Tài liệu Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------------
------------------ NGUYỄN KIM OANH NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI CẤY BAO PHẤN LÚA LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI – 2013 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Kim Oanh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành ñề tài luận văn cao học này, ngoài sự nổ lực cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tận tình giúp ñỡ trong quá trình thực tập. ðặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Phan Hữu Tôn - Trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài. Qua ñây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ñến Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến gia ñình, người thân và toàn thể bạn bè ñã ñộng viên và khích lệ ñể tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2013 Học viên Nguyễn Kim Oanh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích của ñề tài 2 1.3 Yêu cầu của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống cây trồng 3 2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa 7 2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7 2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 9 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy bao phấn lúa 11 2.3.1 Kiểu gen của cây cho bao phấn 11 2.3.2 Giai ñoạn phát triển của hạt phấn 13 2.3.3 ðiều kiện sinh lý của cây cho bao phấn 14 2.3.4 Nhiệt ñộ và thời gian xử lý ñòng 15 2.3.5 ðiều kiện nuôi cấy 16 2.3.6 Thành phần môi trường nuôi cấy 16 2.3.7 Qúa trình phân hoá callus 20 2.3.8 Hiện tượng bạch tạng 21 2.4 Cây ñơn bội và ñặc ñiểm di truyền của cây ñơn bội 22 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 24 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24 3.2 ðịa ñiểm và thời gian tiến hành 24 3.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 24 3.2.2 Thời gian tiến hành: 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu 26 3.4.2 Cấy bao phấn ñể tạo callus 26 3.4.3 Tái sinh cây từ callus 27 3.4.4 Môi trường nuôi cấy 27 3.5 Bố trí thí nghiệm 27 3.5.1 Thí nghiệm 1 27 3.5.2 Thí nghiệm 2 27 3.5.3 Thí nghiệm 3 28 3.5.4 Thí nghiệm 4 29 3.5.5 Thí nghiệm 5 29 3.5.6 Thí nghiệm 6 30 3.5.7 Thí nghiệm7 30 3.5.8 Thí nghiệm 8 31 3.6 Phương pháp ñánh giá và xử lý số liệu 31 3.6.1 Phương pháp ñánh giá 31 3.6.2 Phương pháp xử lý số liệu 32 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Giai ñoạn Tạo callus 33 4.1.1 Phản ứng của bao phấn trong quá trình nuôi cấy 33 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 4.1.2 Ảnh hưởng của kiểu gen tới sự hình thành callus 35 4.1.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus 39 4.1.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỷ lệ sống của mẫu cấy 43 4.1.5 Ảnh hưởng của môi trường MS và N6 ñến khả năng tạo callus của mẫu cấy 4.1.6 45 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến khả năng hình thành callus của bao phấn 47 4.2 Giai ñoạn tái sinh chồi 50 4.2.1 Ảnh hưởng chất lượng callus ñến khả năng tái sinh cây 50 4.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi 54 4.3 Giai ñoạn ra rễ hình thành cây hoàn chỉnh 57 4.3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của cây tái sinh 57 4.3.2 Ảnh hưởng của môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây 63 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 5.1 Kết luận 70 5.2 ðề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D Acid 2,4 dichlorophenoxy axetic Cs Cộng sự CT Công thức BAP 6- Benzylaminopurine Kinetin 6- Furfurylaminopurine MS Murashige and Skoog, 1962 N6 Chu & Cs, 1976 NAA Naphlene axetic acid NCBP Nuôi cấy bao phấn NXB Nhà xuất bản Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến sự hình thành callus 35 4.2 ðộng thái hình thành callus sau 5 tuần theo dõi 38 4.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus 40 4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỷ lệ sống của các dòng nghiên cứu 43 4.5 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn lúa 46 4.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ chết của các dòng nghiên cứu 4.7a Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N39 4.7b 4.11 59 Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến tỷ lệ sống của cây lúa 4.10 56 Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở các công thức thí nghiệm 2 dòng N39 và N13 4.9 54 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N13 4.8 48 63 Ảnh hưởng của một số môi trường thuần dưỡng ñến chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá và số nhánh 64 Khả năng sống của cây in vitro trong ñiều kiện tự nhiên 68 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Hình ảnh callus................................................................................. 34 4.2 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến khả năng hình thành callus.................. 37 4.3 Mối tương quan giữa tỷ lệ bao phấn chết và tỷ lệ bao phấn tạo callus ... 37 4.4a Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N39 .......................................................... 41 4.4b Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N13 .......................................................... 41 4.5a Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N39 .............................................................. 44 4.5b Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N13 .............................................................. 44 4.6 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn lúa 2 dòng N39 và N13 (sau 4 tuần theo dõi) .................................... 46 4.7a Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ chết ở các công thức dòng N39......................................................... 49 4.7b Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ chết ở các công thức dòng N13......................................................... 49 4.8 Ảnh callus chấm xanh....................................................................... 52 4.9 Ảnh tái sinh cây xanh ....................................................................... 52 4.10 Ảnh rễ cây ăn lan vào môi trường thạch ........................................... 52 4.11 Ảnh callus tái sinh một cây xanh và một cây bạch tạng .................... 53 4.12 Ảnh rế ức chế chồi phát triển ............................................................ 53 4.13 Ảnh tái sinh cây bạch tạng................................................................ 53 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii 4.14a Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N39.............................................. 55 4.14b Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N13.............................................. 56 4.15 Chồi xanh tái sinh từ callus sau 25 ngày nuôi cấy............................. 57 4.16 Chồi lúa mới ñược cấy trên môi trường ra rễ .................................... 58 4.17a Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở các công thức nghiên cứu dòng N39 ................................................. 60 4.17b Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở các công thức nghiên cứu dòng N13 ................................................. 60 4.18 Cây lúa N39 sau 10 ngày cấy trên môi trường ra rễ .......................... 61 4.19 Ảnh ra rễ trong môi trường thạch của cây tái sinh............................. 61 4.20a Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây lúa dòng N39 ............................................................ 65 4.20b Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây lúa dòng N13 ............................................................ 65 4.21 Ảnh cây in vitro ñạt tiêu chuẩn ra cây............................................... 69 4.22 Ra cây ngoài tự nhiên ....................................................................... 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Cây lúa (Oryza sativa.L) là cây lương thực giữ vai trò rất quan trọng, thuộc nhóm cây tự thụ phấn. ðể tạo ra một giống mới ñối với cây tự thụ phấn thường người ta tiến hành lai hữu tính sau ñó cho các thế hệ ñời sau tự thụ. Tuy nhiên, ñể tạo ñược dòng thuần ñồng hợp tử tất cả các gen theo cách này thường phải mất từ 7 ñến 8 ñời. Nếu bố mẹ khác xa nhau về mặt di truyền thì số ñời tự thụ cần thiết có thể phải dài hơn nhiều, khi cần tự thụ liên tục trên 10 thế hệ thậm chí vẫn còn phân ly. ðể rút ngắn thời gian tạo dòng thuần, hiện nay người ta ñã tiến hành kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hoặc bào tử hạt phấn thường là từ cây F1 và F2 ñể tạo ra cây ñơn bội, sau ñó lưỡng bội hoá bằng xử lý Colchicine ñể tạo cây nhị bội, ñồng hợp tử về hầu hết các gen. Như vậy, nuôi cấy bao phấn là một kỹ thuật hữu hiệu ñể tạo ra các dòng ñồng hợp tử ngay từ thế hệ ñầu tiên (dòng ñơn bội kép), do ñó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết ñể tạo ra giống mới (Javed, 2007)[32]. Trên thế giới cũng như tại Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ñã thành công ở nhiều ñối tượng cây trồng trong ñó có cây lúa.Tuy nhiên, hiệu quả của quá trình nuôi cấy bao phấn lúa phụ thuộc nhiều yếu tố: kiểu gen của cây ñưa vào nuôi cấy, yếu tố môi trường: nhiệt ñộ, ánh sáng, thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy và các kỹ thuật xử lý trước và sau khi nuôi cấy bao phấn (Trần Duy Quý, 1999; Asoliman, 2007) [13] [23]. Trong nhiều năm qua ñã có hàng loạt những nghiên cứu về vấn ñề này, tập trung vào hai hướng chính là cải tạo về mặt di truyền phản ứng trong nuôi cấy bao phấn thông qua chọn lọc, lai tạo (Herath, 2007) [31] và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy (Bidhan, 2005; Chen, 2007) [24] [27]. Có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy bao Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 phấn lúa ñã ñược công bố nhưng còn chưa thống nhất. Chính vì vậy ñể khẳng ñịnh lại những yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy bao phấn lúa và ứng dụng chúng trong chọn tạo dòng thuần chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn lúa”. 1.2. Mục ñích của ñề tài Xác ñịnh ñược ñiều kiện nuôi cấy tối ưu nhất cho quá trình tạo callus và tái sinh cây xanh. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa. 1.3. Yêu cầu của ñề tài Nghiên cứu 3 giai ñoạn: Giai ñoạn tạo callus: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen, thời gian xử lý lạnh, nồng ñộ chất khử trùng, loại môi trường và nồng ñộ chất kích thích sinh trưởng (2,4D) ñến khả năng tạo callus của mẫu cấy. Giai ñoạn tái sinh cây: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi xanh. Giai ñoạn ra rễ hình thành cây hoàn chỉnh: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của cây tái sinh và ảnh hưởng của môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống cây trồng Nuôi cấy mô tế bào và bộ phận cơ quan thực vật trong môi trường dinh dưỡng vô trùng nhằm tạo cây hoàn chỉnh là một hướng nghiên cứu cơ bản và ứng dụng quan trọng trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Ý tưởng này ñược ñề xuất vào năm 1838 – 1839 trong nội dung học thuyết tế bào của Schleiden và Schwann. Tuy nhiên, vẫn chưa ñược ứng dụng cho ñến ñầu thế kỷ 20 Haberlant – nhà sinh lý học thực vật người ðức nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông thì mỗi tế bào của cơ thể sinh vật nào cũng ñều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và ñầy ñủ của sinh vật ñó. Vì vậy, khi gặp ñiều kiện thích hợp mỗi tế bào ñều có thể phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. ðiều này ñã thu hút nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm chú ý ñến hướng nghiên cứu này và họ ñã thu ñược nhiêù thành tựu to lớn. [17] Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy invitro bao phấn chứa các bào tử hoặc các hạt phấn chưa chín trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo nhằm tạo cây ñơn bội. Số lượng nhiễm sắc thể (NST) của cây ñơn bội ñược lưỡng bội hoá lên bằng thủ thuật thích hợp tạo cây lưỡng bội ñồng hợp tử hoàn toàn gọi là cây nhị bội hoá [17]. Nuôi cấy bao phấn thành công ñầu tiên vào năm 1950 do Morel người Pháp thực hiện thành công trên cây Khoả tử (cây một lá mầm), trên môi trường có bổ sung nước dừa tạo thành mô sẹo. ðến năm 1964 hai nhà khoa học người Ấn ðộ là Guha và Maheshawari nuôi cấy thành công cây cà ñộc dược (Datura innoxia) [9], hình thành phôi và từ phôi này cho cây hoàn chỉnh. Thành công này ñã khởi ñầu cho nhiều nghiên cứu về nuôi cấy hạt phấn của các lòai thực vật hạt kín khác. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 Năm 1967 với công trình của Bouirgin và Nistch, ñã nuôi cấy thành công bao phấn cây thuốc lá (Nicotiana) tạo thành cây ñơn bội. ðặc biệt, năm 1968 Niizeki và Oono thu ñược cây ñơn bội từ bao phấn lúa (Oryza sativa), ñã tạo ra khả năng ứng dụng lớn cho công nghệ chọn tạo giống lúa. Nuôi cấy bao phấn là phương pháp hữu hiệu tạo dòng ñồng hợp tử tuyệt ñối, hoàn toàn không phân ly trong các thế hệ sau. Bên cạnh ñó, thông qua kỹ thuật nuôi cấy bao phấn có thể cố ñịnh ñược ưu thế lai và các gen hữu tính từ con lai F1, có ưu thế lai cao, làm tăng năng suất lúa (M.S.Swaminathan, 1995; Chen et al, 1978; Narayanan et al,1996; Siddiq et al, 1994; Zhu De Yao, 1998) [36]. Mặt khác, trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh tạo các ñột biến, các ñột biến này cung cấp nguồn nguyên liệu cho chọn lọc. ðây là lối thoát kỳ diệu ñối với lĩnh vực ứng dụng cây ñơn bội vào công tác chọn giống cây trồng. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào. Vì vậy kỹ thuật nuôi cấy bao phấn cũng chính là kỹ thuật ñiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có ñịnh hướng dựa vào quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật.. Trong quá trình nuôi cấy có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sự phân hoá tế bào và mô thực vật, trong ñó nhân tố chủ yếu là chất ñiều hoà sinh trưởng thuộc 2 nhóm là auxin và cytokinin. Qúa trình nuôi cấy bao phấn trải qua 2 giai ñoạn là giai ñoạn mô sẹo và giai ñoạn tái sinh cây. Ở giai ñoạn 1: Các tế bào xảy ra quá trình phản phân hóa, các tiểu bào tử phân chia hình thành mô sẹo, ở giai ñoạn 2: Các mô sẹo phân chia liên tục và có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh (thân, lá và rễ). Mỗi giai ñoạn có những ñặc ñiểm khác nhau và yêu cầu về ñiều kiện nuôi cấy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4 khác nhau. Kết quả của quá trình nuôi cấy ta nhận ñược cây ñơn bội hoặc cây tự lưỡng bội hóa. Tỷ lệ cây ñơn bội nhận ñược phụ thuộc vào các yếu tố như: giai ñoạn phát triển của hạt phấn và thời gian duy trì ở giai ñoạn mô sẹo (tuổi mô sẹo). Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt phấn ở giai ñoạn mitos ñầu cho tỷ lệ cây ñơn bội cao nhất. ðối với tuổi của mô sẹo thì mô sẹo càng sớm cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây và thời gian tái sinh cây ngắn thì tỷ lệ cây ñơn bội càng cao. ðể tạo những cây nhị bội từ mô hoặc cây ñơn bội, có 2 phương pháp thường dùng là xử lý mô hoặc cây ñơn bội với colchicine. Các thể nhị bội thu ñược ñều ở dạng ñồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn ñược sử dụng ñể tạo dòng thuần, nghiên cứu thể hiện các gen lặn vì các gen lặn không thể hiện ở cơ thể dị hợp, ở các cơ thể ñồng hợp tử mang gen lặn thì các gen lặn ñược biểu hiện. Ngoài ra những cây ñơn bội nhận ñược từ NCBP và hạt phấn là những nguyên liệu tốt cho chọn dòng tế bào. Phương pháp nuôi cấy bao phấn ñã góp phần rút ngắn ñược nhiều thời gian chọn tạo ra một giống mới, làm tăng hiệu quả chọn lọc bởi khả năng biểu hiện sớm của các gen lặn [33]. Giúp khắc phục tính bất dục ở mức ñộ cao của các dòng lai xa F1. Chính vì vậy phương pháp này ñang ñược áp dụng rộng rãi trong chọn tạo giống lúa trên thế giới và ở Việt Nam. Tuy nhiên, hiện nay NCBP vẫn còn tồn tại những hạn chế, số lượng cây xanh ñạt ñược thông qua NCBP vẫn chưa ñáp ứng ñược nhu cầu cải thiện di truyền. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến NCBP ñã ñược nghiên cứu như kiểu gen của mẫu cấy, tốc ñộ tăng trưởng, ñiều kiện của cây cho bao phấn, phương pháp nuôi cấy (Woo & Chen, 1982) [41]. Mặc dù, các phương thức khác nhau ñã ñược ñề xuất ñể cải tiến hiệu quả của NCBP nhưng cây xanh tái sinh tần số vẫn còn rất thấp ñặc biệt là các giống lúa thơm và giống lúa cao sản. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 5 Sơ ñồ ứng dựng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn Bao phấn hoặc hạt phấn ở giai ñoạn 1 nhân Xử lý lạnh Khử trùng Nuôi cấy Cây ñơn bội 1n Xử lý Colchicine Giống mới Mô sẹo ñơn bội 1n Tự lưỡng bội Cây lưỡng bội 2n Chọn dòng thuần tốt Dòng thuần Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 6 2.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trong công tác chọn giống, dòng ñồng hợp t ử ñóng vai trò quan trọng. ðể tạo ñược dòng dồng hợp tử, các nhà chọn giống phải mất 8 – 10 thế hệ mới tạo ra dòng ñồng hợp tử thông qua phương pháp tự thụ. ðể rút ngắn chu kỳ chọn tạo người ta ñã sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ñể nhanh chóng tạo ra dòng thuần và nhân nhanh các dòng phục vụ công tác chọn tạo giống. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn invitro kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây ñơn bội trong môi trường nuôi cấy bao phấn, hạt phấn sau ñó lưỡng bội hóa bằng Colchicine sẽ tạo ra cây lưỡng bội ñồng hợp tử tất cả các kiểu gen. ðây là công cụ hữu ích, cần thiết cho phát triển một giống mới, ñưa nhanh vật liệu di truyền ra thực tiễn. Các tác giả người Pháp E.Toulé và Y.Demarly (1998) cho rằng: bình quân con người tiết kiệm ñược 5 năm khi sử dụng kỹ thuật ñơn bội vào việc tạo giống mới. Cây lúa mỳ ñơn bội ñược phát hiện thấy ñầu tiên là con lai khác loài Triticum conpactum và Aegilops Cylindrica (Aase, 1926) [17]. Kể từ ñó, hiện tượng ñơn bội ñã ñược ghi nhận ở nhiều loài khác thuộc nhóm lúa mỳ: T.monococcum (Kihara và Kytajma, 1993), T.urgidum (Nakajima, 1935), T.Vulgare (Yamasaki, 1934) [17]. Năm 1964 Guha - Maheswari ñã tiến hành nuôi cấy bao phấn ở cà ñộc dược (Datura inoxia) và công trình này ñã thu ñược những kết quả ñầu tiên. Thành công này ñã khởi ñầu cho nhiều nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn, hạt phấn các loài thực vật. Tiếp sau ñó Nisch, 1967 tạo thành công cây thuốc lá ñơn bội từ NCBP thuốc lá (Nicotiana) [1]. Kỹ thuật NCBP lúa (Ozyza sativa) ñược Niizeki và Oono thực hiện thành công ñầu tiên vào năm 1968. ðến nay kỹ thuật này ñược ứng dụng rộng rãi ở nhiều nước: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…Các nhà khoa học IRRI, Triều Tiên, Ấn ðộ ñều kết luận các giống lúa thuộc loài phụ Japonica tạo cây Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 7 ñơn bội tốt hơn loài phụ Indica. Việc nghiên cứu về kỹ thuật ñược phát triển mạnh mẽ, ñến nay người ta ñã thu ñược nhiều tiến bộ mới. ðó là tìm ra ñược một số môi trường và ñiều kiện nuôi cấy thích hợp cho các loài phụ và giống khác nhau. Từ ñó rút ra ñược quy trình NCBP hoàn chỉnh làm tăng tần suất tái sinh cây xanh lên rất nhiều. Bên cạnh ñó nhiều nghiên cứu cơ bản về cơ chế di truyền, sự phát triển và phân hóa của hạt phấn nuôi cấy, sự phân hóa thành cây con và các nhân tố ảnh hưởng ñến hiệu quả nuôi cấy cũng ñạt nhiều thành tựu (Nguyễn Quang Thạch, 1997) [14]. Ngày nay, kỹ thuật ñơn bội ñược ứng dụng rất rộng rãi ở hầu hết các nước có công nghệ chọn tạo giống trên thế giới. Ở Trung Quốc ñã có hàng chục ha lúa trồng các giống tạo ra bằng phương pháp NCBP (Niizeki, 1999; ðỗ Năng Vịnh, 2002) [37] [20]. Riêng ñối với lúa ñã có trên 100 giống thuần ñược tạo ra ở Trung Quốc thông qua NCBP ñó là: Huayu - 1, Huayu - 2, Tanfong 1, Xin Xiu, Zhong Hua 8, Zhong Hua 9, và các giống này ñồng thời cũng ñược chuyển gen Pi - zt chống ñạo ôn. Giống Huayu - 1 có năng suất cao, chống bệnh bạc lá và có khả năng thích ứng rộng. Giống Xin Xiu ñược trồng trên 10000ha ở phía ñông Trung Quốc (trích theo Phan Hữu Tôn, 2005) [17]. Tại Triều Tiên, bằng kỹ thuật NCBP ñã tạo ra 42 giống lúa mới (Zapata & cs, 1986) [35]. Lee & cs 1989 ñã tạo ra giống lúa thuộc loài phụ Japonica là Hwacheongbyco thông qua NCBP cây F1 của tổ hợp lai giữa Suweon 298 với Milyang 64. Giống này chống ñược rầy nâu, ñạo ôn, bạc lá lúa và trồng ở vùng ñồng bằng và vùng biển Tây Nam Triều Tiên (Phan Hữu Tôn, 2005) [17]. Tại Mĩ với chiến lược chọn tạo giống lúa hạt dài cho miền Nam bằng NCBP lúa, hàng năm họ ñã tạo ra ñược trên 8000 dòng thuần ñơn bội kép từ NCBP các cây F1 (Chu & cs, 1985) [29]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 8 Ở Nhật những giống cây trồng mới cũng ñược tạo ra từ quá trình nuôi cấy bao phấn (Li & cs, 1984) [34]. 2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở nước ta, việc nghiên cứu NCBP ñã ñược tiến hành từ những năm 1976 nhưng việc ứng dụng vào thực tế chọn giống còn rất hạn chế do chưa ñược quan tâm, ñầu tư. Hiện nay, kỹ thuật NCBP lúa ñã, ñang ñược nghiên cứu ở nhiều cơ quan nghiên cứu và bước ñầu ñã thu ñược những kết quả ñáng khích lệ. NCBP ngày càng ñược sử dụng rộng rãi trong chọn tạo giống do chọn tạo nhanh các dòng ñơn bội thuần, rút ngắn thời gian tạo ra một giống mới so với phương pháp truyền thống. Theo công bố của Viện Công nghệ Sinh học, ñã tạo ra ñược 23 dòng ñồng hợp tử từ các giống lúa lai, trong ñó có 2 dòng A12 và A17 có nhiều ñặc tính tốt. Hai dòng này ñã ñược ñưa vào trồng với diện tích lớn tại Hải Phòng và Thái Bình vụ xuân năm 1990-1991 [6]. Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp NCBP với chọn dòng biến dị ñã tạo ra 50 dòng bất dục ñực nhân mẫn cảm với nhiệt ñộ (TGMS) mới, và tạo ra 12 dòng thuần có ưu thế lai tương ñương con lai F1 là DT 26, DT 29, J1, AC 24 (ðỗ Năng Vịnh, 2002) [120]. Thử nghiệm môi trường NCBP của 14 giống lúa, Nguyễn Thị Thanh Huyền và cộng tác viên năm 2002 ñã xác ñịnh nguồn cacbon thích hợp cho môi trường tạo mô sẹo từ túi phấn lúa là ñường lactoza và saccharose, trong ñó ñường saccharose không những làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo mà còn cải thiện rất rõ tỷ lệ tái sinh cây xanh. Nuôi cấy bao phấn lúa F3 tổ hợp lai P4/CS 94 (Nguyễn Tấn Hinh & cs, 1999) cũng ñã tạo thành công giống AC2 và ñang ñưa khảo nghiệm tại Viện cây lương thực và cây thực phẩm [7]. Nuôi cấy bao phấn các giống lúa thuần còn nhằm cải thiện một số ñặc tính nông học hay phẩm chất cũng là phương pháp ñang ñược áp dụng tại Viện cây lương thực và thực phẩm. Nguyễn Tấn Hinh & cs (1997) ñã tạo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9 ñược giống AC1 từ nuôi cấy bao phấn cải thiện ñược ñặc tính dễ rụng hạt của giống lúa gốc là C70. Các giống lúa ñặc sản vùng ðồng bằng Sông Hồng có phẩm chất cao và các giống lúa có hàm lượng protein cao cũng ñã ñược nuôi cấy bao phấn và tạo ñược các dòng triển vọng như: TXD 12-1, 1XD12-2, NX1 và một số dòng giàu protein như P3 -3, P3 -5, P5- 11…có ñặc tính ưu việt hơn giống lúa gốc. Cũng bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn con lai F5, các nhà khoa học Viện Cây lương thực ñã tạo ra giống AC5, ñây là giống lúa thơm chất lượng cao và khả năng chịu ngập rất tốt. Bộ môn Công nghệ sinh học cây trồng, Viện cây lương thực, thực phẩm Gia Lộc - Hải Dương ñã nghiên cứu và thu ñược nhiều dòng tốt từ phương pháp này khi kết hợp lai và nuôi cấy bao phấn kết hợp gây ñột biến và cấy bao phấn, ñồng thời bộ môn cũng ñã có chương trình chọn tạo giống lúa mới có năng suất cao, chống chịu tốt, thời gian sinh trưởng ngắn, có chất lượng thương phẩm, dinh dưỡng cao (Nguyễn Mạnh ðôn, Huỳnh Yên Nghĩa, 2000) [5]. Kết hợp với chỉ thị phân tử với nuôi cấy mô bao phấn, các nhà khoa học ñã quy tụ ñược nhiều gen quý vào một giống. Nguyễn Hoàng và cs ñã quy tụ ñược 4 gen kháng bệnh bạc lá lúa là Xa4, Xa5, Xa13 và Xa 21 vào dòng IRBB60-2 và nhiều dòng mang 2-3 gen kháng bạc lá lúa. Hitalmania và cs ñã quy tụ ñược 3 gen kháng ñạo ôn chính là Pi1, Pi2-5 và Pita vào giống kháng ñạo ôn bèn vững ở lúa tạo dòng mẹ TGMS ổn ñịnh và chống chịu cao với ñiều kiện hiện nay [11]. Võ Minh Tuyển (2002) ñã sử dụng hai loại môi trường MS và N6 ñể nuôi cấy bao phấn lúa của bao tổ hợp lai TH1 (TGMS-VN7/AC2), TH2 (TGMSVN7/BOB), TH3 (TGMS-VN7/253) tạo dòng TGMS mới có ñộ thuần cao và xác ñịnh ñược ngưỡng nhiệt ñộ chuyển hóa của các dòng TGMS mới [18]. Lê Hùng Lĩnh và Hồ Hữu Nhị ñã chọn lọc ñược 3 dòng TGMS mới là Bio MS2, Bio MS7, Bio MS10 là những dòng có ñộ bất dục cao (98,8% ñến 100%) và có nhiều ñặc tính nông sinh học tốt khi nuôi cấy tổ hợp lai Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 10