Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) và cây Hậu phác (Magnolia officinalis Rehd. Et Wils, Magnoliaceae

  • Số trang: 83 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 339 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Đã đăng 27558 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd. Et Wils, Magnoliaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd. Et Wils, Magnoliaceae) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG THỊ MỸ NHUNG Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... v DANH MỤC HÌNH MINH HỌA ........................................................................... vi BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT ............................................................................. x MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN.................................................................................. 3 1.1. Tổ ng quan về ung thƣ ........................................................................... 3 1.1.1. Một số đặc điểm của ung thƣ ................................................. 3 1.1.2. Các giai đoạn phát triển của ung thƣ ...................................... 5 1.2. Các mô hình sàng lọc thuố c chố ng ung thƣ ........................................... 8 1.2.1. Nuôi cấy cơ quan ................................................................... 8 1.2.2. Nuôi cấy tế bào ...................................................................... 8 1.2.3. Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thƣ (multicellular tumor spheroid)………………….. .................................................................................. 10 1.2.4. Mô hình in vivo ................................................................... 12 1.3. Mô ̣t số dòng tế bào ung thƣ ................................................................ 14 1.3.1. Dòng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết ở ngƣời - HCT116 .... 14 1.3.2. Dòng tế bào ung thƣ biểu mô cổ tử cung ở ngƣời - Hela ...... 14 1.3.3. Dòng tế bào ung thƣ biểu mô vú ở ngƣời - MCF7 ................ 15 1.3.4. Dòng tế bào ung thƣ vú ở ngƣời - KPL4 .............................. 16 1.4. Chế phẩ m Honokiol, Magnolol, Derrone và thuố c Taxol .................... 16 1.4.1. Honokiol (H) và Magnolol (M) ............................................ 16 1.4.2. Derrone (D) ......................................................................... 19 1.4.3. Taxol (Paclitaxel) ................................................................ 20 1.5. Enzyme Aurora kinaza ....................................................................... 22 CHƢƠNG 2 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................25 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 25 2.2. Máy móc, dụng cụ .............................................................................. 25 2.3. Hóa chất sử dụng ................................................................................ 26 2.4. Phƣơng pháp hoạt hóa và nhân nuôi các dòng tế bào in vitro .............. 27 2.5. Phƣơng pháp thử độc tính MTS .......................................................... 28 2.6. Phƣơng pháp thử độc tính trên mô hình spheroid ................................ 30 2.7. Phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ..................................... 31 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................33 3.1. Kế t quả khảo sát đô ̣c tin ́ h của Honokiol , Magnolol và Derrone trên mô hình 2D……………. ............................................................................................. 33 3.1.1. Với dòng HCT116 ............................................................... 33 3.1.2. Với dòng Hela ..................................................................... 38 3.1.3. Với dòng MCF7................................................................... 41 3.1.4. Với dòng KPL4 ................................................................... 44 3.2. Kế t quả nghiên cƣ́u tác đô ̣ng của Honokiol trên mô hin ̀ h 3D khố i cầ u đa bào MCF7………….. ............................................................................................ 51 3.2.1. Kết quả thí nghiệm theo dõi sự tăng trƣởng khối spheroid MCF7………………………. ................................................................................ 51 3.2.2. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tác động của Honokiol lên quá trình tạo khối spheroid MCF7 ................................................................................ 54 3.2.3. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tác động của Honokiol lên sự tăng trƣởng của khối spheroid MCF7 .................................................................... 56 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của Honokiol lên hệ vi sợi actin ......... 59 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của Derrone lên sự phosphoryl hóa Histon H3 tại vị trí Serine 10 ................................................................................. 62 KẾT LUẬN ............................................................................................................66 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................68 Luận văn cao học Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao ....................................................................... 25 Bảng 2: Thiết bị sử dụng ....................................................................................... 26 Bảng 3: Hóa chất sử dụng ..................................................................................... 26 Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng .................................... 28 Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol và Taxol................................................................................................. 35 Bảng 6: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol và Taxol với dòng HCT116 ............. 38 Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol và Taxol .................................. 39 Bảng 8: Giá trị IC50 của Honokiol và Taxol với dòng Hela.................................... 41 Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) của MCF7 với Honokiol và Taxol ......................... 43 Bảng 10: Giá trị IC50 của Honokiol (H) và Taxol với dòng TBUT MCF7 .............. 44 Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol................................................................................................................. 47 Bảng 12: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol với dòng KPL4 50 Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC50 và chỉ số tương quan R2 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol .................................................................................................. 50 Bảng 14:Thể tích của khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau khi hạ giọt treo ........ 52 Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 trong 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol................................................................................................................ 58 Luận văn cao học Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư .............................................................. 3 Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc ............................................... 8 Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy ................................... 9 Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư .... 10 Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người ........................... 14 Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro ............................... 15 Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd. Et wils (trái) và cấu trúc phân tử của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải) ...................................... 16 Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền tin dẫn đến apoptosis của tế bào............................................................................ 18 Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo Derrone ................................................................................................................. 19 Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol ........................................................................... 20 Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis ............................... 22 Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin......................... 22 Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza ............................................................... 24 Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng .................... 27 Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .................... 33 Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL (phải) (100x) ......................................................................................................... 33 Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL (phải) (100x) ......................................................................................................... 34 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm vi Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) ........................................................... 34 Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H) .............................................................................................................................. 36 Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Magnolol (M) .............................................................................................................................. 36 Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Taxol .......... 37 Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .......................... 38 Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol ở nồng độ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) ......................................................................................................... 38 Hình 24: Tế bào Hela ủ Taxol nồng độ 0,003 (trái), 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) .................................................................................................................... 39 Hình 25: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Honokiol (H).... 40 Hình 26: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Taxol................ 40 Hình 27: Tế bào MCF7 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) ....................... 41 Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol ở nồng độ 5 (trái); 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) .......................................................................................... 42 Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), và 30µg/mL (phải) (100x) .......................................................................................... 42 Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Honokiol (H) . 43 Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Taxol ............. 44 Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) ........................ 45 Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) ......................................................................................................... 45 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm vii Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) ......................................................................................................... 45 Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ 5 (trái) và 20µg/mL (phải) (100x) .................................................................................................................... 46 Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) ......................................................................................................... 46 Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H) .. 48 Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M) . 48 Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D) ... 49 Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol .............. 49 Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25 ngày kể từ khi hạ giọt treo ..................................................................................... 52 Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo ........ 53 Hình 43: Khối spheroid MCF7 ở mẫu ĐCSH sau 5 (a) và 7 (b) ngày, ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL sau 5 (c) và 7 (d) ngày và không tạo khối khi ủ Honokiol NĐ 10µg/mL (e) ........................................................................................................... 55 Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo.... 56 Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) ........................................... 56 Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) ........................................... 57 Hình 47: Các khối spheroid dưới tác động của Honokiol trở nên lỏng lẻo về mặt cấu trúc, các tế bào bên ngoài bong tróc ra khỏi khối từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt treo (400x) ............................................................................................................. 57 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm viii Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của Honokiol (H) ......................................................................................................... 58 Hình 49: Ảnh hưởng của Honokiol lên hình thái tế bào Hela. Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào ............................................................................................................ 60 Hình 50: Sự rối loạn phân bố của F-actin dưới tác động của Honokiol tại NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ. ................................................................................................... 60 Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol tại NĐ 20µg/mL. ........................... 61 Hình 52: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của tế bào. ................................................................................................................... 64 Hình 53: So sánh biểu hiện của H3PS10 tại các mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) và mẫu đối chứng (a). ............................................... 65 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm ix Luận văn cao học Danh mục viết tắt BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ VIẾT TẮT ADN Acid deoxiribinucleic ARN Acid ribonucleic c-FLIP FLICE-like inhibitory protein D Derrone ĐCDM Đối chứng dung môi ĐCSH Đối chứng sinh học DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium FBS Huyết thanh thai bê – Fetal bovine serum FLICE Caspase 8 H Honokiol HCT116 Human colorectal carcinoma cell line HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line KHV Kính hiển vi KPL4 Human breast cancer cell line M Magnolol MCF7 Human breast adenocarcinoma cell line (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- MTS carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium) NĐ Nồng độ Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm x Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t NST Nhiễm sắc thể PBS Đệm phosphate saline – Phosphate buffered saline PMS Phenazine methosulfate TBUT Tế bào ung thƣ TNF Tumor necrosis factor TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm xi Luận văn cao học Mở đầu MỞ ĐẦU Ung thƣ là nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nƣớc có nền kinh tế phát triển và thứ hai ở các nƣớc đang phát triển. Gánh nặng ung thƣ ở các nƣớc đang phát triển tăng lên do hậu quả của sự tăng dân số, già hóa dân số cũng nhƣ sự du nhập lối sống có tiềm năng gây ung thƣ nhƣ hút thuốc lá, ít vận động và thực phẩm “Tây hóa”. Theo Tổ chức Y tế thế giới – WHO, có khoảng 12.7 triệu ca ung thƣ và 7,6 triệu ca tử vong do ung thƣ đƣợc ghi nhận trong năm 2008, trong đó 56% số ca và 64% trƣờng hợp tử vong là ở các nƣớc đang phát triển. Cũng theo dự báo của WHO, tới năm 2020, số ngƣời mắc ung thƣ trên toàn cầu có thể tăng lên đến 15 triệu ca mới mỗi năm. Tỷ lệ chết do ung thƣ có thể chiếm 25% tổng số ca tử vong. Theo số liệu công bố tại Hội thảo Quốc gia phòng chống ung thƣ, năm 2010 Việt Nam có 126.300 ca mắc mới. Căn bệnh nan y này đang tăng nhanh so với 10 năm trƣớc [1]. Vốn là một đất nƣớc đƣợc thiên nhiên ƣu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau. Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dƣỡng cho con ngƣời mà còn là những phƣơng thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồ m thuốc chố ng ung thƣ nói riêng và các bệnh khác nói chung. Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dƣợc liệu thiên nhiên có khả năng chữa ung thƣ là một hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu tƣ tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay. Trong xu hƣớng này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng u của ba chất Honokiol, Magnolol đƣợc tách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd. Et wils, Magnoliaceae và Derrone đƣợc tách chiết từ cây Vông nem Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae do Viện Dƣợc liệu Trung ƣơng cung cấp cho nhóm Nghiên cứu Ung thƣ thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nhằm mục đích: Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 1 Luận văn cao học Mở đầu Khảo sát ảnh hƣởng của ba chất Honokiol, Magnolol và Derrone lên sự tăng trƣởng của một số dòng tế bào ung thƣ nuôi cấy đơn lớp 2D. Nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của Honokiol lên mô hình 3D khối cầu đa bào các tế bào ung thƣ. Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác động của Honokiol lên hệ thống vi sợi và tác động của ba chất lên hoạt động của enzyme Aurora kinaza ở tế bào ung thƣ. Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 2 Luận văn cao học Tổng quan CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Tổ ng quan về ung thƣ 1.1.1. Một số đặc điểm của ung thư Trong quá trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thƣ (TBUT) thu nhận và biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu khả năng sinh học nổi bật tạo nên đặc tính phức tạp về mặt tổ chức của bệnh, bao gồm: duy trì tín hiệu tăng sinh; trốn tránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân lên gần nhƣ bất tử; cảm ứng hình thành mạch máu và hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn. Nguyên nhân sâu xa của những đặc điểm đặc trƣng này là sự bất ổn của hệ gen trong TBUT dẫn đến những biến đổi về mặt di truyền, đồng thời cũng hỗ trợ các chức năng trên. Ngoài ra, những nghiên cứu gần đây đề xuất thêm hai đặc trƣng khác của ung thƣ bao gồm sự tái lập trình trao đổi năng lƣợng và sự trốn tránh hệ thống miễn dịch. Tuy nhiên, cần những nghiên cứu sâu hơn để hai đặc trƣng mới này đƣợc công nhận rộng rãi [14]. Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 3 Luận văn cao học Tổng quan Về mặt hình thái, TBUT có sự thay đổi khá rõ nét so với tế bào bình thƣờng:  Về nhân: Nhân tăng kích thƣớc, đa dạng, nhiều thùy, đặc biệt có những nhân khổng lồ phân chia mạnh gọi là nhân quái, nhân chia. Màng nhân dày lên và đƣờng viền không đều.  Về tỷ lệ giữa nhân và nguyên sinh chất: Nhân to lên trong khi nguyên sinh chất hẹp lại.  Về nguyên sinh chất: Có nhiều tổn thƣơng thoái hóa nhƣ nhiều hang, hốc… Nguyên sinh chất chứa các chất chế tiết, thể vùi.  Không còn khả năng ức chế tiếp xúc nên dễ bong ra khỏi u. Về mặt chức năng, TBUT biệt hóa kém, không thực hiện đƣợc những chức năng bình thƣờng và dễ hoại tử. Đặc biệt, chúng tiết ra các chất chỉ điểm đƣợc gọi là marker nhƣ µFP, CA125 (ung thƣ buồng trứng), CA25 (ung thƣ đại tràng), HCG (ung thƣ nhau thai, tinh hoàn)… Khi quan sát quần thể TBUT, các nhà khoa học đã đƣa ra ba học thuyết khác nhau nhằm giải thích nguồn gốc quần thể này:  Thuyết đơn dòng: Là quan niệm kinh điển cho rằng khối u phát sinh từ một tế bào mẹ nhân lên. Ví dụ: Ở bệnh bạch cầu tủy trên phụ nữ da đen thấy đồng nhất loại tế bào thƣơng tổn NST số 10. Các tế bào này đều tiết men Glucose-6-phosphate dehydroglubuline.  Thuyết đa dòng: Dựa trên kết quả quan sát hình thái và chức năng cho thấy tổ chức ung thƣ có nhiều loại tế bào nên khi chuẩn đoán tế bào học dễ nhầm lẫn và có nhiều marker sinh học.  Thuyết về kém ổn định gen của TBUT: Có thể ban đầu là một dòng, do gen ung thƣ không ổn định nên có các tế bào biến dị sinh ra hàng loạt các tế bào hỗn hợp. Ví dụ: u lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ hoặc các loại ung thƣ phổi thể hỗn hợp, ung thƣ mô liên kết thể hỗn hợp. Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 4 Luận văn cao học Tổng quan 1.1.2. Các giai đoạn phát triển của ung thư Theo Douglas và Robert Weinberg, quá trình tiến triển của ung thƣ có thể chia làm 6 giai đoạn chính:  Giai đoạn khởi phát: Các TBUT nhận đƣợc các tín hiệu thúc đẩy sự tăng sinh và phân bào. Các tín hiệu này có thể xuất hiện do sự thay đổi của các yếu tố ngoại bào hoặc do sự thay đổi bên trong hệ thống truyền tín hiệu nội bào dẫn tới sự tăng sinh và phân bào. Thậm chí, trong một số trƣờng hợp đặc biệt, các tín hiệu kích thích phân bào có thể đƣợc tạo ra từ chính các TBUT. Khi đó, tế bào đƣợc kích thích phân chia không giới hạn. Quá trình này diễn ra nhanh và hoàn tất trong một vài giây, không thể đảo ngƣợc đƣợc. Trong cuộc đời một con ngƣời, có nhiều tế bào trong cơ thể có thể trải qua quá trình khởi phát, nhƣng không phải tất cả các tế bào đều phát sinh bệnh. Đa số các tế bào khởi phát hoặc không tiến triển, hoặc chết đi, hoặc bị cơ chế miễn dịch vô hiệu hóa.  Giai đoạn thúc đẩy: Các tế bào trở nên “vô cảm” một cách bất thƣờng với các tín hiệu ức chế phân bào. Trong các tế bào bình thƣờng, sự phân bào thƣờng đƣợc kích hoạt bởi các tín hiệu nhất định; và tồn tại song song với chúng là các tín hiệu ức chế phân bào. Bình thƣờng, hai cơ chế này cùng tồn tại và phối hợp với nhau ở mức cân bằng, vì vậy sự phân bào diễn ra ổn định và có tổ chức. Ở các TBUT thì sự ngăn cản phân bào bị tê liệt, khi đó tế bào sẽ luôn đƣợc chuyển từ pha G1 sang S để tiến hành sao chép ADN và bƣớc vào một chu trình tế bào mới bất kể các sai hỏng ADN có đƣợc khắc phục hay không. Các tế bào sau giai đoạn tăng trƣởng này sẽ tiếp tục phát triển thành các khối u ác tính.  Giai đoạn chuyển biến: Nhƣ ta đã biết, protein p53 giữ vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ cơ thể chống lại sự tích lũy sai hỏng ADN có thể gây nguy hiểm cho cơ thể. Khi p53 bị mất chức năng này thì con đƣờng apoptosis của tế bào không hoạt động. Vì vậy tế bào hỏng có thể sống và tiếp tục nhân lên nhanh chóng. Những tế bào này có xu hƣớng tạo ra các thế hệ tế bào con Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 5 Luận văn cao học Tổng quan có mức độ sai hỏng còn cao hơn chính nó. Hậu quả là mỗi tế bào con hình thành đều có nguy cơ chuyển thành các TBUT. Nhƣ vậy có thể nói, khả năng thoát khỏi cơ chế chết theo chƣơng trình là “cột mốc” quan trọng để một TBUT phát triển thành khối u ác tính.  Giai đoạn lan tràn: Các TBUT có khả năng sao chép vô tận. Ở ngƣời, mỗi tế bào soma thƣờng chỉ có khả năng sao chép trung bình khoảng 60 – 70 lần. Tuy nhiên các TBUT có thể vƣợt quá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần đầu mút nhiễm sắc thể đƣợc kéo dài nhờ hoạt động mạnh của enzyme ADN telomeraza. Khi các TBUT đạt đến giai đoạn này, chúng đƣợc gọi là các tế bào bất tử. Giai đoạn này có thể ngắn vài tháng hoặc cũng có thể kéo dài vài năm. Trong giai đoạn này, khối u bành trƣớng, gia tăng có thể từ 100 đến 1 triệu tế bào nhƣng vẫn còn quá nhỏ để các phƣơng pháp khoa học phát hiện đƣợc.  Giai đoạn củng cố: Các tế bào phát triển hệ thống tự nuôi dƣỡng. Các mô trong cơ thể đa bào đều cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh dƣỡng. Các tế bào khối u tiền ác tính thƣờng tăng trƣởng chậm do chúng đƣợc nuôi dƣỡng bởi hệ tuần hoàn bình thƣờng. Nhƣng ở các TBUT, khi khối u phát triển đến một mức nhất định thì xuất hiện sự hình thành mạch máu mới. Lúc này các khối u đƣợc nuôi dƣỡng và phát triển rất mạnh. Đây là một bƣớc “củng cố” các TBUT ác tính hình thành mạch máu mới nuôi dƣỡng các khối u, giúp khối u phát triển mạnh mẽ và gây nguy hiểm cho cơ thể.  Giai đoạn xâm lấn và di căn: Ở giai đoạn này, các TBUT có khả năng xâm lấn vào các vùng mô khác và hình thành khối u mới. Hơn 90% số bệnh nhân bị ung thƣ đều chết vào giai đoạn khi các TBUT đã di căn tới các phần khác nhau của cơ thể. Khi các khối u di căn, các TBUT rời khỏi khối u nguyên phát và di chuyển dọc theo đƣờng máu hoặc đƣờng bạch huyết tới các vị trí khác nhau trong cơ thể trƣớc khi chúng trú ngụ ở vị trí mới và hình thành khối ung thƣ mới. Di căn theo đƣờng bạch huyết thƣờng gặp nhiều trong ung thƣ biểu mô, có thể lan tràn theo đƣờng bạch huyết tại chỗ và đôi khi làm tắc, rồi Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 6 Luận văn cao học Tổng quan lan đến mạch bạch huyết vùng. Trong phƣơng thức di căn theo đƣờng kế cận, các TBUT đi theo mạch máu và thần kinh, theo lối ít khi bị cản trở nhƣ ung thƣ dạ dày lan qua lớp thanh mạc vào ổ bụng, đến buồng trứng… Di căn theo đƣờng máu thƣờng gặp nhiều ở ung thƣ mô liên kết. Khi đó, tế bào kết thúc ở mao mạch và tăng trƣởng ở đó. Nhƣ vậy kết quả di căn là sự hình thành các khối u thứ cấp ở vị trí có thể cách rất xa vị trí khối u nguyên phát ban đầu. Khi ung thƣ đã tiến triển đến giai đoạn này thì sự kiểm soát và điều trị cực kỳ khó khăn. Đây là giai đoạn cuối cùng và nguy hiểm nhất trong quá trình phát triển của ung thƣ. Với khối u lành tính, giai đoạn này không xảy ra. Các tế bào trong khối u lành tính sinh sản chậm và bám vào các mô liên kết tại chỗ, khối u có ranh giới rõ ràng và không gây cảm giác đau cho ngƣời bệnh nếu kích thƣớc khối u không quá to hay chèn ép vào dây thần kinh. Do đó khối u lành không gây nguy hiểm cho ngƣời bệnh và dễ chữa trị [14, 32, 36]. Kể từ khi ung thƣ xuất hiện, lịch sử loài ngƣời đã sử dụng và phát triển nhiều phƣơng pháp khác nhau để chống lại căn bệnh này nhƣ giải phẫu, vật lý trị liệu, hóa trị liệu, miễn dịch trị liệu, điều trị hƣớng đích… Trƣớc đây, thuốc chống ung thƣ đƣợc đƣa vào nhóm phƣơng pháp hóa trị liệu, trị liệu hóc môn và miễn dịch trị liệu. Trong đó, hóa trị liệu lại bao gồm nhiều nhóm khác nhau tùy theo cấu trúc hóa học và cơ chế tác động nhƣ nhóm alkyl hóa, nhóm kháng sinh, nhóm chống chuyển hóa, nhóm ức chế topoisomeraza I và II, nhóm ức chế phân bào, các hợp chất platinum và các hợp chất khác. Tuy nhiên, nhóm cuối cùng này vẫn đang ngày càng mở rộng nên các nhà khoa học đã đề xuất cách thức phân loại mới dựa trên đích tác động. Cụ thể, các nhà khoa học cho rằng thuốc chống ung thƣ có thể tác động ở nhiều mức độ khác nhau: TBUT, nội mô, chất nền ngoại bào hay hệ thống miễn dịch. TBUT có thể trở thành đích tác động ở mức độ ADN, ARN hay protein. Hầu hết các tác nhân hóa trị liệu tƣơng tác với ADN của TBUT trong khi các kháng thể đơn dòng và các phân tử nhỏ đƣợc thiết kế để tác động ở mức độ protein, mức độ nội mô và mức độ chất nền ngoại bào. Dù ở mức độ nào, các hợp chất để đƣợc phát triển thành thuốc sử dụng cho ngƣời đều cần Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 7 Luận văn cao học Tổng quan trải qua một quá trình sàng lọc nghiêm ngặt trên nhiều đối tƣợng cũng nhƣ quy mô khác nhau. Trong lịch sử phát triển lĩnh vực sàng lọc thuốc, đã có một số mô hình đƣợc sử dụng nhƣ: 1.2. Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thƣ 1.2.1. Nuôi cấy cơ quan Đây là loại mô hình đƣợc sử dụng từ những năm 1950. Các cơ quan đƣợc tách ra khỏi cơ thể, đem nuôi cấy in vitro. Sau đó chúng đƣợc tƣơng tác với các hợp chất cần thử. Ƣu điểm của mô hình này là duy trì đƣợc tính nguyên vẹn của mô cũng nhƣ mối quan hệ giữa tế bào với tế bào, nhờ vậy mà nó có tính tƣơng đồng cao với điều kiện in vivo. Tuy nhiên, do những khó khăn trong khác biệt về mẫu mà việc đánh giá hiệu quả của thuốc có nhiều sai số, do vậy việc sử dụng mô hình này bị hạn chế, và khó để áp dụng vào sàng lọc thuốc quy mô lớn [4]. Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc 1.2.2. Nuôi cấy tế bào Nhƣ ta đã biết, các thử nghiệm độc tính ban đầu đƣợc tiến hành trên sinh thiết khối u nuôi cấy nhân tạo trong môi trƣờng có thành phần không xác định, do vậy quá trình định lƣợng rất khó khăn. Năm 1950, nhờ sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thành dạng đơn lớp 2D trong đĩa Petri thủy tinh hoặc nhựa, kết hợp Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 8 Luận văn cao học Tổng quan với sự phát triển của môi trƣờng có thành phần xác định về mặt hóa học nên quy trình sàng lọc thuốc đƣợc tiến hành đơn giản hơn trên các tế bào nuôi cấy 2D này. Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng ta xác định đƣợc mối quan hệ đáp ứng liều giữa các dòng tế bào khác nhau với các nồng độ thuốc thử khác nhau [39]. Các tế bào khi đƣợc phân lập đem nuôi cấy in vitro thƣờng phát triển thành dạng hoặc trôi nổi, hoặc bám dính, hoặc hỗn hợp cả 2 loại. Các loại TBUT sống trôi nổi nhƣ tế bào u lympho, TBUT máu hay tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180. Các tế bào này phát triển giống những hòn đảo nhỏ trôi nổi trong môi trƣờng nuôi cấy. Nhiều tế bào sống ở dạng bám dính nhƣ nguyên bào sợi, TBUT cổ tử cung HeLa, TBUT vú KPL4… Một số tế bào sống ở dạng hỗn hợp cả bám dính, cả trôi nổi nhƣ TBUT biểu mô phổi 3LL [11, 27, 39]. Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy Sử dụng mô hình tế bào 2D có nhiều ƣu điểm nhƣ thời gian sàng lọc ngắn, cho phép thao tác với nhiều dòng tế bào, nhiều hợp chất khác nhau và dải nồng độ rộng cùng một lúc. Tuy nhiên, mô hình này có nhƣợc điểm là tƣơng tác giữa TBUT với hợp chất chỉ theo một chiều, thiếu sự tƣơng tác giữa TBUT với hệ miễn dịch Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 9
- Xem thêm -