Tài liệu Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng aspergillus sp. phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH __________________________ Trần Thị Minh Định NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG ASPERGILLUS SP. PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH _________________________ Trần Thị Minh Định NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG ASPERGILLUS SP. PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN THANH THỦY Thành Phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi tiến hành đề tài.  Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi.  Tôi xin cảm ơn Thầy Phạm Văn Thông, TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết, TS. Nguyễn Tiến Công đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài.  Tôi xin cảm ơn em Nguyễn Vũ Mai Trang, bạn Salihah và bạn Văn Đức Thịnh đã rất nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi.  Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực. Tác giả luận văn Trần Thị Minh Định MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................. iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ............................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... ix DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ............................................................. xii MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Sơ lược về CKS .............................................................................................. 3 1.1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS .............................................................. 3 1.1.3. Cơ chế tác động của CKS ........................................................................ 6 1.1.4. Phân loại CKS ......................................................................................... 9 1.1.5. Ứng dụng CKS ....................................................................................... 13 1.3. Nấm sợi RNM và khả năng sinh CKS .......................................................... 19 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng và sinh KS của NS ........... 21 1.5. Tách chiết và tinh sạch CKS ......................................................................... 25 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27 2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 27 2.1.1. VSV kiểm định ........................................................................................ 27 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................ 27 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 27 2.1.4. Các MT nghiên cứu đã sử dụng............................................................. 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 29 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính KS ...................................................... 29 2.2.1.1. Phương pháp khối thạch ................................................................ 29 2.2.1.2. Phương pháp đục lỗ ....................................................................... 29 2.2.1.3. Phương pháp khoanh giấy lọc ....................................................... 30 2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào .............................. 30 2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi ......................... 30 2.2.3.1. Quan sát đại thể ............................................................................. 30 2.2.3.2. Quan sát vi thể ............................................................................... 31 2.2.3.3. Định danh bằng sinh học phân tử .................................................. 31 2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối NS theo Egorov................................. 32 2.2.5. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và khả năng sinh KS .................................................................................................... 32 2.2.5.1. Lựa chọn MT nuôi cấy thích hợp ................................................... 32 2.2.5.2. Ảnh hưởng của độ mặn .................................................................. 32 2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon .................................... 33 2.2.5.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ ......................................... 33 2.2.5.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................. 33 2.2.5.6. Ảnh hưởng của pH ban đầu ........................................................... 33 2.2.5.7. Xác định động học quá trình lên men ............................................ 33 2.2.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên độ bền CKS .............................. 34 2.2.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................. 34 2.2.6.2. Ảnh hưởng của pH ......................................................................... 34 2.2.6.3. Ảnh hưởng của thời gian ................................................................ 34 2.2.7. Khảo sát khả năng làm giảm sinh khối nấm gây bệnh cây trồng của dịch lên men ......................................................................................................................... 34 2.2.8. Xác định dung môi để thu nhận CKS thô .............................................. 34 2.2.9. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC ................................................ 35 2.2.10. Tách chiết và tinh sạch CKS ............................................................... 35 2.2.10.1. Sắc ký bản mỏng........................................................................... 35 2.2.10.2. Sắc ký cột...................................................................................... 36 2.2.11. Phương pháp xử lí số liệu .................................................................... 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 37 3.1. Tuyển chọn chủng NS có hoạt tính đối kháng mạnh .................................... 37 3.2. Đặc điểm sinh học và phân loại .................................................................... 38 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ........................................................................ 41 3.3.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy ................................................................. 41 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối................................................................ 43 3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon ............................................ 46 3.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ ................................................. 48 3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................... 50 3.3.6. Ảnh hưởng của pH ban đầu ................................................................... 51 3.3.7. Động học quá trình lên men .................................................................. 53 3.4. Khảo sát enzyme ngoại bào .......................................................................... 55 3.5. Khảo sát khả năng kháng khuẩn ................................................................... 56 3.6. Khảo sát khả năng kháng nấm ...................................................................... 57 3.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ bền CKS của chủng Asp. terreus Đ1 ....... 59 3.7.1. Độ bền nhiệt........................................................................................... 59 3.7.2. Độ bền pH .............................................................................................. 60 3.7.3. Độ bền thời gian .................................................................................... 62 3.8. Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 làm giảm sinh khối nấm P. palmivora ........................................................................ 63 3.9. Xác định dung môi để thu CKS thô từ chủng Asp. terreus Đ1 .................... 66 3.10. So sánh CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 với các CKS khác ............... 69 3.11. Xác định MIC của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 ..................................... 70 3.12. Tinh sạch CKS ............................................................................................ 71 3.12.1. Sắc ký bản mỏng.................................................................................. 71 3.12.2. Sắc ký cột............................................................................................. 72 3.12.2.1. Sắc ký cột cao hexan .................................................................... 72 3.12.2.2. Sắc ký cột cao ethyl acetate ......................................................... 73 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 77 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 77 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 79 PHỤ LỤC DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CKS Chất kháng sinh IC50 The half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%) KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus kháng methicillin) MT Môi trường NMR Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) NS Nấm sợi NIC Non- Inhibitory Concentration (Nồng độ không ức chế) RNM Rừng ngập mặn VK Vi khuẩn VKG(+) Vi khuẩn Gram dương VKG(-) Vi khuẩn Gram âm VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng của các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ ..............37 Bảng 3.2. Đặc điểm phân loại chủng nấm sợi Đ1 ..........................................................39 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy lên sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ...............................................................................................................41 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 .............................................................................................44 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ............................................................................46 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 .......................................................................................................................48 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ....................................................................................................50 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH ban đầu trong MT nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 .....................................................................52 Bảng 3.9. Động học quá trình lên men của chủng Asp. terreus Đ1 ...............................53 Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng Asp. terreus Đ1.............................55 Bảng 3.11. Khả năng đối kháng với một số VK của chủng Asp. terreus Đ1.................56 Bảng 3.12. Khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cây trồng của chủng Asp. terreus Đ1 ...................................................................................................................................57 Bảng 3.13. Độ bền nhiệt của CKS chủng Asp. terreus Đ1 ............................................59 Bảng 3.14. Độ bền pH của CKS chủng Asp. terreus Đ1 ...............................................60 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 .......................................................................................................................62 Bảng 3.16. Khả năng làm giảm sinh khối P. palmivora của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 ...................................................................................................................................64 Bảng 3.17. Hoạt tính CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 khi thu nhận bằng các dung môi khác nhau ................................................................................................................................66 Bảng 3.18 . Hoạt tính CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 khi thu nhận n-hexan và ethyl acetate ........................................................................................................................................68 Bảng 3.20. Rf của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 khi triển khai sắc ký trong các hệ dung môi khác nhau ................................................................................................................71 Bảng 3.21. Sắc ký cột cao n-hexan ................................................................................72 Bảng 3.22. Sắc ký bản mỏng để kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn H2 ...................72 Bảng 3.24. Sắc ký bản mỏng phân đoạn E5 ...................................................................74 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc vòng β-lactam [54] ............................................................................5 Hình 1.2. Cấu trúc CKS streptomycin [55] ......................................................................5 Hình 1.3. Cấu trúc CKS tetracyclin [56] ..........................................................................5 Hình 1.4. Cấu trúc CKS erythromycin [57] .....................................................................6 Hình 1.5. Cấu trúc CKS amphotericin B [58] ..................................................................6 Hình 1.6. Cấu trúc CKS penicillin [59]..........................................................................11 Hình 1.7. Cấu trúc CKS cephalosporin [60] ..................................................................12 Hình 1.8. Cấu trúc CKS fumagillin [61] ........................................................................12 Hình 1.9. Cấu trúc CKS griseofulvin [62] .....................................................................13 Hình 1.10. Sản lượng nông nghiệp bị thất thoát [25] .....................................................15 Hình 3.1. Hoạt tính đối kháng với B. subtilis của chủng Đ1 .........................................38 Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với E. coli của chủng Đ1 ...............................................38 Hình 3.3. Mặt trên KL chủng Đ1 ...................................................................................39 Hình 3.4. Mặt trái KL chủng Đ1 ....................................................................................39 Hình 3.5. Sợi nấm chủng Đ1 (x400) ..............................................................................40 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử chủng Đ1 (x400) ..............................................................40 Hình 3.7. Thể bình chủng Đ1 (x400) .............................................................................40 Hình 3.8. Bào tử chủng Đ1 (x400) .................................................................................40 Hình 3.9. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi được nuôi cấy trên các MT khác nhau ........................................................................................................................43 Hình 3.10. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 trên MT có nồng độ muối khác nhau ................................................................................................................................46 Hình 3.11. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 trên MT có nguồn carbon khác nhau ................................................................................................................................48 Hình 3.12. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 trên MT có nguồn nitơ khác nhau ........................................................................................................................................50 Hình 3.13. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi được nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau ........................................................................................................................51 Hình 3.14. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ở các điều kiện pH khác nhau ........................................................................................................................................52 Hình 3.15. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ở thời gian nuôi cấy khác nhau ........................................................................................................................................55 Hình 3.16. Hoạt tính enzyme của chủng Asp. terreus Đ1 ..............................................56 Hình 3.17. Khả năng đối kháng với S. aureus của chủng Asp. terreus Đ1 ....................57 Hình 3.18. Khả năng đối kháng với MRSA của chủng Asp. terreus Đ1 ........................57 Hình 3.19. Khả năng đối kháng với P. palmivora của chủng Asp. terreus Đ1 ..............58 Hình 3.20. Khả năng đối kháng với Colletotrichum sp. của chủng Asp. terreus Đ1 .....58 Hình 3.21. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi xử lí ở các nhiệt độ khác nhau ................................................................................................................................60 Hình 3.22. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi xử lí ở các điều kiện pH khác nhau ................................................................................................................................62 Hình 3.23. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau ...............................................................................................................63 Hình 3.24. Khả năng ức chế sinh khối P. palmivora của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 sau 2 ngày nuôi cấy ........................................................................................................65 Hình 3.25. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu bằng các dung môi khác nhau ........................................................................................................................67 Hình 3.26. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus trước khi lắc với các dung môi .........................................................................................................................67 Hình 3.27. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 sau khi lắc với các dung môi .........................................................................................................................67 Hình 3.28. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu bằng n-hexan68 Hình 3.29. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu bằng ethyl acetate ........................................................................................................................................68 Hình 3.30. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus trước khi lắc với các dung môi .........................................................................................................................69 Hình 3.31. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 sau khi lắc với nhexan và ethyl acetate.....................................................................................................69 Hình 3.32. Hoạt tính đối kháng của 30 µg CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 .................70 Hình 3.33. Hoạt tính đối kháng của 2 µg CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 ...................70 Hình 3.34. Hoạt tính đối kháng của 10 µg CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 .................70 Hình 3.35. Hoạt tính đối kháng của 10 µg ampicillin ....................................................70 Hình 3.36. Hoạt tính đối kháng của 15 µg erythromycin ..............................................70 Hình 3.37. Hoạt tính đối kháng của 2 µg clindamycin ..................................................70 Hình 3.38. Hiện hình sinh học bản mỏng sắc ký trên hệ 100 chloroform: 1 methanol (cao nhexan) .............................................................................................................................71 Hình 3.39. Hiện hình bằng H 2 SO 4 bản mỏng sắc ký trên hệ 100 chloroform: 1 methanol (cao ethyl acetate) ...........................................................................................................71 Hình 3.40. Hiện hình sinh học bản mỏng sắc ký phân đoạn H2 trong 100% acetonitril73 Hình 3.41. Bản mỏng theo dõi sắc ký cột cao ethyl acetate...........................................73 Hình 3.42. Hiện hình hóa học bản mỏng sắc ký phân đoạn E5 trong hệ dung môi 100 chloroform: 3 acid acetic ................................................................................................75 Hình 3.43. Hiện UV bản mỏng chế hóa phân đoạn E5 ..................................................75 Hình 3.44. Qui trình tinh chế CKS .................................................................................76 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ............................................................................................................................. 42 Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ......................................................................................................... 44 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ............................................................................................................................. 47 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 .................................................................................................................................. 49 Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ................................................................................................................. 51 Đồ thị 3.3. Động học quá trình lên men của chủng Asp. terreus Đ1 ....................... 54 Đồ thị 3.4. Độ bền pH của CKS của chủng Asp. terreus Đ1 ................................... 61 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 ................................................................................................................. 63 Đồ thị 3.6. Sự thay đổi sinh khối nấm P. palmivora theo thời gian......................... 64 Đồ thị 3.7. Sự thay đổi sinh khối nấm P. palmivora theo nồng độ dịch lên men .... 65 Biểu đồ 3.4. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 khi thu nhận bằng các dung môi khác nhau ................................................................................................. 66 MỞ ĐẦU  Lí do chọn đề tài Chất kháng sinh (CKS) có vai trò rất quan trọng trong việc chữa trị các bệnh nhiễm trùng cho con người, động vật và bảo vệ thực vật. Từ sau phát hiện penicillin của Alexander Fleming (1928), CKS luôn thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên khắp thế giới. Ngày càng nhiều CKS được đưa vào sử dụng, giúp con người đẩy lùi các vi sinh vật (VSV) gây bệnh. Tuy nhiên, cùng với việc sử dụng kháng sinh (KS) là sự xuất hiện các VSV kháng thuốc. Tình trạng nhiễm các VSV kháng đa KS ngày càng trở nên phổ biến như Candida sp., Staphylococcus epidermis, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Enterococcus sp., Escherichia coli,… Điều này đã làm cho các CKS hiện có trở nên mất tác dụng. Trong cuộc đấu tranh sinh tồn của mình, con người phải tìm kiếm những CKS mới với cơ chế tác động mới (Kotra và Mobashery, 1998; Morschhauser và cộng sự, 2000; Sandven, 2000; Thomson và Moland, 2000). Trong số các VSV sinh KS, nấm sợi (NS) là đối tượng có ý nghĩa cả về mặt lịch sử lẫn y học. NS là đối tượng sinh ra một lượng lớn CKS kháng vi khuẩn (VK), kháng virus, kháng khối u và kháng nấm. Trong số 23000 chất từ VSV có hoạt tính sinh học như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus,… có đến 42% trong số đó có nguồn gốc từ các loài thuộc giới nấm [18]. Hơn nữa, so với CKS từ VK và xạ khuẩn, CKS từ NS có nhiều hứa hẹn hơn trong việc điều trị bệnh cho con người. Vì tế bào của NS và của người đều là tế bào eukaryote, nên đặc điểm miễn dịch có nhiều điểm tương đồng. CKS từ nấm sẽ có hiệu quả hơn trong việc giúp con người chống lại các bệnh nhiễm trùng [37]. Trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đặc biệt lưu ý đến việc tìm kiếm CKS từ NS rừng ngập mặn (RNM). Bởi theo các nhà khoa học, chúng là nguồn sinh các chất có hoạt tính sinh học dồi dào, trong đó có CKS. Và thực tế, họ đã phát hiện nhiều hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư,… từ NS rừng ngập mặn với hoạt tính mạnh hơn rất nhiều so với NS từ đất liền. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nấm sợi RNM sinh KS còn ít. Đặc biệt, nấm sợi ở RNM Cần Giờ sinh KS vẫn còn nhiều vấn đề bỏ ngỏ. Từ những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng Aspergillus sp. phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”.  Mục tiêu: Góp phần nghiên cứu về NS sinh KS ở RNM Cần Giờ.  Nhiệm vụ - Tuyển chọn chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có hoạt tính KS mạnh. - Phân loại đến loài chủng NS nghiên cứu. - Nghiên cứu các điều kiện môi trường (MT) thích hợp cho sinh trưởng và sinh KS của chủng tuyển chọn. - Khảo sát phổ tác động của CKS từ chủng NS nghiên cứu. - Khảo sát các tính chất lí hóa của CKS từ chủng NS nghiên cứu. - Bước đầu thử nghiệm khả năng ức chế nấm gây bệnh cây trồng của dịch lên men từ chủng NS nghiên cứu. - Tìm hiểu khả năng tách chiết để thu nhận CKS thô.  Đối tượng nghiên cứu: Các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ trong bộ sưu tập giống của PTN Vi sinh – Sinh hóa. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về CKS CKS là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV ở ngay cả nồng độ thấp (10-3 – 10-2 µg/ml) [8], [28], [47]. 1.1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS Bệnh truyền nhiễm luôn là mối đe dọa lớn đến sức khỏe của con người. Từ xa xưa, con người đã biết đến khả năng đối kháng của nấm mốc xanh. Lebedinsky (1877) báo cáo về khả năng ức chế các VK đường ruột bởi nấm mốc. Tuy nhiên, những hiểu biết này chưa mang tính hệ thống, và các nhà nghiên cứu chỉ quan tâm đến khả năng kháng VSV của nấm mốc [36]. Mãi đến năm 1928, thời đại nghiên cứu CKS một cách có hệ thống mới bắt đầu. Thời đại này được đánh dấu bằng phát hiện ra penicillin của Alexander Fleming (1881 - 1955). Tháng 9 năm 1928, Fleming phát hiện ra nấm Penicillium notatum có khả năng làm tan Staphylococcus, và đặt tên cho chất kháng khuẩn này là penicillin. Công trình này được công bố vào năm 1929. Tuy nhiên, nó đã bị rơi vào quên lãng do ông chưa tìm ra được cách chiết tách penicillin và giới y học thời bấy giờ cho rằng nấm chỉ đem lại bệnh tật, chứ không thể chữa bệnh được [4], [7], [8], [18], [28], [36], [47]. Năm 1940, E. Chain, H. W. Florey đã lặp lại thí nghiệm của Fleming, chiết rút thành công penicillin. Mặc dù, chế phẩm này chỉ mới chứa 1% CKS nhưng nó đã đẩy lùi nhiều bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và mở ra một kỷ nguyên mới- kỷ nguyên CKS [7], [8], [12], [36], [47]. Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS. Hàng loạt CKS được phát hiện trong giai đoạn này có ứng dụng trong y học như: actinomycin (Waksman, 1940), chloramphenicol (Erhlich, 1947), chlotetracyclin (Dugar, 1948). Trong thập niên 60 và 70 của thế kỉ 20, ngành công nghiệp CKS đã bùng nổ khắp thế giới. Vào những năm 1990, nhiều công ty dược phẩm đã đầu tư để nghiên cứu và phát triển tìm ra các CKS mới do tình trạng kháng thuốc lan tràn của VSV gây bệnh [8]. Đến nay, số lượng CKS tăng lên đến hơn 17000 chất. Tuy nhiên, chỉ có 1 - 2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng rộng rãi trong y học [7]. Sự xuất hiện ngày càng nhiều VK đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm CKS mới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kỳ hậu KS. Chính vì thế, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất CKS là: một mặt cải biến các CKS cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác cũng phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển để tìm ra các CKS mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn [8]. Các thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp DNA, kỹ thuật tách dòng gen và biểu hiện tổng hợp ở E. coli mở ra phương hướng triển vọng trong việc sản xuất các CKS. Kỹ thuật cố định enzyme và cố định tế bào được coi là một trong những hướng nghiên cứu, sản xuất CKS trong những năm cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 [7]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu đầu tiên về CKS được tiến hành bởi Giáo sư Đặng Văn Ngữ. Năm 1951, ông tổ chức 5 đội cơ động sản xuất dịch lọc penicillin để rửa vết thương cho thương binh trong chiến dịch Thu – Đông. Nhiều thương binh đã được chữa lành vết thương bằng dịch lọc CKS này. Sau kháng chiến 9 năm, công trình này được nghiên cứu tiếp tục ở trường Đại học Y Dược Hà Nội [7], [8]. Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, Trường Đại học Sư phạm I Hà Nội đã nghiên cứu sự phân bố, sự lên men các chủng xạ khuẩn sinh CKS có hoạt tính mạnh, phổ rộng từ đất Việt Nam. Viện Khoa học Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất và khả năng ứng dụng của chế phẩm Biovit, Teravit, Bacitracin vào chăn nuôi và bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp [7], [8]. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân về khách quan và chủ quan nên tình hình nghiên cứu về CKS ở Việt Nam hiện nay còn phát triển chậm chạp so với trình độ thế giới [8]. 1.1.2. Bản chất CKS CKS là một nhóm chất đa dạng về mặt hóa học. Trọng lượng phân tử biến động từ 150 – 5000 dalton. Trong một số phân tử chỉ chứa C và H hoặc thường chứa C, H, O, N. Một số chất khác còn chứa cả S, P và halogen. CKS thường chứa nhóm chức như hydroxyl, carboxyl, carbonyl,… đồng thời có cấu trúc đặc trưng của chất hữu cơ (vòng thơm, dị vòng, carbohydrat, polypeptide) [7], [8], [12]. Tất cả các CKS đều ở thể rắn và có cấu tạo hóa học rất khác nhau. Trên cơ sở đó, CKS được chia thành các nhóm chính sau (Egorov và cộng sự, 1985) [8], [36].  Nhóm β-lactam: là một trong những nhóm KS quan trọng nhất cả về mặt lịch sử lẫn mặt y học. Nhóm này bao gồm: penicillin, monobactam, cephalosporin, carbapenem. Tất cả các CKS nhóm này đều có chứa vòng β-lactam đặc trưng, gồm 3 nguyên tử carbon và một nguyên tử nitơ, là một hệ thống dị vòng phức tạp (hình 1.1). Cơ chế tác động của nhóm KS này là ức chế sự tổng hợp thành tế bào của VK [7], [8], [12]. Hình 1.1. Cấu trúc vòng β-lactam [54]  Nhóm polypeptide: tiêu biểu là các CKS bacitracin, polymyxin, gramicidin,… Các CKS này có cấu tạo hóa học là các chuỗi acid amin, có chiều dài từ vài amino aid đến 100 acid amin. Hiện nay người ta đã biết khoảng 1528 CKS thuộc nhóm polypeptide. Tác dụng chủ yếu là chống VKG(-), do các loại VSV khác nhau sinh ra [23].  Nhóm aminoglycoside: là những CKS có chứa các đường amin nối với các đường amin khác bởi liên kết glycoside (hình 1.2). Tiêu biểu là streptomycin, neomycin, kanamycin,… [8]. Hình 1.2. Cấu trúc CKS streptomycin [55]  Nhóm tetracyclin: tiêu biểu là chlotetracyclin, oxytetracyclin, tetracyclin,… Chúng có phổ kháng khuẩn rộng và phần lớn do các loài của chi Streptomyces sinh ra. Hình 1.3. Cấu trúc CKS tetracyclin [56]  Nhóm macrolide: tiêu biểu là CKS erythromycin. CKS này có chứa vòng lactone nối với các aminosaccharose (hình 1.4). Hình 1.4. Cấu trúc CKS erythromycin [57]  Nhóm polyen: tiêu biểu là nystatin, amphotericin B. CKS nhóm này có 3 hoặc nhiều hơn nối đôi hóa trị giữa các nguyên tử carbon (hình 1.5). Chúng có tác dụng chống VKG(-) yếu, chống VKG(+), nấm men, nấm mốc, tuyến trùng [8]. Hình 1.5. Cấu trúc CKS amphotericin B [58] 1.1.3. Cơ chế tác động của CKS Khác với các chất độc, CKS có tác dụng đặc hiệu. CKS tác động lên những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV. Cơ chế tác động này phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ chế phẩm, cấu trúc hiển vi của tế bào VSV, điều kiện biểu hiện chúng và thể hiện theo những phương thức sau: 1.1.3.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào  CKS kháng khuẩn tác động theo cơ chế ức chế tổng hợp thành tế bào Thành tế bào VK có cấu trúc đặc biệt với nhiều chức năng: duy trì hình dạng tế bào, bảo vệ tế bào chống lại áp suất thẩm thấu, là thụ thể của các thể thực khuẩn (bacteriophage), chứa các phần phụ của tế bào [3], [4], [22], [24], [47]. Thành phần chính của thành tế bào VK là lớp peptidoglycan. Peptidoglycan là một đại phân tử, có cấu trúc gồm các chuỗi