Tài liệu Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------ Nguyễn Thị Tươi NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG QUA THỤ THỂ TLR4 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------ Nguyễn Thị Tươi NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHỌ NỒI VÀ NGẢI CỨU THÔNG QUA THỤ THỂ TLR4 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Trịnh Tất Cường Hà Nội - 2012 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3 1. Khái niệm viêm 3 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 3 2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc 3 2.1.1. Các chất kháng viêm 3 2.1.1.1. Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) 3 2.1.1.2.Các chấ t kháng viêm có bản chấ t steroid 4 2.1.1.3. Các chất khác 4 2.1.2. Thụ thể glucocorticoid (GR) và cơ chế kháng viêm 5 2.1.3.Thụ thể họ toll-like và cơ chế kháng viêm 7 2.1.4.Tế bào marcrophage 12 2.1.5. Các mô hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro 13 2.1.5.1. Mô hình sàng lọc sử dụng gen ch ỉ thị luciferase có gắ n 13 NF-κB (NF-κB dependent luciferase reporter assay) 2.1.5.2. Mô hình sàng lọc sử dụng thụ thể GR 15 2.1.5.3. Mô hình sàng lọc sử dụng thụ thể toll like (TLRs) 17 2.1.5.4.Mô hình nghiên cứu viêm thực nghiê ̣m in vivo sử dụng 19 LPS 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 3. Cây nhọ nồi và cây ngải cứu 3.1. Cây nhọ nồi 20 22 22 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi 3.2. Cây ngải cứu 4. Vai trò Wedelolactone của cây nhọ nồi và một số hợp chất của ngải cứu 23 24 trong quá trình chống viêm 4.1. Wedelolactone 24 4.2. Một số hợp chất của cây ngải cứu 25 Chƣơng 2- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 27 27 2.1.1.Động vật thí nghiệm 27 2.1.2. Hóa chất 27 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xƣơng của chuột. 27 2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng 27 sống của BMDM bằng kít CCK-8 2.2.3. Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit 28 2.2.3.1. Giới thiệu về phương pháp 28 2.2.3.2. Nguyên tắc 28 2.2.3.3. Quy trình thí nghiệm 29 2.2. 4. Phƣơng pháp Western blot 31 2.2.4.1. Giới thiệu về phương pháp 31 2.2.4.2. Nguyên tắc 31 2.2.5. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản 36 ứng oxy hóa 2.2.6.Phân tích thống kế 37 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3. 1. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hƣởng bởi Wedelolactone 38 3.2. LPS kích thích tế bào BMDM sinh cytokine 39 3.3. Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine thông qua thụ thể 40 TLR4 kích thích bằng LPS 3.4. LPS kích thích hoạt động của yếu tố tự phân bào (MAPK) thông 41 qua thụ thể TLR4 3.5. Wedelolactone ức chế quá trình phospho của yếu tố tự phân bào 42 bằng LPS kích thích thông qua thụ TLR4 3.6.Wedelolactone đã ức chế quá trình sinh ROS thông qua thụ thể 43 TLR4 kích thích bằng LPS 3.7. LPS kích thích hoạt động p47 phox trong quá trình tạo ra ROS 44 3.8. Wedelolactone ức chế quá trình sinh ROS thông qua thụ thể TLR4 45 bằng LPS 3.9. Dầu ngải cứu không gây độc đối với BMDM 46 3.10. Dầu ngải cứu không có khả năng ức chế quá trình sản xuất 47 cytokine thông qua thụ thể TLR4 bằng LPS KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Giải thích các chữ viết tắt TT Từ viết tắt Nghĩa từ viết tắt 1. BMDM Bone Marrow-Derived Macrophage 2. ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 3. IL Interleukin 4. LPS Lipopolysaccharides 5. NF-КB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells 6. ROS Reactive oxygen species 7. TLR Toll-like receptor 8. TNF/ TNFα Tumor necrosis factor/ Tumor necrosis factor alpha 9. OD Optical Density Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Danh mục các hình trong luận văn Thứ tự hình TT Trang Hình 1. Cơ chế hoa ̣t đô ̣ng của thu ̣ thể Glucocorticoid trong tế bào 7 Hình 2. Mô hình cơ chế kháng viêm của Glucocorticoid 7 Hình 3. Cơ chế hoạt động của một số TLR 10 Hình 4. Biể u hiê ̣n của các TLR ở các tế bào ba ̣ch cầ u 12 Hình 5. Mô hình sàng lọc sử dụng gen thông báo luciferase có gắn NF - 15 κB Hình 6. Mô hiǹ h sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng thu ̣ thể glucocorticoid (GR) 16 Hình 7. Mô hình sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng thu ̣ thể toll like (TLRs) 18 Hình 8. Mô hiǹ h nghiên cƣ́u viêm thƣ̣c nghiê ̣m in vivo sƣ̉ du ̣ng LPS 20 Hình 9. Cây nhọ nồi 23 Hình 10. Cây ngải cứu 24 Hình 11. Cấu trúc hóa học của Wedelolactone 25 Hình 12. Biểu đồ Wedelolactone không gây độc đối với tế bào BMDM 38 Hình 13. Biểu đồ LPS kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm 39 Hình 14. Biểu đồ Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm 40 trong BMDM đƣợc kích thích bằng zymosan Hình 15. LPS đã kích thích quá trình phospho của ERK1/2 và p38 trong 41 BMDM Hình 16. Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho của ERK1/2 và p38 42 trong BMDM Hình 17. Wedelolactone hoặc Dex ức chế quá trình sản sinh ROS đƣợc kích thích bởi LPS thông qua TLR4 43 Luận văn tốt nghiệp Hình 18. Nguyễn Thị Tươi LPS kích thích quá trình phospho hóa của p47phox trong 44 BMDM. Hình 19. Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho hóa của p47phox 45 Hình 20. Dầu ngải cứu không gây độc đối với tế bào BMDM 46 Hình 21. Tinh dầu ngải cứu không có khả năng ức chế quá trình sinh 47 cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc kích thích bằng LPS Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi MỞ ĐẦU Viêm là đáp ứng tự nhiên của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ môi trường bên ngoài như: tia tử ngoại, các chất phóng xạ, các chất hóa học và đặc biệt là các tác nhân gây bệnh. Kết quả của viêm là loại bỏ hoặc triệt tiêu hoàn toàn các điều kiện sinh ra nó. Như vậy, viêm là đáp ứng có lợi cho cơ thể. Tuy nhiên, nếu thời gian tồn tại quá lâu thì viêm sẽ chuyển từ giai đoạn cấp tính sang mãn tính và gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho cơ thể. Những tác động do viêm mãn tính mang lại phải kể đến như: gây rối loạn quá trình chuyển hóa, trao đổi chất, ảnh hưởng đến hoạt động của các cơ quan, thậm chí nếu để nặng hơn có thể dẫn đến suy giảm chức năng của thận, gan… Do vậy, điều trị và làm giảm bớt tác động bất lợi của viêm đối với cơ thể là vấn đề hết sức quan trọng hiện nay, đặc biệt là trong quá trình điều trị bệnh. Các thuốc kháng viêm trên thị trường mà phổ biến là Dexamethasone, các chất có nguồn gốc là cortiocoid, chủ yếu là các thuốc tổng hợp hóa học. Các loại thuốc này tuy có tác động nhanh song cũng tiềm tàng các khả năng gây độc cho cơ thể và có thể gây nên những tác dụng phụ không mong muốn. Sử dụng thuốc kháng viêm có nguồn gốc thực vật có thể giải quyết những lo ngại trên với ưu điểm là an toàn, hiệu quả lâu dài và giá thành thấp. Cho đến nay, việc tìm kiếm các chất chống viêm mới có nguồn gốc từ thực vật đang được quan tâm bởi những hiệu quả của nó. Gần đây, tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã xây dựng mô hình để sàng lọc và đánh giá khả năng chất chống viêm trên cả mô hình in vitro và in vivo. Với mô hình này, Wedelolactone từ cây nhọ nồi đã được tách chiết và bước đầu khẳng định được khả năng chống viêm. Với hoạt tính phòng chống viêm đầy tiềm năng của Wedelolactone, cũng như trên mô hình sàng lọc chất chống viêm mới này, chúng tôi muốn nghiên cứu sâu hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm ở mức in vitro. Ngoài ra, chúng tôi cũng 1 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi tiếp túc đánh giá khả năng chống viêm của cây ngải cứu qua mô hình này. Từ những kết quả có được này sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích cuối cùng là làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm có nguồn gốc từ thực vật góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4”. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu đề tài Mục tiêu 1. Xác định được chức năng điều hòa quá trình đáp ứng viêm của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong tế bào macrophage thông qua thụ thể TLR4. 2. Đánh giá được khả năng chống viêm của cây ngải cứu trong tế bào macrophage thông qua thụ thể TLR4. Nội dung nghiên cứu 1. Đánh giá khả năng điều hòa của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình sản xuất cytokine tiền viêm trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu của TLR4, ở đây chúng tôi sử dụng LPS. 2. Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình ức chế yếu tố tự phân bào MAPK ( mitogen-activated protein kinase). 3. Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu TLR4, ở đây chúng tôi sử dụng LPS. 2 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái niệm viêm Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổ n thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay là những tế bào bị hỏng. Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi. Khi phản ứng viêm xảy ra , nhiề u loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm như các loại tế bào di chuyển (migrating cells) gồ m: bạch cầu đơn nhân , đa nhân, các tế bào lympho , tiể u cầ u , tế bào nội mạc… Các t ế bào này giải phóng ra hàng loa ̣t các chấ t trung gi an, phầ n lớn là các chất p rostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) và interleukin-1. Các chất này lại tiếp tục hoạt hóa các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein như các proteinase , các interleukin , TNF-α, các superoxide , H+, hydroperoxide gây ra tổ n thương mô , qua đó khép kin ́ quá trin ̀ h viêm ma ̣n tin ́ h . Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng. Một vài chất tiế t ra làm hẹp dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng. Khi quá trình viêm kéo dài s ẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do quá trình viêm chi ếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [37]. 3 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc 2.1.1. Các chất kháng viêm Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính gồm: 2.1.1.1. Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) Đa ̣i diê ̣n cho nhóm này là aspirin , ibuprofen và naproxen . Cơ chế kháng viêm của NSAID đư ợc phát hiện là do chúng ức chế sự tổng hợp prostaglandins (PG). Đić h tác du ̣ng đươ ̣c biế t rõ nhấ t của các chấ t này là cyclooxygenase enzym có vai trò chuyể n hóa axit ar achidonic thành prostaglandins (COX), là (PG) và thromboxane (TX). Mô ̣t số chấ t kháng viêm không có bản chấ t steroid (NSAID) lại có khả năng ức chế enzym liên quan đến sự bào mòn màng nhày dạ dày cứu lâm sàng đã chứng minh các chấ t . Nghiên kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) này có tác du ̣ng ức chế sự hin ̀ h thành prostaglandins (PG) ở màng nhày dạ dày. Tuy nhiên , salysilate, mô ̣t chấ t kháng viêm thuô ̣c nhóm này cũng có tác du ̣ng ức chế sự sinh tổng hợp của prostaglandins (PG) nhưng la ̣i không làm bào m òn màng nhày dạ dày như aspirin . Lý do tại sao lại có sự khác nhau về cơ chế tác dụng giữa aspirin và salisylate là vấ n đề chưa giải thích đươ ̣c [42]. 2.1.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vòng 4 cycloalkane. Thuô ̣c về nhóm chấ t này có các chấ t corticoid . Chúng tác dụng thông qua ức chế enzyme phospholipases A2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phospholipase A 2 thành axit arachidonic . Như vâ ̣y, cuố i cùng thì corticoid cũng ức chế sự sinh tổ ng hơ ̣p của prostaglandins (PG), thromboxane và leukotrienes. Các chất kháng viêm có bản chất stero id ức chế phospholipase A 2 mô ̣t cách gián tiế p thông qua viê ̣c giải phóng các chấ t ức chế protein có tên go ̣i là macrocortin , lipomodulin hay renocortin có khối lượng phân tử đạt khoảng 15, 30 và 40 kDa. Đa ̣i diê ̣n nhóm chấ t này là lipocortin đã đươ ̣c tinh sa ̣ch , thương ma ̣i và đươ ̣c xem là mô ̣t trong những chấ kháng viêm mạnh [42]. Các chất có bản chất steroid thường là phối tử của thụ thể glucocorticoid. 4 t Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi 2.1.1.3. Các chất khác Thuô ̣c về nhóm này có vàng và colchicine . Trong trường hơ ̣p của colchichine , chấ t này ức chế sự hì nh thành tinh thể urate trong khớp của bê ̣nh nhân gout thông qua viê ̣c làm giảm sự tiế t các chấ t chemotaxis của ba ̣ch cầ u đa nhân và giải phóng enzyme lysosom . Colchicine có tác du ̣ng ức chế đă ̣c hiê ̣u sự giải phóng mô ̣t glycoprotein có trọng lượng phân tử 8400 Da. Đây là mô ̣t chấ t chemotaxis của ba ̣ch cầ u đa nhân đố i với các ba ̣ch cầ u trung tin ́ h và monocytes có khả năng thực bào các thể urate [42]. 2.1.2. Thụ thể glucocorticoid (GR) và cơ chế kháng viêm Các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors – PRRs), bao gồm các thụ thể toll-like, lectin và dectin-1 chi phối khả năng sống sót của vật chủ bằng viê ̣c nhận dạng những phân tử mầm bệnh (pathogen-associated molecular patterns PAMPs) ở vi khuẩn, virus và nấm. Sau khi nhận dạng mầm bệnh, các thụ thể sẽ truyền tín hiệu vào tế bào và kích thích tế bào ti ết ra các chấ t trung gian (mediator) như cytokine, chemokine tiền viêm và kháng viêm, thậm chí ta ̣o mi ễn dịch đáp ứng ban đầu [24, 12]. Bên cạnh các thụ thể PRRs như đã trình bày ở trên , Schäcke và cộng sự (2009) đã phát hiê ̣n ra loa ̣i th ụ thể khác là glucocorticoid có khả năng kìm hãm các yếu tố sinh ra quá trình viêm bằng cách liên kết vào Acid Deoxyribo Nucleic (AND) trong nhân tế bào [38]. Glucocorticoid (GC) tự nhiên là hormon do tuyến thượng thận sản xuất, gồm hai chất là hydrocortison và cortison, có vai trò quan trọng trong điều hòa chuyển hóa các chất. Glucocorticoid hoạt động theo cơ chế liên kết với thụ thể gluc ocorticoid (GR). Thụ thể glucocorticoid (GR) là một thành viên của siêu họ thụ thể trong nhân tế bào [38]. Thụ thể glucocorticoid có thể được phân chia thành 3 đoạn chính: thứ nhất là đoạn cuối đầu N kích hoạt phiên mã , thứ hai là đoạn liên kết Acid Deoxyribo Nucleic (AND) trung tâm và thứ ba là đoạn cuối đầu C liên kết với phối tử (ligand) [26]. Các phối tử đặc hiệu liên kết thụ thể glucocorticoid bằng cách xuyên qua màng plasma của tế bào. Khi thụ thể glucocorticoid đã được hoạt động nhờ liên kết với phối tử đặc hiệu, nó sẽ thay đổi hình dạng và chuyển tới định vị 5 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi trên Acid Deoxyribo Nucleic (AND) của nhân tế bào và điều khiển quá trình biểu hiện của các gen đích. Ở trạng thái chưa gắn kết với phối tử, thụ thể glucocorticoid bất hoạt nằm ở tế bào chất có ch ứa các protein shock nhiệt 90, 70, 50. Sau khi liên kết với phối tử đặc hiệu, thụ thể glucocorticoid được kích hoạt sẽ thay đổi hình dạng, tách ra khỏi những protein shock nhiệt và tương tác trực tiếp với các vị trí trên chuỗi Acid Deoxyribo Nucleic (AND) trong nhân tế bào bao gồ m các y ếu tố phản ứng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-GREs) trong vùng promoter của những gen đích, hoặc những yếu tố (factor) phiên mã khác thông qua các tương tác protein với protein, giữa thụ thể glucocorticoid và nhân tố phiên mã AP -1 (activator protein 1) hoặc giữa thụ thể glucocorticoid với tổ hơ ̣p protein kiể m soát phiên mã của Acid Deoxyribo Nucleic (AND) là NF -КB (nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells) (Hình 1). Glucocorticoid thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình điều hòa trạng thái cân bằng nội sinh của cơ thể sống. Chúng cần thiết để duy trì rất nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, chẳng hạn trạng thái cân bằng nội sinh của trung tâm thần kinh và hệ thống tim mạch, quá trình phản ứng miễn dịch và quá trình viêm nhiễm. Glucocorticoid đóng vai trò như là các chấ t ức chế miễn dịch và kháng viêm đặc trưng không thay thế với nhiều bệnh viêm nhiễm, mẫn cảm miễn dịch, dị ứng và liên quan đến quá trình phát triển của tế bào lympho , ví dụ bệnh th ấp khớp… Mặc dù Glucocorticoid tổng hợp là những đại diện có tiềm năng nhất về chống viêm nhưng khi sử dụng chúng lại sinh ra những phản ứng phụ không có lợi cho cơ thể. Để khắ c phu ̣c vấ n đề này , cấu trúc của đoạn liên kết với ph ối tử của thụ thể glucocorticoid được xác đinh ̣ và c ấu trúc của phối tử đươ ̣c cải biế n đ ể làm thay đ ổi hình dạng cuối cùng của phức hơ ̣p thụ thể glucocorticoid - phối tử. Điều này đã đem lại thành công như trong trường hơ ̣p các ph ối tử của thụ thể oestrogen. Phố i tử này giúp thụ thể glucocorticoid vẫn giữ được hoạt tính kháng viêm nhưng lại giảm đi khả năng gây hiệu ứng phụ. Hướng nghiên cứu này đã mở ra kh ả năng phát triển được nhiều hợp chất chố ng viêm hi ệu quả từ các Glucocorticoid tổ ng hơ ̣p trong tương lai [15]. 6 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Hình 1. Cơ chế hoa ̣t đô ̣ng của thu ̣ thể Glucocorticoid trong tế bào [49] Cơ chế kháng viêm của Glucocorticoid (Hình 2) trong quá trình viêm mãn tính đươ ̣c Peter và c ộng sự chứng minh là do nó đã ức chế quá trình hoạt động của các yếu tố phiên mã giống như NF-КB và AP-1 (activator protein -1) [34]. 7 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi Hình 2: Mô hình cơ chế kháng viêm của thụ thể glucocorticoid [33] Theo các tác giả này thì thụ thể glucocorticoid trong tế bào chấ t sau khi đươ ̣c kích hoạt bởi glucocorticoid sẽ di chuyển vào nhân . Ở đây chúng liên k ết với các yếu tố phản ứng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-GREs) trong các gen đích đáp ứng steroid, dẫn tới làm tăng quá trình phiên mã. Tuy nhiên, thụ thể glucocorticoid lại làm gi ảm quá trình phiên mã c ủa những gen tham gia vào quá trình gây viêm và những gen không có vị trí GRE (glucocorticoid response element) trong các vùng promoter của chúng. Khi hoạt động, thụ thể glucocorticoid có thể liên kết với NF-КB đã được kích hoạt và ngăn cản nó không gắn vào các vị trí kB ở những gen tham gia vào quá trình viêm . Quá trình tương tác này có th ể xảy ra trong tế bào chấ t hoặc ở trong nhân. Cụ thể là glucocorticoid làm tăng quá trình phiên mã của gen IКBα mã hóa cho chất ức chế IkBa (NF-kappa-B inhibitor alpha) dẫn tới quá trình thay đổi hình dạng của protein liên kết với NF-КB. Protein IkBa (NFkappa-B inhibitor alpha) kích thích quá trình tách rời của NF-КB trong phức hệ NFКB dẫn tới NF-КB tách rời khỏi phức hê ̣ và di chuyể n từ tế bào chấ t vào nhân . Những NF-КB bị tách ra khỏi phức hệ này sẽ bị thụ thể glucocorticoid bắt cặp và cản trở liên kết với các đo ạn gen gây viêm . Các kế t quả thu đươ ̣c là rấ t có giá tr ị trong viê ̣c tìm ra nh ững phối tử thụ thể glucocorticoid tổng hợp và tự nhiên từ thực vật có tiń h kháng viêm ưu viê ̣t hơn các thuố c glucocorticoid đã tim ̀ thấ y trước đó . Điề u này đã được khẳng định trong các nghiên cứu của Schäcke và cộng sự [38]. Sử 8 Luận văn tốt nghiệp dụng mô hình sàng lọc Nguyễn Thị Tươi in vitro theo cơ chế hoa ̣t hóa hay ức chế thụ thể glucocorticoid và mô hình gây viêm in vivo trên chuô ̣t NMRI để theo dõi các phản ứng phụ đặc trưng của thụ th ể glucocorticoid cũng như động dược học (pharmacokinetic) của chất tiềm năng , các tác giả đã phát hiện thấy chất ZK 245186, mô ̣t chấ t ức chế cho ̣n lo ̣c thụ thể glucocorticoid mới không có bản chấ t steroid đang trong giai đoa ̣n thử nghiê ̣m cho xử lý viêm bề mă ̣t , thể hiê ̣n hoa ̣t tin ́ h kháng viêm ưu việt nhất hiện nay. 2.1.3.Thụ thể họ toll-like và cơ chế kháng viêm Đáp ứng ban đầu hay đáp ứng bẩm sinh với quá trình viêm gây ra bởi các mầm bệnh là đáp ứng không đặc hiệu của quá trình bảo vệ vật chủ. Năm 1996, Toll đã phát hiện ra protein c ủa ruồ i dấ m Drosophila và nhâ ̣n thấ y r ằng protein này không chỉ đòi hỏi trong sự phát triển của phôi đối với ruồi mà còn đáp ứng hiệu quả chống lại nấm [30]. Từ khám phá này, các nghiên cứu đã phát hiện và hiểu rõ được chức năng của các protein có tên go ̣i toll trong quá trình đáp ứng miễn dịch bẩm sinh. Ở chuột có 12 loại thu ̣ thể toll go ̣i là toll like receptors (TLR) được phân loại thành TLR1- TLR12, ở người thì chỉ có 11 loại TLR. TLR là protein màng loại I được biểu hiện trong các tế bào miễn dịch tham gia đáp ứng ở giai đoạn đầu tiên của vật chủ đối với mầm bệnh bao gồm các đại thực bào (macrophage), tế bào tua, tế bào da và bạch cầu trung tính. Lớp thụ thể này được gọi là các thụ thể nhận dạng mẫu mầm bệnh (PRR). Chúng có khả năng nhận dạng rấ t phong phú t ừ protozoa tới vi khuẩn, nấm và virus. Đây là các thu ̣ thể nhâ ̣n biế t quan tro ̣ng nhấ t các sản phẩ m của vi sinh vâ ̣t. Các vùng ngoại bào của T LR chứa các motif giàu leucin (LRR) lă ̣p đi lă ̣p la ̣i tạo dạng đế ngựa có thể nhận biết các LPS của vi khuẩn gram (-), peptidoglican của vi khuẩ n gram (+), các lipoprotein, pipopeptide, roi (flagellin)…của vi khuẩ n . TLR phát hiện các mầm bệnh bằng liên kết với các phân tử mẫu ở vi sinh vật (PAMPs). Lớp thụ thể này, sau khi nhận dạng ra mầm bệnh sẽ truyền tín hiệu vào bên trong tế 9 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi bào. Khi đã đươ ̣c nhâ ̣n biế t , các LRR của TLR khơi mào hàng loạt chuỗi các chuyể n hóa , ví dụ LP S hoa ̣t hóa TLR 4, oligoderoxynucleotide vi khuẩ n hoa ̣t hóa TLR9… và kích hoạt sản xuất các cytokine, chemokine tiền viêm và kháng viêm, interferon, quá trình phosphoryl hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase (mitogen-activated protein kinases-MAPKs), hay phản ứng oxi hóa [31]. Bên ca ̣nh đó, TLR còn tham gia vào quá trình kích thích ban đ ầu các lớp tín hiệu trong các tế bào để phát triển miễn dịch đáp ứng nên được xem như là các thành viên kích thích viêm. Trong số này , TLR4 tham gia hoạt động trong hệ thống miễn dịch cảm ứng bằng lipopolysccharides vi khuẩn (LPS) thông qua nhận dạng đặc hiệu những phân tử ngoại độc tố (lipid A). Đây là một yế u tố cơ b ản trong đáp ứng miễn dịch với vi khuẩn gram âm. Quá trình hoạt động đầ y đủ của TLR truyền tín hiệu đòi hỏi sự hợp tác hoạt động của một vài adapter tín hiệu, bao gồm MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88) và những adaptor của MyD88, chẳng hạn như các tín hiệu của TLR2 phụ thuộc hoàn toàn vào MyD88(myeloid differentiation primary response protein 88), hay TLR4 phụ thuộc vào đoạn protein có chứa MyD88/TIR (TIRAP) hoặc đoạn thụ thể toll/IL-1 có chứa một adapter kích thích sinh interfron (TRAM) để tạo ra những đáp ứng phân biệt [32] (Hình 3). Hình 3. Cơ chế hoạt động của một số TLR [30] Tín hiệu TLR không thích hợp hoặc không kiểm soát được sẽ làm ảnh hưởng xấu tới sinh lý m ầm bệnh của nhiều bệnh bao gồm: bệnh nhiễm trùng, các bệnh 10 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi viêm loét đại tràng, hội chứng mẫn cảm miễn dịch hay bệnh hủi. Nhiễm trùng có thể được định nghĩa như những điều kiện lâm sàng gây ra b ởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân với quá trình nhiễm trùng, được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [16]. Các n ỗ lực nhằ m đi ều trị kháng viêm (kháng LPS, kháng cytokine) và kháng đông tụ trong nhiều năm qua đề u không mang la ̣i hiệu quả bởi lẽ các liệu pháp này b ị giới hạn bởi tin ́ h kháng nhi ễm và viê ̣c chăm sóc h ỗ trợ không được xử lý dưới góc độ mầm bệnh về mặt sinh lý học. Các nghiên cứu chu ẩn đoán cho thấ y nhi ễm trùng gram âm chiếm khoảng 60% trong tổng số các trường hợp và LPS là chất truyền đi ban đầu kích thích đáp ứng tăng cường viêm thông qua hệ thống miễn dịch. Ngoài ra , Bhattacharjee và Akira (2005) cũng chứng minh được TLR4 là thụ thể nhận dạng đặc hiê ̣u LPS với bằ ng chứng là các vi khu ẩn đột biến LPS không bộc lộ hoặc các động vật thiếu TLR4 không pháp triển choáng nhiễm khuẩn trong quá trình đáp ứng với LPS [10]. Với phát hiê ̣n này , các nhà nghiên cứu hy vo ̣ng rằ ng viê ̣c điề u tri ̣bê ̣nh nhiễm trùng vi khuẩn có thể đươ ̣c cải thiê ̣n nhờ cách can thiê ̣p vào con đường tín hiệu TLR, cụ thể là TLR4. Chất ức chế phân tử liên kế t với TLR4 là MD-2 được xem như một đại diện chống viêm đã có m ặt trong danh sách của các thuốc tiềm năng. Bên ca ̣nh đó , viê ̣c phát hiê ̣n thấ y LPS là phố i tử đă ̣c hiê ̣u của TLR4 cũng giúp định ra hướng nghiên cứu mới về đi ều trị nhiễm trùng sử dụng mô hình chuột gây nhiễm trùng bởi LPS . Đây là hướng nghiên cứu rấ t có triể n vọng trong việc tìm ra đư ợc các chất có khả năng kìm hãm quá trình sinh ra các yếu tố gây viêm [10]. Chính vì thế , trong số các TLR đươ ̣c phát hiê ̣n thì TLR 4 được quan tâm nghiên cứu nhiề u nhấ t . TLR4 đươ ̣c nhận dạng đầu tiên và chứng minh chức năng thông qua nghiên cứu với chuột C3H/HeJ và C57BL/10ScCr kháng LPS [31]. Các nghiên cứu ở chuột đột biến đã chứng minh vai trò c ủa TLR4 trong quá trình bảo vệ chống lại nội độc tố trong máu [22]. Chuột bị đột biến TLR4 có tính nhạy cảm v ới quá trình nhiễm vi khuẩn gram âm hệ thống so với đố i chứng [43] vì quá trình hoạt động của TLR4 là rấ t cầ n thiế t để ta ̣o mi ễn dịch bảo vệ chống lại quá trình viêm cũng như truyền các tín hiệu viêm nhiễm ngoại độc tố hệ thống mô ̣t cách hi ệu quả. Hàng loạt các nghiên 11 Luận văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Tươi cứu về các mầm bệnh vi khuẩ n gram âm bao g ồm Neisseria meningitides, E. coli, Haemophilus influenzae, Kleb-siella pneumoniae và Brucella abortus, S. pneumoniae và Mycobacteria tuberculosis trên mô hình chuột bị nhiễm khuẩ n đã chứng minh vai trò quan tro ̣ng c ủa TLR4 [39]. TLR4 cũng có thể nhận dạng đươ ̣c một số loại virus trong quá trình viêm bao gồm virus syncytial [28], các retrovirus ở chuột, virus gây u động vật có vú và gây ung thư máu ở chuô ̣t (murine leukemia virus) [36]. Vai trò của TLR4 trong các bệnh lây nhiễm ở người đã được chứng minh thông qua các nghiên cứu về tính đa hình biể u hiê ̣n của TLR 4 trong các bệnh lây nhiễm tế bào, bệnh lây nhiễm, nhiễm trùng, quá trình lây nhiễm gram hoặc các vi khuẩn khác như vi khuẩ n lao hay số t rét [20, 25, 41]. 2.1.4.Tế bào marcrophage Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống. Vai trò chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, chúng còn đóng vai trò các t ế bào trình diện kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể. Do đóng vai trò quan trọng trong quá trình thực bào của cơ thể, đại thực bào có liên quan đế n m ột số tình trạng bệnh lý do miễn dịch. Ví dụ các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm mạnh, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh sinh của các hội chứng này. Các cytokine chính được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố hoại tử khối u α (Tumor Necrosis Factor α - TNF α), IL-6, IL-8, IL-12, interferon (IFN)-γ, nitric oxide (NO) và các phân tử dính kết tế bào dẫn đến làm tăng quá trình viêm . Như vâ ̣y, viê ̣c kiể m soát sản xuấ t các chấ t này có thể làm giảm khả năng viêm . Macrophage là tế bào có kić h thước tương đố i lớn và có khả năng đáp ứng nhanh với các kích thích viêm ta ̣o ra bởi LPS . Ngoài ra, các TLR ở macrophage được biểu hiê ̣n mạnh hơn so với các tế bào ba ̣ch cầ u khác 12 (Hình 4) nên nó thường đươ ̣c l ựa