Tài liệu Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài việt nam (paphiopedilum vietnamense) đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI VIỆT NAM (Paphiopedilum vietnamense) ĐÃ BỊ TUYỆT CHỦNG NGOÀI TỰ NHIÊN LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI VIỆT NAM (Paphiopedilum vietnamese) ĐÃ BỊ TUYỆT CHỦNG NGOÀI TỰ NHIÊN Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. BÙI TRI THỨC 2. TS. LÃ VĂN HIỀN THÁI NGUYÊN - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng hoặc công bố trong bất kì công trình nào khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc . Tác giả luận văn Dương Thị Thu Hoài ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm thuộc trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Tri Thức và TS. Lã Văn Hiền đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài và hoàn thiện luận văn Thạc sĩ. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ, chia sẻ, giúp đỡ, đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu. Trong quá trình học tập và nghiên cứu khó tránh khỏi những thiếu sót. Do đó, tôi mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô để luận văn được hoàn thiện hơn Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022 Tác giả luận văn Dương Thị Thu Hoài iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] .............................................................12 Bảng 2.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ....................................................................21 Bảng 2.2. Nghiên cứu ảnh huởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H202 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phôi lan hài Việt Nam. .....................25 Bảng 2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi lan hài Việt Nam ..............................................................................26 Bảng 2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro..............................................33 Bảng 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) ............37 Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) .....39 Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ................................41 Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy). ...............................43 Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy). ...............................45 Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ................................................47 Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)..............................49 Bảng 3.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ (nước dừa, khoai tây, chuối nghiền, cà rốt, dịch chiết nấm men) đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)..............................52 iv Bảng 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) .......................55 Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)..............................57 Bảng 3.11. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ......................................59 Bảng 3.12. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy). .....................................61 Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước bầu đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy invitro (sau 40 ngày ra cây)...........................................................................................................63 Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (sau 40 ngày ra cây)...........................................................................................................65 Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu thành phần một số giá thể thích hợp đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (40 ngày ra cây) ......................................................................................67 Bảng 3.16. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (sau 40 ngày ra cây) ..... 67 v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1: Hình thái cây và hoa của Paphiopedilum ...................................................8 Hình 1.2: Hình ảnh về cây lan hài Paphiopedilum Vietnamense. .............................19 Hinh 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy).........40 Hình 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy). .................................42 Hình 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh của chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ..................................................44 Hình 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tái sinh của chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ..................................................46 Hình 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi của lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ............................................48 Hình 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ................................51 Hình 3.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ (nước dừa, khoai tây, chuối nghiền, cà rốt, dịch chiết nấm men) đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ................................53 Hình 3.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam(sau 30 ngày nuôi cấy) ..........................56 Hình 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ..................................58 Hình 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho lan hài Việt Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ..................................60 Hình 3.11. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho lan hài Việt Nam .......................................................................62 Hình 3.12. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro (sau 40 ngày ra cây) .............................................................................................................66 Sơ đồ 01: Nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan hài Việt Nam. ...........................24 vi DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt B5 BAP CC CN CR Cs CT CV CW ĐC DCNM DL GA3 IAA IBA IUCN Kinetin KT KTST LSD MS MT NAA ND PLB RE RL TDZ THT TN VQGCT VW WPM Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ Gamborg cs, 1976 6-Benzyl amino purine Cao Cây Chuối nghiền Cà rốt Cs Công thức Coeficient of Variation – Hệ số biến động Coconut water - Nước dừa Đối chứng Dịch chiết nấm men Dài lá Gibberellic acid Indole-3-acetic acid Indole-3-butyric acid International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế 6-Furfurylaminopurine Khoai tây Kích thích sinh trưởng Least Singnificant Difference Test Murashige & Skoog’s, 1962 Môi trường α-Naphthalene acetic acid Nước dừa Protocorm-like body - Cơ quan giống như protocorm Robert Ernst Rộng lá Thidiazuron Than hoạt tính Thí nghiệm Vườn Quốc Gia Cát Tiên Vacin and Went, 1949 Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980 vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ ............................................................................. v DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ..................................................... vi MỤC LỤC .................................................................................................................vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài.................... 3 1.1.1. Giới thiệu chung về các loài lan trên thế giới ................................................... 3 1.1.2. Phân loại lan hài trên thế giới ........................................................................... 4 1.1.3. Phân bố lan hài trên thế giới ............................................................................. 5 1.1.4. Bảo tồn và nhân giống lan hài trên thế giới ...................................................... 9 1.2. Tổng quan nghiên cứu lan hài trong nước ......................................................... 12 1.2.1. Hiện trạng về các loài lan hài ở Việt Nam ...................................................... 12 1.2.2. Công tác bảo tồn lan hài ở Việt Nam .............................................................. 15 1.2.3. Công tác nhân giống Lan Hài ở Việt Nam ...................................................... 17 1.3. Đặc điểm hình thái của loài lan hài Việt Nam ................................................... 18 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 21 2.1. Đối tượng, phạm vi ............................................................................................ 21 2.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu........................................................................ 21 viii 2.1.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................... 22 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 22 2.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phôi lan hài Việt Nam. ............................. 22 2.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam. .......................................................................................................................... 22 2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam........................... 23 2.2.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính và một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam. ............ 23 2.2.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước bầu, một số giá thể và dinh dưỡng đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro. .......................................................................................................................... 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 23 2.3.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro ............................................................ 23 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro ................................. 23 2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................ 24 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính và một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam ........... 30 2.3.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước bầu, giá thể và dinh dưỡng đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro.31 2.4. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu .............................................................. 34 2.4.1. Thu thập số liệu ............................................................................................... 34 2.4.2. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................ 34 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 36 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H202 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng phôi lan hài Việt Nam........................................ 36 ix 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam........... 38 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam. ................................................................ 38 3.2.2.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh và phát triển phôi lan hài Việt Nam ..................................................... 40 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam. ................................. 46 3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam. ........................................................... 46 3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Việt Nam. ........................................................................... 51 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính và một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam. ............................. 54 3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam..................................................................................... 54 3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Việt Nam ................................................ 56 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước bầu, một số giá thể và dinh dưỡng đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro.62 3.5.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước bầu đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro. .................................................. 63 3.5.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể và dinh dưỡng đến khả năng sống, sinh trưởng của cây mô giai đoạn sau nuôi cấy in vitro. ........................ 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 70 1. Kết luận ................................................................................................................. 70 2. Đề nghị .................................................................................................................. 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 72 PHỤ LỤC 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là thú phủ hoa lan tầm cỡ thế giới với 22 loài thuộc giống lan hài, trong đó có nhiều loài là đặc hữu quý giá chỉ có ở Việt Nam như lan Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,….. Tuy nhiên, tất cả các loài thuộc chi Paphiopedilum đang nhanh chóng biến mất. Các nghiên cứu thực địa của Averyanov và đồng tác giả (2004) chỉ ra rằng mức độ đe dọa tuyệt chủng của các loài lan hài là rất nguy cấp và cần ưu tiên bảo vệ ở Việt Nam [8]. Sự suy giảm nhanh chóng số lượng loài lan Hài ở Việt Nam là do hai yếu tố: Đầu tiên là sự thay đổi môi trường sống do con người gây ra thông qua khai thác gỗ, phá rừng không có kế hoạch. Yếu tố thứ hai là người dân địa phương thu hái lan Hài trên quy mô lớn và bán cho những người buôn bán lan. Có rất ít nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào để nhân giống loài lan Hài đặc hữu ở Việt Nam, kết quả thu được rất ít đó là kỹ thuật khử trùng mẫu còn kém, một số thành công đầu tiên được ghi nhận trên 2 loại là Hài Hằng và Hài Hồng. Lan Hài Việt Nam có tên khoa học Paphiopedilum vietnamense đẹp lạ kỳ với lá có đốm khảm và hoa to, màu tím hay đỏ hồng là một trong số loài lan có kiểu dáng đặc biệt với hình dáng. Lan hài Việt Nam là loài có phạm vi phân bố hẹp nhất trong số các loài lan đặc hữu của Việt Nam, chỉ phát hiện ở các tỉnh miền Bắc (Cao Bằng, Thái Nguyên, Hà Giang, Vườn quốc gia Ba Bể) trong rừng nguyên sinh rậm, ẩm, cây lá rộng trên núi đá vôi tinh khiết bị bào mòn, độ cao từ 350 - 500m. Chính vì sự phân bố rải rác như vậy đã dẫn tới vùng sinh thái khác nhau tạo lên sự đa dạng sinh học giữa các loài [10]. Đặc thù riêng của lan hài Paphiopedilum vietnamense là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm của hạt trong tự nhiên thấp người dân khai thác ồ ạt đã đẩy lan hài Việt Nam rơi vào danh mục các loài nguy cấp cần phải bảo tồn. Từ thực trạng trên thì việc tìm ra một giải pháp để bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật quý hiếm như lan Hài là cần thiết. Ngày trước với sự lạc hậu về kỹ thuật và công nghệ, 2 các nhà nghiên cứu đã nhân giống các loài lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mần... nhưng tỷ lệ thành công đạt được rất thấp và chất lượng cây thu được không cao. Ngày nay với những tiến bộ trong khoa học phương pháp nhân giống in vitro ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Quy trình này tạo ra một số lượng lớn cây trồng chất lượng cao, đồng đều, sạch bệnh. Đây là điều bạn không thể làm với các phương pháp truyền thống. Hiện nay, nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy in vitro có thể tạo ra một lượng lớn cây giống sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền trong thời gian ngắn đang ngày càng phát triển, đáp ứng được khả năng tài chính nên được thị trường công nhận và được xem là một giải pháp lý tưởng để cứu loài lan hài khỏi nguy cơ tuyệt chủng. Trước thực trạng đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài Việt Nam (Paphiopedilum vietnamense) đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên" là hết sức cần thiết, nhằm làm cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển lan hài Việt Nam. 2. Mục tiêu của đề tài Xây dựng được quy trình nhân giống lan hài Việt Nam bằng phương pháp in vitro. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dữ liệu khoa học mới về việc nhân giống cây lan Hài Việt Nam bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật và góp phần làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Kết quả nghiên cứu góp phần lưu giữ và bảo tồn nguồn gen có giá trị một cách bền vững. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài 1.1.1. Giới thiệu chung về các loài lan trên thế giới Theo hệ thống phân loại của Taktajan cùng Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến. Cây hoa lan thuộc nghành mộc lan (hạt kín -Magnoliophyta), lớp hành (1 lá mầm - Liliospida), phân lớp hành (Lilidae), bộ lan (Orchidales), họ lan (Orchidaceae). Họ lan là một họ lớn đứng thứ 2 trong nghành Mộc lan, đây là loài phong phú, phức tạp và được phân bố trên những vùng địa lý khác nhau. Nhìn chung, họ lan phân bố từ 68 vĩ độ Bắc đến 50 vĩ độ Nam, nghĩa là gần cực Bắc như Thụy Điển, Alaska… xuống tận các đảo cuối cùng của cực Nam nước Úc [22]. Cho tới nay, loài người đã biết được 750 chi và khoảng 25.000 loài lan, bao gồm các cây thân thảo sống lâu năm. Khi ở đất chúng có dạng củ nạc (củ giả), tầng rễ mặt rất nhiều còn được gọi là địa lan, hoặc bám vào cành cây và thân cây gọi là phong lan. Các loài lan sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường khí hậu nhiệt đới. Theo tài liệu của R.L Dresler (1981) thì Châu Mỹ có 306 chi và 8266 loài và được coi là cái nôi của các loài lan nổi tiếng, một số loài lan được con người nuôi trồng rộng rãi như: Cattley 60 loài, Epidendrum 500 loài, Odontoglossum 200 loài [31]. Các khu vực nhiệt đới khác có ít chi và loài hơn, nhưng có các chi và loài đặc hữu, chẳng hạn như ở Châu Phi và Úc. Họ lan giảm bớt số chi, loài khi vượt qua các vùng nhiệt để tới các vùng khí hậu lạnh. Ở vùng ôn đới bán cầu Bắc có khoảng 75 chi và 900 loài. Ở vùng bán cầu Nam có số chi và loài ít hơn: 40 chi và 500 loài. Nó cũng phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới, từ đầm lầy ven biển đến đồi thấp đến núi cao. Ở Colombia có 1 số loài lan sống ở vùng núi quanh năm tuyết phủ. Hoa lan phân bố rất rộng rãi, từ vùng lạnh và gió đến sa mạc nóng và khô, từ rừng núi cao và rừng nhiệt đới đến đồng cỏ đồng bằng và thậm chí cả đầm lầy.. Đa số lan ưa mọc tại các rừng cây nhiệt đới nhất là tại vùng núi Andes miền Nam Mỹ và vùng Hymalaya của Châu Á [6]. 4 Do đặc tính chỉ sống tại vùng nhiệt đới nên các nước châu Âu hầu như biết đến hoa lan rất muộn. Người dân ở đây biết đến hoa lan do sự giao thương hàng hóa, khách du lịch hoặc từ các nhà truyền giáo. Với chiếc hài nằm ở bông hoa làm cho bông hoa có hình dạng như một cái túi đã tạo nên một dáng vẻ rất độc đáo, dễ dàng nhận ra ở loài lan Hài. Môi nhô ra và hình dạng hoa khác thường cho phép loài lan này dễ dàng phân biệt với những loài khác, do đó có tên chung cho nhóm hoa lan này [6]. 1.1.2. Phân loại lan hài trên thế giới Theo hệ thống phân loại lan hài (Paphiopedilum) là một nhánh của họ lan (Orchidaceae) thuộc bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta) [6]. Lan hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Lan hài rất dễ nhận biết sự khác biệt so với các loài lan khác do hình thái cấu trúc hoa rất đặc biệt. Hoa chỉ có một cánh hoa hình túi nhìn giống như chiếc hài, dựa vào hình thái đặc biệt giống chiếc hoa nên loài lan này được đặt tên là lan hài. Trên thế giới hiện nay đã phát hiện được 5 chi lan hài đó là: + Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc [6]. + Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mỹ [6]. + Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon [6]. Ở Việt Nam các loài lan hài đều thuộc chi Paphiopedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [22], [42]. 5 1.1.3. Phân bố lan hài trên thế giới Lan hài phân bố khá rộng trên thế giới, từ vùng nhiệt đới cho đến vùng ôn đới lạnh. Chi lan hài Cypripedium, được phát hiện ở vùng núi núi Châu Âu, một số tỉnh phía Bắc Trung Quốc, vùng phía Đông thuộc Nga, và vùng núi cao Hymalaya. Chi lan hài Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium, được phát hiện nhiều vùng rừng miền nam Canada, vùng miền Bắc Mexico, Argentina.... - Phân bố của loài lan hài phổ biến vùng nhiệt đới (Paphiopedilum) Sự phân bố của Paphiopedilum kéo dài về phía đông từ vùng nhiệt đới của chân núi Himalaya đến Trung Quốc, Philippines, Đông Nam Á, Đông Nam Á và quần đảo Solomon. Sự mở rộng phân bố của Paphiopedilum từ Nam và Đông đến Malaysia và Tây Nam Thái Bình Dương là kết quả của nhiều thế kỷ liên tục định cư bởi các tàu buôn. Quá trình di thực cũng tạo nên một số loài đặc hữu địa phương và mở rộng vùng phân bố. Đồng thời chi lan hài Paphiopedilum cũng được phân bố khá phổ biến ở Việt Nam tại các khu rừng, khu bảo tồn thiên nhiên [1]. Những vùng có mật độ Paphiopedilum cao nhất là ở miền nam Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Tây) và miền bắc Việt Nam, nơi có 18 - 20 loài đã được tìm thấy [6]. Mặc dù ít phổ biến hơn các vùng nói trên, họ Cometaceae cũng được tìm thấy ở chân núi Himalaya, miền bắc Myanmar và Thái Lan, trung tâm bán đảo Malaysia và Philippines. Trong mỗi vùng này gặp 4 - 6 loài lan hài. Có tới 72% các loài đã biết là đặc hữu, với sự phân bố rất hạn chế như P. gonenatii, P.helenae, P.henryanum, P.tranlienianum, P.vietnamense và P.hangianum. Nhiều loài trong số này mới được phát hiện ở một hoặc một vài địa điểm, trong đó có loài lan hài Việt Nam, loài này đã được phát hiện trước đó ở Vườn quốc gia Ba Bể. Chưa đến 12% tổng số các loài của chi Paphiopedilumm có khu phân bố tương đối rộng. Đó là P. villosum, P. hirsutissimun, P.appletonianum và P.callosum. - Đặc điểm hình thái của lan Hài Theo mô tả của Averyanov và cs (2008) [1] các loài lan hài có đặc điểm hình thái như sau: 6 + Dạng cây Paphiopedilum là loài thân thảo cỡ trung bình, có nhiều lá mọc thành hai dãy trên thân cụt. Tất cả các loài đều có thân rễ, thường rất ngắn. Tuy nhiên, một số loài, chẳng hạn như P. malipoense và P. micranthum hình thành các thân rễ dài nối nhiều rễ tạo thành một mạng lưới ngầm. Đối với những loài này, một bản sao duy nhất có thể có diện tích vài mét vuông trong điều kiện thuận lợi. Ở các loài khác như P. hirsutissimun và P. dianthum, một số cây có thể có 1 - 20 gốc được nhóm lại thành từng cụm chặt chẽ. + Lá Lá của các loài Paphiopedium thường dài gấp đôi, hình trứng ngược hoặc hình trứng, hình elip và to. Mỗi lá có một nút ở gốc, bên dưới là các bẹ lá hình chữ V xếp chồng lên nhau dày đặc. Ở một số loài như P. hirsutissimum, hay P. dianthum lá dài tới 50cm, mặt khác một số loài khác như P. helenae, cây trưởng thành đôi khi có lá không dài quá 3cm. Phần trên của lá có màu xanh lục cùng màu hoặc có thể bị khảm các đốm màu xanh đậm không đều được đánh dấu bằng các đường gân xanh đậm. Ở một số loài khác, các sọc màu tím xỉn chỉ dễ nhận thấy ở gần gốc lá. Rất ít loài có mặt dưới lá thuần màu xanh lá cây. + Cụm hoa Cụm hoa thường mọc thẳng hoặc cong như: P. helenae, P. dianthum, P. henryanum hoặc P. villosum phụ sinh thường có nhiều hoặc ít thân nằm ngang hoặc hướng xuống, trong khi hầu hết các loài khác, chẳng hạn như P. maloense, P. micranthum và P. appletonianum, ít nhiều có thân mọc thẳng. Một số loài như P. dianthams có cụm hoa gồm nhiều hoa, thường có 2 đến 5 hoa. Phần lớn các loài khác đều chỉ có một hoa riêng lẻ. Trục cụm hoa có lông dày đặc và ngắn ở hầu hết các loài. Lá hoa của cụm hoa gập nhọn đến hình bầu dục tròn [22]. + Hoa Hoa có hai lá đài ở vòng ngoài. Có ba cánh hoa ở lá đài lưng, lá đài hợp nhất và vòng trong. 7 Các lá đài mặt sau thường lớn, hướng lên trên và thường có sọc hoặc đốm ở mặt trong. Nó cũng có thể quấn quanh phần trên của môi dưới dạng túi, tạo thành một nắp bảo vệ môi khỏi nước mưa. Các lá đài mặt lưng đối diện với các lá đài thấp hơn và hợp nhất được tạo thành do sự hợp nhất hoàn toàn của hai lá đài bên. Lá đài sau môi thường xỉn màu, sẫm màu và kém nổi bật hơn lá đài lưng. Cả mặt lưng và đài hoa hợp nhất đều có lông dày ở mặt ngoài. Hai cánh hoa bên nổi rõ ở hai bên của lá đài và thường hơi kéo dài xuống theo chiều ngang. Các cánh hoa hẹp hình ngọn giáo xoáy từ gốc đến ngọn là đặc trưng của loài P. dianthum. Cánh hoa thứ ba ở giữa của bông hoa bị biến dạng rất nhiều, tạo thành một cánh môi giống như túi hoặc hình nốt ruồi, hoạt động như một cái bẫy cho côn trùng thụ phấn. Môi có ba thùy với thùy trung tâm lõm sâu và các thùy bên ngoài hình tròn. Các nhị hoa và nhụy hoa còn lại của phong lan kết thành một cột hình trụ (cột nhụy-nhụy hoa) ở tâm hoa. Nhị - cấu tạo chính của cột nhụy là một nhị hoa hình ô dẹt hướng lên trên, được hình thành từ các nhị vô trùng trung tâm của vòng ngoài. Phía sau và bên dưới nhị hoa là các đầu nhụy hình trứng hoặc tròn nối với cuống lá. Nhị ngắn và bao phấn hình bầu dục rộng kéo dài về phía sau đầu nhụy và ở hai bên cuống. + Quả Quả của lan hài là dạng quả nang khô, có một ô với bao van rộng và bao van hẹp. Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Trong điều kiện tự nhiên thì quả sẽ chín sau khi thu phấn từ 6 - 10 tháng. + Chu kỳ sinh trưởng Hạt giống lan chín rất nhẹ và dễ bị gió phát tán. Dinh dưỡng của hạt được lấy từ quan hệ cộng sinh với các loài nấm rễ. Hạt mở ra các nang trưởng thành trong vòng 6 - 10 tháng sau khi thụ phấn và phân tán, chuyển sang màu nâu và khô đi. Sự nảy mầm xảy ra trong bóng tối trong đất, đá hoặc cây cối ngay sau khi nhân giống và khi thân của phôi bị nhiễm các loại nấm rễ thích hợp. Thân rễ phát triển thân rễ dài cũng bị nhiễm sợi nấm từ nấm rễ. Rễ thật phát triển nhanh chóng 8 từ phía sau ngọn chồi, tiếp theo là các chồi rễ kéo dài ra để hình thành rễ. Sự phát triển mới thường bắt đầu trước khi kết thúc ra hoa. Hầu hết các loài lan Việt Nam nở hoa vào đầu mùa xuân hoặc mùa hè trong điều kiện Việt Nam. + Sự thụ phấn Cho đến nay, giả thuyết được chứng minh tốt nhất là về thụ phấn chéo, nhưng có rất ít dữ liệu về các loài thụ phấn. Một số bằng chứng cho thấy ruồi ăn thịt (Holyphyllidae) thụ phấn cho hoa của P. villosum [29]. Ruồi ăn thịt bị lôi kéo bởi chủ yếu thức ăn giả. Đối với P. villosum, chính mùi khai của hoa đã thu hút côn trùng từ xa. Mùi thơm hay mật của các loài P. concolor, P. delenati, P. malipoense đóng vai trò tương tự. Tuy nhiên, hầu hết các loại hoa đều không có mùi nhưng có màu hoa tươi sáng thu hút côn trùng. Trong một số trường hợp, hoa phong lan không có mật hoa bắt chước hoa của các cây có mật khác. Ví dụ, hoa của P. micranthum rất giống hoa đỗ quyên, là loài hoa chứa nhiều mật hoa nên thu hút nhiều côn trùng... Nước mưa bị mắc kẹt trong môi của P. micranthum là một lý do khác khiến nó về mặt lý thuyết thu hút rất nhiều côn trùng, vì thời tiết thường rất khô trong thời kỳ nở hoa của loài này. Hình 1.1: Hình thái cây và hoa của Paphiopedilum (Nguồn: Averyanov và cs, 2008)[1] Ghi chú: a- Cây mang hoa; b- hoa với một cánh hoa bị cắt bỏ và lát cắt theo chiều dọc của môi; c-e: cột nhị nhụy, nhìn mặt bên (c), nhìn từ mặt trên (d) và từ mặt dưới (e). 9 1.1.4. Bảo tồn và nhân giống lan hài trên thế giới • Công tác tìm kiếm và định danh các loài lan hài trên thế giới Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu đang được tiến hành nhằm tìm ra biện pháp bảo tồn các loài lan có giá trị đang có nguy cơ bị tiệt chủng. Trong hai thập kỷ qua, hoa lan ngày càng nhận được sự quan tâm trên toàn thế giới, không chỉ trong nông nghiệp và chăn nuôi, mà còn trong việc sưu tầm và khám phá các loài phong lan mới. Trên thế giới đã phát hiện và đăng ký nhiều giống lan hài mới như: P. armeniacum [28]; P. emersonii [43]; P. henryanum [46]; P. helenae [45]; P. hiepii Aver [47]; P. tranlienianum [49] và P. hangianum [44]. Ở Trung Quốc một dự án lớn để nghiên cứu về mức độ và số lượng của sự đa dạng di truyền ở một loài lan hài đẹp có tên là P. micranthum. Trong khuôn khổ dự án Ang Li và các cộng sự (2002) ở Viện Thực vật Bắc Kinh (Trung Quốc) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền ở P. micranthum [24]. Trước tình trạng ngày càng bị suy giảm trong tự nhiên thì loài lan này càng ngày càng được nuôi trồng nhiều trên môi trường nhân tạo. Những nghiên cứu thực địa và sinh thái sinh trưởng thân rễ chứng tỏ P. micranthum thường được tái sinh bằng sinh sản hữu tính và vô tính, các tác giả cho rằng loài này có đầy đủ khả năng được nhân giống thành công trong tự nhiên với điều kiện môi trường sống không bị phá hoại tiếp tục và việc thu. • Công tác bảo tồn - nhân giống lan hài trên thế giới Theo Trung tâm Nghiên cứu Hoa Lan Quốc gia của Ấn Độ, biến đổi khí hậu hiện là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự suy giảm số lượng phong lan và sự tuyệt chủng của các loài quý hiếm. Từ đó, tác giả cũng gợi ý một số biện pháp khắc phục như: phục hồi và bảo tồn các hệ sinh thái bản địa; quản lý chặt chẽ môi trường sống đối với các loài có giá trị, quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng; cần theo dõi và nghiên cứu lâu dài các loài có nguy cơ tuyệt chủng và các loài lai tạo. Theo tác giả Arditi and Enst (1993), các hạt lan Hài quá nhỏ nên không có đủ dữ liệu và chỉ chứa các phôi chưa biệt hóa để phát triển bình thường. Lan Hài cực kỳ hiếm trong tự nhiên do tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên rất thấp [25]. Các chương trình nhân giống chi Paphiopedilum đã gặp khó khăn trong việc