BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
NGUYỄN VIỆT HỒNG
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THU
VÀ GIẢI PHÓNG THUỐC CIMETIDINE CỦA MÀNG
BACTERIAL CELLULOSE ĐỂ PHỤC VỤ VIỆC
SỬ DỤNG QUA ĐƢỜNG UỐNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Thành
HÀ NỘI, 2016
LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy
giáo TS. Nguyễn Xuân Thành, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh –
KTNN cùng các thầy cô tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và
Chuyển giao công nghệ, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Một lần nữa em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, cảm ơn gia
đình cùng toàn thể các bạn, những ngƣời thân, đã luôn ở bên động viên, giúp
đỡ và khích lệ em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2016
Học viên
Nguyễn Việt Hồng
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là của chính tôi thực hiện dƣới sự
hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Xuân Thành. Kết quả nghiên cứu không sao chép
và không trùng với bất kỳ luận văn nào. Những trích dẫn, kết quả nghiên cứu
có trong luận văn lấy từ các công bố chính thức và có ghi chú rõ ràng. Nếu sai
tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trƣớc hội đồng bảo vệ.
Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2016
Học viên
Nguyễn Việt Hồng
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................ 3
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 3
5. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 4
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn................................................................... 4
7. Đóng góp mới của đề tài ........................................................................... 4
NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Tổng quan về BC ................................................................................... 5
1.1.1. Đặc điểm của A. xylinum .............................................................. 5
1.1.2. Cấu trúc của BC............................................................................ 5
1.1.3. Đặc tính của màng BC .................................................................. 7
1.1.4. Các phương pháp sản xuất BC từ A. xylinum............................... 9
1.1.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo
màng BC từ vi khuẩn A. xylinum ......................................................... 10
1.1.6. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng................................ 12
1.1.7. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng
BC từ vi khuẩn A. xylinum .................................................................... 13
1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC trong lĩnh vực
hấp thu và giải phóng thuốc qua đường uống ...................................... 15
1.2. Tổng quan về thuốc CM....................................................................... 17
1.2.1. Sơ lược về thuốc CM ................................................................... 17
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CM ..................... 21
1.3. Quá trình tiêu hóa ở dạ dày .................................................................. 22
1.3.1. Cấu tạo của dạ dày ..................................................................... 22
1.3.2. Chức năng tiêu hóa của dạ dày .................................................. 23
1.3.3. Chuyển hóa thức ăn từ dạ dày xuống ruột.................................. 29
1.3.4. Kết quả tiêu hóa ở dạ dày ........................................................... 29
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 30
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 30
2.1.1. Giống vi khuẩn ............................................................................ 30
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất ................................................................ 30
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................... 30
2.1.4. Môi trường lên men thu màng BC .............................................. 31
2.1.5. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng
thông qua hệ thống được thiết kế [6] .................................................... 32
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 32
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng BC từ một số môi trường ........ 32
2.2.2. Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp thu thuốc ............... 33
2.2.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng BC .................... 34
2.2.4. Đo bề dày màng BC .................................................................... 34
2.2.5. Xây dựng đường chuẩn của CM trong HCl 0.1N ....................... 35
2.2.6. Xác định các thông số tối ưu của quá trình hấp thu thuốc
CM vào màng BC .................................................................................. 36
2.2.7. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thu vào màng
BC ......................................................................................................... 38
2.2.8. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ
thống được thiết kế ................................................................................ 38
2.2.9. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng BC .............. 39
2.2.10. Phương pháp xử lý thống kê ..................................................... 40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 41
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng BC từ các môi trƣờng khác nhau .... 41
3.1.1. Thu màng BC từ các môi trường lên men ................................... 41
3.1.2. Quá trính xử lý màng BC trước khi hấp thu thuốc ..................... 42
3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng BC thích
hợp......................................................................................................... 42
3.1.4. Đo bề dày màng BC ................................................................... 43
3.1.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng BC........................................... 46
3.2. Khảo sát khả năng hấp thu thuốc của màng BC .................................. 46
3.2.1. Kết quả khảo sát thông số tối ưu của quá trình hấp thu
thuốc vào màng BC bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
toàn phần............................................................................................... 47
3.2.2. Kết quả về khả năng hấp thu thuốc CM trên các màng BC
khác nhau .............................................................................................. 50
3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của các màng BC ............................................ 53
3.3.1. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng CNM ...................................... 53
3.3.2. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng Dừa ........................................ 56
3.3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc của màng Gạo ........................................ 59
3.3.4. So sánh tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng BC ở các độ dày
khác nhau trong cùng 24h tại pH = 5 ................................................... 62
3.3.5. So sánh ảnh hưởng của độ pH đến khả năng giải phóng
thuốc ở ba loại màng BC ...................................................................... 63
3.4. Đánh giá động dƣợc học giải phóng của thuốc CM từ màng BC ........ 64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 70
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 76
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A. xylinum
Acetobacter xylinum
BC
Bacterial cellulose
CNM
Cao nấm men
CM
Cimetidine
cs
cộng sự
ĐHSP
Đại học Sƣ phạm
MT1
Môi trƣờng 1
MT2
Môi trƣờng 2
MT3
Môi trƣờng 3
FDA
Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ
OD
Mật độ quang phổ
Nxb
Nhà xuất bản
rpm
Tốc độ quay 100 vòng/phút
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đƣờng kính các loại sợi .................................................................... 6
Bảng 1.2. Thành phần của nƣớc dừa già. .......................................................... 9
Bảng 1.3. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng
BC ................................................................................................. 11
Bảng 1.4. Thành phần dinh dƣỡng của nƣớc vo gạo ...................................... 13
Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men tạo màng BC .................................................. 31
Bảng 2.2. Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng ......................................... 34
Bảng 2.3. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch CM ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) ............................................................ 35
Bảng 2.4. Các mức biến thiên và các yếu tố ảnh hƣởng trong quá trình
hấp thu thuốc CM vào các màng BC khác nhau........................... 37
Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tƣơi ở các độ dày khác nhau ....................... 43
Bảng 3.2. Giá trị đo độ dày của màng gạo ...................................................... 44
Bảng 3.3. Giá trị đo độ dày của màng Dừa ..................................................... 44
Bảng 3.4. Giá trị đo độ dày của màng CNM .................................................. 45
Bảng 3.5. Các yếu tố quy hoạch thực nghiệm ................................................ 47
Bảng 3.6. Mô hình quy hoạch thực nghiệm trong quá trình hấp thu thuốc
CM vào màng ................................................................................ 48
Bảng 3.7. Các yếu tố trong thí nghiệm đƣờng dốc nhất ................................. 49
Bảng 3.8. Hàm lƣợng thuốc CM hấp thu vào màng BC ở thí nghiệm
đƣờng dốc nhất.............................................................................. 50
Bảng 3.9. Lƣợng thuốc hấp thu vào các màng BC với độ dày khác nhau
tại thời điểm 2h ............................................................................. 51
Bảng 3.10. Hiệu suất thuốc hấp thu vào các màng BC khác nhau với độ
dày màng khác nhau trong 2h ....................................................... 52
Bảng 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM với độ dày 0.5cm............. 54
Bảng 3.12. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM với độ dày 1cm................ 55
Bảng 3.13. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Dừa với độ dày 0.5cm ............... 57
Bảng 3.14. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Dừa với độ dày 1cm .................. 58
Bảng 3.15. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Gạo với độ dày 0.5cm ............... 60
Bảng 3.16. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Gạo với độ dày 1cm .................. 61
Bảng 3.17. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các màng BC ở các độ dày khác
nhau trong cùng 24h tại pH = 5 .................................................... 62
Bảng 3.18. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng Dừa
theo các mô hình giải phóng thuốc tại các pH khác nhau ............ 65
Bảng 3.19. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng CNM
theo các mô hình giải phóng thuốc tại các pH khác nhau ............ 66
Bảng 3.20. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng Gạo
theo các mô hình giải phóng thuốc tại các pH khác nhau ............ 67
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của BC. ...................................................... 6
Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật ...................... 7
Hình 1.3. Cấu tạo của dạ dày .......................................................................... 22
Hình 1.4. Cử động co bóp của dạ dày ............................................................. 24
Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo tuyến vị của dạ dày ................................................... 25
Hình 1.6. Sơ đồ giai đoạn đầu của sự bài tiết dịch vị ..................................... 27
Hình 1.7. Sơ đồ giai đoạn dạ dày của sự bài tiết dịch vị................................. 27
Hình 1.8. Sơ đồ giai đoạn ruột của sự bài tiết dịch vị ..................................... 28
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận BC ............................................ 33
Hình 2.2. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của CM ................................................ 36
Hình 3.1. Hình ảnh màng BC lên men từ môi trƣờng nƣớc Dừa già.............. 41
Hình 3.2. Hình ảnh màng BC lên men từ môi trƣờng nƣớc vo Gạo............... 41
Hình 3.3. Hình ảnh màng BC lên men từ môi trƣờng CNM .......................... 41
Hình 3.4. Các quy trình xử lý màng BC ......................................................... 42
Hình 3.5. Màng Dừa có độ dày khác nhau...................................................... 45
Hình 3.6. Kết quả thử sự hiện diện của đƣờng glucose .................................. 46
Hình 3.7. Chuẩn bị hấp thu thuốc CM ở độ dày màng khác nhau .................. 47
Hình 3.8. Biểu đồ lƣợng thuốc hấp thu vào các màng BC khác nhau ............ 51
Hình 3.9. Hiệu suất thuốc hấp thu vào các màng BC khác nhau .................... 53
Hình 3.10. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM với độ dày 0.5cm ............. 54
Hình 3.11. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng CNM với độ dày 1cm ................ 56
Hình 3.12. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Dừa với độ dày 0.5cm ............... 57
Hình 3.13. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Dừa với độ dày 1cm .................. 59
Hình 3.14. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Gạo với độ dày 0.5cm ............... 60
Hình 3.15. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ màng Gạo với độ dày 1cm .................. 62
Hình 3.16. Tỷ lệ giải phóng thuốc từ các màng BC khác nhau ...................... 63
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thuốc Cimetidine (CM) là chất đối kháng trên receptor histamin H2,
đây là một trong những thuốc đầu tiên đƣợc khám phá bằng cách tiếp cận
phƣơng pháp nghiên cứu thuốc hợp lí. Tác dụng chủ yếu của thuốc là ức chế
tế bào thành dạ dày tiết acid [12].
CM sau khi trải qua hàng loạt các nghiên cứu thử nghiệm đã đƣợc báo
cáo là một chất ức chế sự phát triển của các khối u tuyến nội tiết, ung thƣ đại
trực tràng, điều trị các tổn thƣơng dạ dày cấp tính [24],… đã đƣợc thành công
trên thị trƣờng với tên Tagamet, nhƣng sinh khả dụng của thuốc thấp khoảng
35% đã làm ngăn cản các ứng dụng điều trị trong khoảng thời gian dài [12].
Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc, ngƣời bệnh có thể gặp những tác
dụng phụ không mong muốn nhƣ: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ gà, lú
lẫn, trầm cảm, rối loạn chức năng gan, viêm tụy có thể xảy ra,... các phản ứng
này cũng sẽ khỏi khi ngừng thuốc.
Bacterial cellulose (viết tắt là BC) hay còn gọi là màng sinh học là sản
phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum (A.
xylinum) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các
phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucan), cellulose vi
khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử
nhƣ lignin, hemicellulose, pectin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính
vƣợt trội với độ dẻo dai, bền chắc [9], [22]. Trên thế giới, màng BC đã đƣợc
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng BC làm
môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt
cho các pin và năng lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học,
thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng
thuốc cùng nhiều ứng dụng khác [22]. Trong lĩnh vực y học, màng BC đã
2
đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét
da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da
cho con ngƣời [8], [22]. Amin et al. [14] đã báo cáo việc sử dụng màng BC
làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả
cho thấy màng BC có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại, làm
tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng
màng BC mới đƣợc quan tâm gần đây và đã đạt đƣợc kết quả bƣớc đầu. Đề
tài của Nguyễn Văn Thanh – Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh 2006 [4] đã
“Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ A. xylinum”. Theo kết quả
nghiên cứu cho thấy màng BC đƣợc tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ
kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất, BC có độ
tinh sạch lớn hơn nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh
học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra BC còn có độ bền tinh thể cao,
sức căng lớn, trọng lƣợng thấp, khả năng thấm hút lớn, đƣờng kính sợi nhỏ,...
Đồng thời BC là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân
hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích
thƣớc và hƣớng, màng BC còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo
dài [17], [19],… Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ
thống hấp thu và giải phóng thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có
thể giúp thuốc không bị phá hủy trong môi trƣờng acid [19].
Uống là một trong những đƣờng ƣa thích nhất và truyền thống để hấp
thu giải phóng thuốc. So với đƣờng tiêm, lợi thế chính của nó là an toàn, đơn
giản, tiện lợi và dễ có sự tuân thủ của bệnh nhân, nên làm tăng hiệu quả điều
trị của thuốc. Nó cũng ngăn chặn nguy cơ lây truyền bệnh, làm giảm chi phí
và cho phép linh hoạt hơn hoặc kiểm soát liều lƣợng thuốc [37].
Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà BC có thể giúp thuốc duy trì hiệu
quả chữa bệnh, tăng khả năng phân phối thuốc có kiểm soát, tăng thời gian
3
tồn tại của thuốc trong đƣờng ruột. Cách tiếp cận này có thể đƣợc sử dụng để
tăng cƣờng khả dụng sinh học đƣờng uống của thuốc. Với mục đích thiết kế
hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc dựa trên màng BC nhằm tăng lƣợng
thuốc hấp thu vào cơ thể trong điều trị bệnh viêm loét dạ dày, chúng tôi chọn
đề tài:“Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc Cimetidine của
màng bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua đường uống”.
2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế chế tạo hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc CM dựa trên
màng BC nhằm kéo dài thời gian giải phóng thuốc từ BC để tăng thời gian
hấp thu thuốc và khắc phục một số tác dụng không mong muốn của thuốc.
Cách tiếp cận này có thể đƣợc sử dụng tăng cƣờng khả dụng sinh học đƣờng
uống của thuốc, giúp tăng lƣợng thuốc hấp thu vào cơ thể, phát huy đƣợc hiệu
quả trong chữa trị bệnh viêm loét dạ dày ở ngƣời.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tạo đƣợc màng BC và kiểm tra một số đặc tính lí hóa của màng.
Thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc dựa trên màng BC.
Khảo sát, đánh giá khả năng hấp thu và giải phóng thuốc thông qua
hệ thống đƣợc thiết kế.
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu:
- Màng BC thu đƣợc từ các môi trƣờng nƣớc dừa già, môi trƣờng cao
nấm men, môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Thuốc CM dạng tinh khiết 99,6%.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng
thuốc CM của màng BC qua đƣờng miệng in vitro.
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và
Chuyển giao công nghệ, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
4
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Lên men thu màng BC từ một số môi trƣờng.
- Xử lí màng BC trƣớc khi hấp thu thuốc.
- Đánh giá độ tinh khiết của của màng BC.
- Đo bề dày màng BC.
- Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn của CM
- Xác định các thông số tối ƣu của quá trình hấp thu thuốc CM vào
màng BC.
- Xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thu vào màng BC.
- Xác định lƣợng thuốc giải phóng thông qua hệ thống đƣợc thiết kế.
- Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng BC.
- Xử lý thống kê.
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học: Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tiềm năng của
màng BC để áp dụng các loại màng này vào nhiều các lĩnh vực khác nhau
trong thực tiễn đời sống. Từ kết quả nghiên cứu trên, mở ra những hƣớng
nghiên cứu mới về khả năng kéo dài thời gian giải phóng, điều này có thể
giúp tăng khả dụng sinh học, tăng hiệu quả điều trị của các loại thuốc đó.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Việc sử dụng màng BC làm tác nhân trong quá trình hấp thu và giải
phóng thuốc CM có thể làm tăng khả dụng sinh học của thuốc từ đó làm tăng
hiệu quả điều trị của thuốc đối với bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng.
7. Đóng góp mới của đề tài
- Đây
là đề tài đầu tiên sử dụng màng BC làm hệ thống hấp thu, giải
phóng thuốc CM.
- Kết
quả nghiên cứu của đề tài có thể định hƣớng tạo hệ hấp thu thuốc
để tăng khả dụng sinh học của thuốc, từ đó có thể áp dụng trong điều trị bệnh
viêm loét dạ dày, tá tràng tại Việt Nam.
5
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Bacterial Cellulose (BC)
1.1.1. Đặc điểm của A. xylinum
Vi khuẩn A. xylinum là trực khuẩn hình que, kích thƣớc khoảng 2μm,
đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không có khả năng di động. Các tế bào
đƣợc bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose. Chúng tích lũy khoảng
4,5% acid acetic trong môi trƣờng, khi nồng độ acid vƣợt quá giới hạn cho
phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.
A. xylinum thƣờng sống chung với nấm chè trong một loại nƣớc giải
khát dân gian làm từ chè loãng gọi là “Thủy hoài sâm”, ngƣời Trung Quốc gọi
là “Hải bảo” hay “Vị bảo”, ngƣời Nga gọi là “Nấm chè”, ngƣời Pháp gọi là
“Champignon De Longue Vie – nấm trƣờng sinh”, ngƣời Nhật gọi chúng là
“Kombucha” [7].
Vi khuẩn A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc,
không sinh bào tử. Thƣờng sống trong giấm, rƣợu nhạt, nƣớc ép hoa quả và
có cả trong đất. Theo Bergey [20], nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn A. xylinum
là 25 – 300C , pH tối ƣu là 5,4 – 6,2.
1.1.2. Cấu trúc của BC
Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1, 4 - glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản
của BC giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC), tuy nhiên chúng
khác nhau về cấu trúc đại thể [22].
6
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của BC.
Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đƣờng kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp
thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm.
So sánh đƣờng kính của BC với sợi tự nhiên và sợi nhân tạo đƣợc trình
bày trong bảng 1.1 [48].
Bảng 1.1. Đƣờng kính các loại sợi
Loại sợi
Đƣờng kính
Sợi tóc
100μm
Sợi gỗ thông
30 – 75nm
Bông
10μm
Sợi tổng hợp
10μm
Sợi tổng hợp cao cấp
1 - 10μm
Sợi collagen
1μm
Vi sợi Bacterial Cellulose
0,01 – 0,1μm
Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy
(Watanabe et al.,1998a; Yamanaka et al., 2000).
7
Hình 1.2. Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [7]
Khi nuôi cấy theo phƣơng pháp tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng
cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và
không khí giàu oxi. Các miếng BC này đƣợc gọi là BC trên môi trƣờng tĩnh
(S – BC: Static – Bacterial Cellulose) trong đó chuỗi β-1,4–glucan xếp song
song quanh trục, A. xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày
trên bề mặt môi trƣờng. Màng BC thu đƣợc dẻo, dai, dày, có màu trắng trong
hơi ngà màu vàng.
Khi nuôi cấy theo phƣơng pháp động (A – BC: Agitated – Bacterial
Cellulose), một lƣợng nhỏ cellulose đƣợc hình thành dƣới dạng huyền phù
phân tán trong đó chuỗi β-1,4- glucan xếp một cách ngẫu nhiên. BC đƣợc tạo
ra bằng phƣơng pháp nuôi cấy động dƣới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm,
cong và không trật tự do sự dao động của môi trƣờng nuôi cấy.
Lƣợng BC đƣợc tạo ra giữa hai phƣơng pháp nuôi cấy động và tĩnh
cũng khác nhau: khối lƣợng màng khô của phƣơng pháp nuôi cấy động nhỏ
hơn so với nuôi cấy tĩnh [4], [22].
1.1.3. Đặc tính của màng BC
Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trƣờng dinh dƣỡng
lỏng thành lớp màng mỏng nhƣ da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tƣơng tự nhƣ giấy da với độ dày 0,01 – 0,5nm. Màng BC sản xuất bởi
8
các chủng A. xylinum có độ tinh sạch cao so với màng PC nhƣ hemicellulose,
pectin và lignin (Kurosumi et al. 2009) [34]. Nó thể hiện tính độc nhất và cấu
trúc đặc tính sinh hóa nhƣ sợi nano siêu mịn với cấu trúc mạng (1,5 – 2nm
chiều rộng) (Patel & Suresh 2008) [38], trơ, có thể bị phân hủy sinh học,
không độc, không gây dị ứng và ổn định về hóa học (Amin et al., 2012;
Grzegorczyn & Slezak 2007; Neelobon S et al., (2007) [17], [28], [36]. BC
thể hiện độ hấp thụ nƣớc tốt do cấu trúc mặt lƣới của nó cung cấp một diện
tích bề mặt lớn đảm bảo cho nó hấp thụ nƣớc một cách tốt nhất (khoảng 200
lần trọng lƣợng của nó) (Patel & Suresh, 2008; Wippermann et al., 2009)
[38], [51]. Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy BC có độ kết tinh và độ bền cơ học
cao, khả năng đàn hồi tốt và độ bền ƣớt cao do cấu trúc mạng lƣới xơ thống
nhất và siêu mịn của nó. Đặc biệt, nó có khả năng cản khuẩn mà không làm
thay đổi cấu trúc hay tính chất (Czaja et al., 2007; Hu et al., 2009; Wan et al.,
2009) [23], [30], [50]. Với các đặc tính trên, BC rất phù hợp để chọn lựa cho
ứng dụng hấp thu và giải phóng thuốc. Nguyên liệu để nuôi A. xylinum nhằm
thu màng BC là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn dinh dƣỡng cần thiết nhƣ
nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trƣởng và các
yếu tố vi lƣợng. Nhu cầu sử dụng đƣờng của A. xylinum là rất lớn và giữ vai
trò quan trọng trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề
nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhƣ: rỉ
đƣờng, nƣớc dừa già, nƣớc mía,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.
xylinum. Trong đó, nƣớc dừa già đƣợc xem là môi trƣờng kinh điển trong
nuôi cấy A. xylinum. Thành phần môi trƣờng của nƣớc dừa già [4] đƣợc trình
bày ở bảng 1.2 dƣới đây:
9
Bảng 1.2. Thành phần của nƣớc dừa già.
Nƣớc (%)
94,99
Đồng (mg/100g)
0,04
Protein (%)
0,72
Mangan (mg/100g)
0,142
Chất béo toàn phần (%)
0,2
Selen (µg/100g)
1
Cacbohydrat (%)
3,17
Vitamin C (mg/100g)
2,4
Đƣờng (%)
2,16
Vitamin B1 (mg/100g)
0,03
Canxi (mg/100g)
24
Vitamin B2 (mg/100g)
0,057
Sắt (mg/100g)
0,29
Vitamin B3 (mg/100g)
0,08
Magiê (mg/100g)
25
Vitamin B5 (mg/100g)
0,043
Photpho (mg/100g)
20
Vitamin B6 (mg/100g)
0,032
Kali (mg/100g)
250
Vitamin B9 (µg/100g)
3
Natri (mg/100g)
105
Kẽm (mg/100g)
0,1
Nƣớc dừa già là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nƣớc dừa chứa nhiều chất dinh dƣỡng và chất kích thích tố tăng trƣởng nhƣ
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Vì vậy, A.
xylinum thích hợp phát triển trong môi trƣờng này [4].
Nƣớc dừa sau khi thu hoạch đƣợc sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đƣờng và các chất dinh dƣỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [4], [9].
1.1.4. Các phương pháp sản xuất BC từ A. xylinum
1.1.4.1. Lên men tĩnh
Môi trƣờng dinh dƣỡng để lên men A. xylinum đƣợc cho vào các khay
lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay đƣợc đậy
bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trƣờng lên men và
môi trƣờng bên ngoài nhƣng vẫn tránh đƣợc khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ
10
thích hợp cho quá trình lên men là 28 – 300C. Sợi cellulose mới đƣợc tổng
hợp sẽ di chuyển lên bền mặt của môi trƣờng nuôi cấy tạo thành lớp màng
cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trƣờng lỏng và không khí. Cellulose
tiếp tục đƣợc tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7 - 10 ngày có
thể thu BC [36].
1.1.4.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thƣờng đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nuôi cấy
lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa vào môi trƣờng nuôi cấy
đã chuẩn bị sẵn trong các bình tam giác erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc
ổn nhiệt ở 28 – 300C, 180 – 200 vòng/phút [49]. BC đƣợc tạo ra từ môi
trƣờng lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt
trong môi trƣờng. Lƣợng O2 hòa tan trong môi trƣờng ảnh hƣởng lớn đến sự
sinh trƣởng và khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá
trình lên men đạt hiệu quả cao, các receptor có sục khí thƣờng xuyên đƣợc sử
dụng lên men [29].
1.1.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn A. xylinum
1.1.5.1. Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Sự hình thành màng BC, vi khuẩn chịu ảnh hƣởng trực tiếp của thành
phần môi trƣờng dinh dƣỡng đặc biệt là nguồn cacbon có ảnh hƣởng mạnh mẽ
tới sinh trƣởng cũng nhƣ tổng hợp cellulose của A. xylinum. Cacbon có trong
tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme, axit nucleic và các
sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những hợp chất chứa hữu cơ có chứa
cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật [9].
Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC đƣợc
thể hiện ở bảng 1.3 [9], [34].
- Xem thêm -