháng chất giống bacteriocin. Một yếu tố quan trọng để phân biệt giữa bacteriophages và bacteriocin là bacteriocin không mang yếu tố di truyền để tự nhân bản. Hamon và Peron đã dùng những phương pháp khác nhau để phân biệt bacteriophages và bacteriocin. Trong đó bacteriophages kháng trysin hơn bacteriocin còn bacteriocin không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím và nhiều loại bacteriocin chịu nhiệt rất tốt. Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzim bacteriolytic có trọng lượng phân tử thấp có những đặc tính giống bacteriocin và rất khó để phân biệt. Tóm lại có nhiều yếu tố có tính đối kháng không có bản chất bacteriocin. Như bacteriophages là một loại vi rút cũng có khả năng diệt vi 12 khuẩn hay antibiotic là một loại kháng sinh cũng có khả năng diệt vi khuẩn. Vì vậy tính đối kháng do nhiều nguyên nhân gây nên và một trong những nguyên nhân tạo nên tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn là khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. 1.2.3. Sinh tổng hợp bacteriocin [34] Điều kiện nuôi ủ đối với những loại sinh tổng hợp nên bacteriocin có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn. Đối với nhiều chủng vi sinh vật điều kiện nuôi cấy để khả năng sinh tổng hợp bacteriocin là cao nhất đã được xác định. 1.2.3.1.Thành phần môi trường nuôi cấy Đối với vi khuẩn gram dương có khả năng tạo bacteriocin thì rất thích hợp với môi trường rắn. Tăng độ nhớt của môi trường bằng cách thêm agar, dextran, glycerol hoặc tinh bột sẽ làm tăng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn streptococci. Nhiều loại môi trường khác nhau có tác dụng khác nhau trong việc làm tăng hay giảm khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Một số thành phần môi trưòng làm tăng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin phải kể đến là: cao men, mannitol, glucose, ion mangan.. 1.2.3.2. Điều kiện nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy bao gồm nhiệt độ, thời gian, sự sục khí và pH ảnh hưởng đến hoạt tính của bacteriocin. Nhiệt độ thích hợp cho loại vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin phát triển cũng là nhiệt độ thích hợp cho việc sinh tổng hợp bacteriocin. Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một khoảng nhiệt độ khác nhau. Số lượng bacteriocin trong một môi trường có thể sinh ra khác nhau ở các pha khác nhau của một chu kỳ phát triển. Việc sinh tổng hợp bacteriocin tốt nhất ở pha phát triển và giảm dần ở những pha tiếp theo. Nhiều nghiên cứu 13 cho thấy bacteriocin được sinh ra sau 8 giờ, đạt tối đa sau 18 giờ đến 24 giờ và sau đó không sinh bacteriocin nữa [23]. Việc kiểm soát pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.Tuỳ từng loại vi sinh vật mà việc điều chỉnh pH là khác nhau. 1.2.4. Phương pháp chiết tách bacteriocin [2] Bacteriocin có bản chất là protein nên việc chiết tách bacteriocin chính là chiết tách protein. Các phương pháp chiết tách và tính sạch protein đều dựa trên những tính chất hoá lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hoà tan của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau 1.2.4.1. Phương pháp nhiệt độ: Để tách các protein khác nhau dựa trên khả năng kết tủa của chúng người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Phương pháp này chỉ nên dùng với các protein bền với nhiệt. Dịch protein được giữ ở 50-70oC trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch. Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 0oC để tránh biến tính. 1.2.4.2.Phương pháp nồng độ proton Protein là các chất lưỡng tính vì vậy trong dung dịch axit và kiềm chúng sẽ bị phân ly như sau: 14 kiềm Protein-COO- + H + Protein-COOH axit axit Protein-NH3+ Protein-NH2 kiềm Do các axit amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng các ion hoá là nguyên nhân tạo ra tính đa diện của protein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide không đáng kể chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên quyết định tính chất tích điện của phân tử protein. Mức độ ion hoá của các nhóm này phụ thuộc vào giá trị pH. Các nhóm axit ở dạng anion trong môi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường axit. Như vậy ở một giá trị pH xác định mỗi protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng không. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Điểm đẳng điện của các axit amin trung tính có giá trị pH tử 5.6-7.0, đối với các axit amin có tính axit là từ 3.0-3.2, đối với các axit amin có tính kiềm là từ 9.7-10.8. Ở điểm đẳng điện độ hoà tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này người ta có thể tách từng phần protein trong hỗn hợp. Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc 15 nhờ tác dụng của pH môi trường. Dịch protein được giữ ở pH<5 trong thời gian xác định. Protein tạp cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. 1.2.4.3.Phương pháp dùng tác nhân hoá học Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết các protein. Phương pháp này tiến hành dựa trên cơ sở: độ hoà tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrat hoá) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính. Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu. Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0oC và có thể đến -20oC như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh. Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4… Tuy nhiên người ta nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại và làm ổn định hầu hết các loại protein. Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến. Độ hòa tan của nó rất lớn ngoài ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein khác nhau thì khác nhau rất nhiều. Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bão hoà. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein. Khi cho muối vào dịch chiết cần có máy khuấy từ để đảm bảo sự hoà tan của muối. Khi dùng dung dịch bão hoà người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hoà khác nhau ở những nhiệt độ nhất định. 16 Khái niệm về số phần trăm của độ bão hoà hoàn toàn đã được đề cập đến. Protein có thể bị kết tủa ở 50% hoặc 70% của độ bão hoà hoàn toàn của (NH4)2SO4. Khi cho dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà vào dịch chiết protein thì nồng độ (NH4)2SO4 không tăng đột ngột, sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu. Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm lạnh hoặc lọc qua phễu Buchner. Khi hoà tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca++ để làm bền protein 1.2.5. Đặc tính của bacteriocin [34] 1.2.5.1.Thành phần hoá học Một vài loại enzim cụ thể như proteinases, lipases.. được sử dụng để xác định thành phần hoá học của bacteriocin. Một trong những bacteriocin đã được xác định thành phần hoá học là Streptosin STH1. Thành phần của nó gồm protein, lipid và nhóm photphat. Phân tích hoá học cho thấy bacteriocin là loại protein đơn giản, có trọng lượng phân tử thấp. Tuy nhiên với nhiều chủng khác như Clostridia, Staphylococci, Lactobacillus thành phần hoá học của bacteriocin bao gồm protein, lipid và carbohydrate[49]. 1.2.5.2. Đặc tính lí học Đặc tính lí học của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương được cho ở bảng sau: 17 Bảng 1.1. Đặc tính lí học của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương Bacteriocin Megacin A-216 Nhiệt độ cho pH Ảnh hưởng của enzim phép Nhạy 60oC/30phút 2-7 Bền Chymotrypsin Pepsin Clostosin A o 100 C/30 phút 4-9 Trypsin Trypsin Rnase Chymotrypsin DNase Clostosin B o 80 C/10 phút 4-9 Pronase P Trypsin Chymotrypsin Pronase P Rnase Clostosin C o 80 C/10 phút 4-9 DNase Trypsin Rnase Chymotrypsin DNase Clostosin D o 100 C/30 phút 4-9 Pronase P Trypsin Rnase Chymotrypsin DNase Boticin E-S5 Boticin P o 100 C/10 phút o 60 C/30 phút 1.1- Pronase P Trypsin 9.5 Chymotrypsin DNase 6.5- Pepsin Trypsin 7.5 RNase Dnase Alkaline phosphotase Phospholipases C,D 18 Butyricin 7423 Perfringocin 100oC/10 phút 100oC/30 phút 2-12 2-12 Trypsin Trypsin 11105 1.2.6.Phổ hoạt động của bacteriocin[34] Hầu hết các bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng. Đối với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn gram dương. Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn gram âm bị ức chế bởi bacteriocin hay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn gram dương. Những vi khuẩn gram dương có khả năng ức chế vi khuẩn gram âm như Lactobacillus acidophilus, Bacillus cereus, Streptococci, Staphylococci, Corynebacteria. 1.2.7.Phương thức hoạt động của bacteriocin[34] Cơ chế kháng khuẩn được thực hiện trên các plasmids. Có 2 lớp plasmid, lớp lớn là những plasmid có số lượng sao chép thấp và lớp nhỏ là những plasmid có số lượng sao chép cao. Những plasmid lớn mang những gen khác như colicin operon. Colicin operon thường được cấu tạo bởi một số gen chính. Những gen này bao gồm một gen miễn dịch, môt gen cấu trúc colicin và một Brp (bacteriocin release protein). Nghiên cứu cho thấy việc duy trì plasmid colicin rất quan trọng đối với tế bào có họ hàng với chúng bởi vì nếu một tế bào mất gen miễn dịch nó nhanh chóng bị phá hủy bởi colicin. Cùng lúc colicin được phóng ra từ tế bào phân chia bằng việc sử dụng lysis protein làm chết tế bào. Bản thân colicin bao gồm 3 phần hình cầu. phần thứ nhất quy định mục tiêu và gắn với cơ quan cảm nhận của tế bào nhạy cảm. Phần thứ 2 liên quan đến chuyển mã hợp tác với tế bào mục tiêu. Phần thứ 3 là có chức năng tiêu diệt và tạo ra một lổ trong màng tế bào mục tiêu hoặc hoạt động như một hạt nhân dể phân giải DNA hoặc RNA của tế bào mục tiêu. Bởi vì chúng nhằm 19 vào cơ quan cảm nhận nhất định và sử dụng cơ chế chuyển mã nhất định nên các tế bào có thể tự thân kháng lại colicin bằng cách ức chế hoặc xóa bỏ gen cho những protein này. Tế bào có tính kháng như vậy có thể bị mất một thành phần chủ chốt (ion sắt hoặc vitamin B) nhưng có lợi là không bị tiêu diệt. Trong bài báo cáo Nobel Laureate, Salvador e. Luria, 1969, nhấn mạnh colicin là độc tố phá vỡ sự ổn định của màng tế bào. Ông ta không hoàn toàn đúng nhưng colicin làm mất nguồn năng lượng của tế bào. 1.2.8. Ứng dụng của bacteriocin [27], [ 36] Bacteriocin đượic ứng dụng nhiêù trong thực phẩm. Bacteriocin được ứng dụng trong giai đoạn đầu của việc ủ bột làm bánh mì, trong lên men súc xích (kháng Listeria) và trong sản xuất phomat (kháng Listeria và Clostridia). Những ứng dụng cuả bacterin được nghiên cứu trong suốt quá trình lên men trong ống nghiệm ở phòng thí nghiệm. Những chủng vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như nuôi ủ ban đầu, nuôi ủ lên men , nâng cao chất lượng và tính an toàn thực phẩm. Hơn nữa chất kháng khuẩn được sản sinh bởi vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống diễn ra trong hệ tiêu hoá của con người vì vậy gây ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. 1.3.CÁC LOẠI VI SINH VẬT GÂY BỆNH DÙNG THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI BACTERIOCIN[1] 1.3.1. Escherichia coli: Escherichia coli là một trong những vi sinh vật thường gặp trong môi trường. Nhiều người không coi E.coli là vi sinh vật gây bệnh do thực phấm song những nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự có khả năng gây bệnh lây lan qua thực phẩm rất nghiêm trọng. E.coli là dạng trực khuẩn Gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, 20 khá phổ biến trong tự nhiên và đặt biệt trong đường tiêu hóa của người và động vật. Chúng lên men đường lactose và glucose, cho phản ứng dương tính với indol và methyl red song có phản ứng âm tính với Voges Proskauer và citrate. Cách hữu hiệu nhất để định danh loài là xác định kiểu huyết thanh, dùng kháng thể tương hợp với kháng nguyên O, H và K của các chủng E.coli khác nhau. Phần lớn E.coli phân lập từ môi trường là loại không gây bệnh. Nhóm E.coli gây bệnh đường ruột EPEC (enteropathogenic E.coli diarrheagenic E.coli) thuộc nhóm huyết thanh đã được xác định về mặt dịch tễ là những tác nhân gây bệnh tuy vẫn chưa chứng minh được cơ chế gây bệnh của chúng thuộc dạng nội độc tố không chịu nhiệt hay nội độc tố chịu nhiệt hay thuộc nhóm xâm nhiễm dạng Shigella. Một nhóm E.coli gây bệnh khác là EIEC (enteroinvasive E.coli) rất giống với Shigella bởi khả năng gây bệnh lỵ do xâm nhiễm và chứng tiêu chảy ở người. Nhóm E.coli gây bệnh cuối cùng là ETEC (enterotoxigenic E.coli) có khả năng sinh một hoặc cả hai loại độc tố ruột từng được biết rõ là loại không chịu nhiệt và loại bền nhiệt không có tính kháng nguyên. Một trong những đặc tính quan trọng của E.coli liên quan đến khả năng chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là do thời hạn sống sót của chúng. Chúng thường chết đi sau cùng một khoảng thời gian như các vi sinh vật gây bệnh khác có ở ruột. Ở thực phẩm qua các biện pháp xử lý như ướp lạnh, cấp đông, chiếu xạ E.coli bị tiêu diệt trong khi một số vi sinh vật gây bệnh khác vẫn chống chịu được và sống sót. Tương tự như vậy nước qua xử lý vẫn chứa một số vi sinh vật gây bệnh trong khi E.coli đã bị tiêu diệt. Chỉ đối với những thực phẩm có tính axit E.coli mới thực sự có giá trị như một chỉ thị về vệ sinh do tính chống chịu cao của chúng đối với pH thấp [1].
- Xem thêm -