Tài liệu Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen kháng virus xoăn vàng lá cho giống cà chua dm166

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------------
------------------ NGUYỄN HỒNG ÁNH NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ CHO GIỐNG CÀ CHUA DM166 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------------
------------------ NGUYỄN HỒNG ÁNH NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ CHO GIỐNG CÀ CHUA DM166 CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH 2. TS. ðẶNG THỊ VÂN HÀ NỘI – 2013 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng và công bố trong các luận văn, luận án và các công trình khoa học nào trước ñây. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn ñược sử dụng trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc, ñảm bảo trích dẫn theo ñúng quy ñịnh. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam ñoan này ! Tác giả Nguyễn Hồng Ánh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch Bộ môn CNSH- Trường ðH Nông nghiệp Hà Nội và TS. ðặng Thị Vân- Bộ môn CNSH, Viện Nghiên cứu Rau Quả Việt Nam ñã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Em xin ñược gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học –Trường ðH Nông Lâm Bắc Giang ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình cùng bạn bè, những người ñã luôn quan tâm ủng hộ và là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian em làm luận văn này. Xin trân trọng cám ơn! Bắc Giang, ngày 22 tháng 8 năm 2013 Học viên Nguyễn Hồng Ánh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix MỞ ðẦU 1 1 ðặt vấn ñề 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2 3 Yêu cầu 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Vài nét về cà chua 3 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây cà chua 3 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng. 3 1.1.3 Giá trị kinh tế 4 1.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu cà chua trên thế giới 5 1.2.1 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới 5 1.2.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trên thế giới 7 1.3 Tình hình sản xuất và nghiên cứu cà chua tại Việt Nam 11 1.3.1 Tình hình sản xuất cà chua tại Việt Nam 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ở Việt Nam 12 1.4 Thực trạng nhiễm bệnh xoăn vàng lá ở cà chua 15 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng RNAi trong tạo giống cây chuyển gen 17 1.5.1 Trên thế giới 17 1.5.2 Ở Việt Nam 18 1.6 Cơ chế ñề kháng vi rút của cây cà chua chuyển gen 19 1.7 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 21 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 1.7.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 21 1.7.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 21 1.7.3 Cấu trúc và chức năng của các ñoạn T-DNA 22 1.7.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 23 1.7.5 Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật 24 1.7.6 Các phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.8 26 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 28 1.8.1 Vector nhị thể 28 1.8.2 Hệ vector liên hợp 29 1.9 Các phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen ngoại lai trong cây chuyển gen 30 1.9.1 Kiểm tra sự hiện diện của gen ngoại lai 30 1.9.2 Kiểm tra ở mức ñộ phiên mã 33 1.9.3 Kiểm tra ở mức ñộ dịch mã 34 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị thí nghiệm 36 2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phát hiện cây chuyển gen bằng PCR 40 2.3.2 Chọn lọc cây chuyển gen ñộc lập bằng kỹ thuật Southern 42 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THAỎ LUẬN 3.1 46 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ các loại vật liệu khác nhau 46 3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá mầm 46 3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ thân mầm 47 3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá trưởng thành Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 48 v 3.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp Zeatin và IAA ñến khả năng tái sinh chồi từ callus 3.2 50 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin và IAA ñến sự ra rễ của chồi cây cà chua nuôi cấy mô. 52 3.3 Kết quả ñánh giá sự ổn ñịnh ñộ bội của thể tái sinh 53 3.4 Tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào giống cà chua DM166 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.4.1 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn (OD600nm) ñến tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen Gus 3.4.2 55 55 Ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) ñến tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen Gus 57 3.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới hiệu quả chuyển gen 58 3.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ trong quá trình ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 3.4.5 59 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường lây nhiễm và trong môi trường ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 60 3.4.6 Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống cà chua DM166 60 3.5 Phân tích và ñánh giá cây chuyển gen 61 3.5.1 Tách DNA từ lá cây cà chua chuyển gen 62 3.5.2 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng PCR 62 3.5.3 Kết quả chọn lọc cây cà chua chuyển gen bằng lai Southern 66 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 1 Kết luận 70 2 Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 75 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) DNA : Deoxiribonucleic Acid FAO : Food and Agriculture Organization Gus : β-1,4-Glucuronidase IAA : β – Indol acid acetic NAA : Napthalene acetic acid PCR : Polymerase Chain Reaction Ti-plasmid : Tumor-Plasmid T-DNA : Transfer-DNA Vir : virulence Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Thành phần quả cà chua (trong 100g ăn ñược) 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua của các châu lục trên thế giới 4 năm 2011 6 1.3 Những nước có sản lượng cà chua cao nhất năm 2010 6 1.4 Những nước có giá trị nhập khẩu cà chua lớn nhất thế giới năm 2008 7 1.5 Diện tích, năng suất, sản lượng cà chua của Việt Nam 11 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 36 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá mầm 46 3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ thân mầm (sau 4 tuần nuôi cấy). 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá trưởng thành (sau 4 tuần nuôi cấy) 3.4 47 49 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp Zeatin và IAA ñến khả năng tái sinh chồi từ callus (theo dõi sau 6 tuần). 51 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ Zeatin và IAA ñến hiệu quả ra rễ 53 3.6 ðánh giá ñặc ñiểm hình thái và mức bội thể của cây tái sinh trước khi ra vườn ươm 3.7 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn tới tần số biểu hiện tạm thời của gen Gus ở giống cà chua DM166. 3.8 54 56 Ảnh hưởng của hàm lượng AS (Acetosyringone) ñến sự biểu hiện tạm thời của gen Gus. 57 3.9 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới hiệu quả chuyển gen 58 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ trong quá trình ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 3.11 59 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường lây nhiễm và trong môi trường ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 60 3.12 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng PCR 64 3.13 Kết quả lai Southern với mẫu dò 35S 68 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Bản ñồ Ti-plasmid dạng octopin 1.2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển T 22 - DNA 25 1.3 Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp 30 3.1 ðồ thị ñánh giá ảnh hưởng của sự phối hợp nồng ñộ IAA và Zeatin tới khả năng tạo callus ñối với lá mầm, thân mầm và lá trưởng thành 50 3.2 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm ADN tổng số 62 3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra sự hiện diện promoter 35S của một số mẫu cà chua chuyển gen 3.4 63 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm khuyếch ñại trình tự mục tiêu của một số mẫu cà chua chuyển gen 63 3.5 Hình ảnh ñiện di kiểm tra sản phẩm enzyme cắt giới hạn 66 3.6 Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một số dòng cà chua chuyển gen 3.7 67 Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một số dòng cà chua chuyển gen Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 67 ix MỞ ðẦU 1. ðặt vấn ñề Cà chua là thực phẩm quan trọng trong ñời sống thường ngày của con người. ðây là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, dễ trồng, vốn chi phí ban ñầu thấp, có thể mở rộng sản xuất ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau. Nhu cầu tiêu thụ cà chua ở nước ta rất lớn và nhu cầu ngày càng tăng vì cà chua là loại rau quả có giá trị dinh dưỡng cao, trong quả cà chua có chứa nhiều loại vitamin như: A, B, C, PP, K… và các chất khoáng như: Ca, Fe, P,S, Na, K, Mg và ñường. Mặt khác, cà chua là loại thực phẩm dễ chế biến và sử dụng, có thể dùng ăn tươi, nấu, chế biến thành cà chua khô, cà chua bột, tương cà chua, …Bên cạnh ñó, cà chua còn là mặt hàng xuất khẩu có triển vọng vì sản phẩm cà chua ở nước ta ñược thu hoạch vào thời ñiểm nhiều nước không trồng ñược trong mùa ñông lạnh (Trần Khắc Thi, 2005) [20 ]. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng cà chua phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong ñó bệnh hại là yếu tố rất quan trọng, ñặc biệt là những bệnh gây ra do nấm, vi khuẩn, virus. Chúng gây hại từ giai ñoạn cây con trong vườn ươm, giai ñoạn trồng ngoài sản xuất cho ñến khi thu hoạch (Chu Thị Thơm và cs, 2006) [ 1]. Bệnh hại cà chua làm giảm năng suất khiến người nông dân phải dùng nhiều loại thuốc phòng trừ sâu bệnh với liều lượng cao,làm ô nhiễm môi trường và sản phẩm, gây ngộ ñộc cho người tiêu dùng do tồn dư thuốc hóa học bảo vệ thực vật trong sản phẩm. Bên cạnh ñó, với năng suất trung bình 14 tấn/ha, sản lượng cà chua hàng năm trên cả nước còn rất khiêm tốn ( 100 ngàn tấn) mới chỉ ñảm bảo cho bình quân ñầu người hơn 1kg/năm (Trần Khắc Thi, 2005) [ 20]. Vì vậy, việc tạo ra những giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, năng suất cao và chất lượng tốt là rất cần thiết. Trước ñây, muốn tạo ra một giống cây trồng mới, người ta ñã phải lai tạo, chọn lọc qua nhiều thế hệ nhưng không phải tất cả ñều tạo ñược giống cây mang ñược các ñặc tính như mong muốn. Ngày nay, công nghệ gen ñã giúp cho việc chuyển gen ưu việt vào cây trồng Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 ñược nhanh chóng và hiệu quả hơn (Trương Thị Bích Phượng và cs, 2003) [19 ]. Việc nghiên cứu chuyển gen trên cây cà chua ñã ñược nghiên cứu rất sớm trong lịch sử nghiên cứu cây chuyển gen, ñồng thời nhiều nghiên cứu ñã rất thành công, vật liệu cây cà chua tạo ra bằng phương pháp chuyển gen ñã ñược phát triển thành giống thương mại. Tuy nhiên, kết quả các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng hiệu quả chuyển gen vào cây cà chua phụ thuộc rất nhiều vào giống (genotyp dependent).ðề tài: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong tạo giống kháng virus xoăn vàng cà chua cho Việt Nam ñược tiến hành trên một số giống (FM372C, DM166, M88).Trong ñó ñã xây dựng ñược quy trình chuyển gen cho giống FM372C và áp dụng có hiệu quả.Việc nghiên cứu qui trình chuyển gen cho hai giống cà chua còn lại DM166 và M88 là cần thiết.. Trên cơ sở quy trình chuyển gen của giống FM372C chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài:“ Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống cà chua DM166.’’ 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu nhằm xác ñịnh ñược quy trình chuyển gen phù hợp cho giống DM166. 3. Yêu cầu - Thiết lập ñược hệ thống tái sinh từ các loại mô nuôi cấy (thân mầm, lá mầm, lá trưởng thành) khác nhau của giống DM166. - ðánh giá ñược mức ổn ñịnh di truyền của cây in vitro tái sinh từ 3 loại vật liệu nuôi cấy. - Xác ñịnh ñược các thông số cơ bản ñể hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống DM166. 4. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho các giai ñoạn nghiên cứu khoa học tiếp theo trong việc tạo dòng cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá. 5. Ý nghĩa thực tiễn Các kết quả nghiên cứu phục vụ việc chọn tạo giống cà chua có khả năng kháng bệnh vi rút xoăn vàng lá góp phần tạo giống mang giá trị kinh tế cao. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét về cà chua 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây cà chua Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia, Ecuado. Trước khi tìm thấy ở Châu Mỹ thì cà chua ñược trồng ở Peru và Mehico. Những loài cà chua hoang dại gần với loài cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Peru), ñảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia. Các nhà vường ñã trồng, thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại. Những giống và loài hoang dại này ñược mang từ nơi xuất xứ ñến Trung Mỹ, rồi ñến Mehico (Tạ Thu Cúc, 2002) [16]. ðến ñầu thế kỷ XVIII, các giống cà chua ñã trở nên phong phú và ña dạng hơn, nhiều vùng ñã trồng cà chua làm thực phẩm. Vào thế kỷ XIX (1830) quả cà chua ñã trở thành thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày. Cuối thế kỷ XIX, trên 200 dòng, giống cà chua ñược giới thiệu một cách rộng rãi trên thế giới (Tạ Thu Cúc, 2002) [16]. Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phần lớp bạc hà (Lanmiidae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), có tên khoa học là Solanum Lycopersicum (tên gọi cũ là Lycopersicum esculentum L.). Ngoài ra cà chua có nhiều tên gọi khác nhau như Lycopersicum esculentum Mill, L. Lyccopersion, S.lycopersicon, L.kort....( Trần Khắc Thi, 2005) [20]. Từ lâu ñã có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và lập thành hệ thống phân loại theo quan ñiểm của mình. Theo Muller (1940) thì loài cà chua trồng hiện nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller. Tác giả phân loại chi phụ này thành 7 loài, loài cà chua trồng hiện nay (Lycoprsion esculentum L.) thuộc chi phụ thứ nhất ( Tạ Thị Cúc, 2002) [16]. 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng. Trong cà chua có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho cơ thể như Carotene, lycopene, vitamin và kali. Tất cả những chất này ñều rất có lợi cho sức khoẻ con người. ðặc biệt các loại vitamin B, vitamin C và β-carotene giúp chống lại quá trình oxy hoá của cơ thể, giảm thiểu nguy cơ tử vong do bệnh tim mạch và ung thư. Hàm lượng vitamin A thiên nhiên trong cà chua cao, trung bình chỉ cần 100g cà chua Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 3 chín còn tươi sẽ ñáp ứng ñược 13% nhu cầu hằng ngày về vitamin A, cũng như các vitamin B6, vitamin C. Ngoài ra còn có các vitamin B1, B2, PP... Các chất khoáng vi lượng có trong cà chua như: canxi, sắt, kali, photpho, magnesium, lưu huỳnh, nickel, cobalt, iốt, các axít hữu cơ dưới dạng muối citrat và tuỳ theo môi trường trồng, trong cà chua có thể có cả ñồng, molibden. Chính nhờ các yếu tố này, cà chua ñược coi là một thức ăn giàu chất dinh dưỡng, dễ tiêu hoá, tăng cường sức ñề kháng của cơ thể. Bảng 1.1. Thành phần quả cà chua (trong 100g ăn ñược). Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng ðộ ẩm 93,1g Vitamin A 320 I.U Protein 1,9g Thiamin 0,07mg Chất béo 0,1g Riboflavin 0,01mg Chất khoáng 0,6g Axít nicotinic 0,4mg Cabohydrat 3,6g Vitamin C 31mg Na 45,8mg Ca 20mg K 114mg Mn 15mg Cu 0,19mg Axít oxalic 2mg S 24mg P 36mg Clo 38mg Fe 1,8mg Nguồn: http:// www. dinhduong.com.vn/story/dinh-duong-tu-trai-ca-chua[58] 1.1.3. Giá trị kinh tế Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng và có nhiều cách sử dụng. Có thể dùng ăn tươi thay hoa quả, trộn Salat, nấu canh, xào, nấu sốt vang và cũng có thế chế biến thành các sản phẩm như cà chua cô ñặc, tương cà chua, nước sốt nấm, cà chua ñóng hộp, mứt hay nước ép. Ngoài ra, có thể chiết tách hạt cà chua ñể lấy dầu. Quả cà chua vừa có thể dùng ñể ăn tươi, nấu nướng vừa là nguyên liệu cho chế biến công nghiệp với các loại sản phẩm khác nhau. Do ñó, với nhiều nước trên thế giới thì cây cà chua là một cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế rất cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 4 Theo FAO (1999) ðài Loan hằng năm xuất khẩu cà chua tươi với tổng trị giá là 952.000 USD và 48.000 USD cà chua chế biến. Lượng cà chua trao ñổi trên thị trường thế giới năm 1999 là 36,7 tấn trong ñó cà chua ñược dùng ở dạng ăn tươi chỉ 5-7%. Ở Mỹ (1997) tổng giá trị sản xuất 1ha cà chua cao hơn gấp 4 lần so với lúa nước, 20 lần so với lúa mì [16]. Cà chua là một trong những mặt hàng có giá trị xuất khẩu cao kể cả dạng tươi và dạng chế biến. Lượng cà chua trao ñổi trên thị trường quốc tế là 32,7 triệu tấn, trong ñó 10% ở dạng quả tươi. Ở Việt Nam cà chua ñược trồng trên 100 năm nay, diện tích gieo trồng cà chua hàng năm biến ñộng từ 15 – 17 ngàn ha, sản lượng 280 ngàn tấn. Mức tiêu thụ bình quân ñầu người của nước ta là: 3 kg/người/năm [16]. Tại khu vực ðồng bằng sông Hồng sản xuất cà chua cho thu nhập bình quân 42 - 68,4 triệu ñồng/ha/vụ, lãi thuần ñạt 15-26 triệu ñồng, cao hơn nhiều so với trồng lúa. Trồng lúa chỉ giải quyết 230-250 công lao ñộng, trong ñó trồng cà chua giải quyết ñược 1100 - 1200 công lao ñộng. Theo ðề án phát triển rau – quả và hoa cây cảnh thời kỳ 1999-2010 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn cà chua là mặt hàng chủ yếu ñược quan tâm phát triển. Năm 2005 diện tích trồng cà chua sẽ là 2000ha. Với sản lượng 80.000 tấn, cho giá trị xuất khẩu là 10 triệu USD; năm 2010 diện tích tăng lên 6000ha, tổng sản lượng ñạt 240.000 tấn, cho giá trị xuất khẩu là 100 triệu. 1.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu cà chua trên thế giới 1.2.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới Cà chua là loại cây trồng tuy ñược chấp nhận như một loại thực phẩm và có lịch sử phát triển tương ñối muộn nhưng do nó có khả năng thích ứng rộng và hiệu quả kinh tế và giá trị sử dụng cao. Trên thế giới ñã có nhiều giống mới ñược ra ñời nhằm ñáp ứng ñược nhu cầu ngày càng cao của con người cả về số lượng và chất lượng. Theo FAO (1999), trên thế giới có 158 nước trồng cà chua. Diện tích, sản lượng, năng suất cà chua trên thế giới như sau: Theo FAO, 2009: Diện tích: 4.980,42 (1000 ha) Năng suất: 2030,63 (tạ/ha) Sản lượng: 141400,63 (1000 tấn) Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 5 Bảng 1.2: Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua của các châu lục trên thế giới năm 2011 Tên châu lục Diện tích (1000 ha) Năng suất ( tấn/ha) Sản lượng (1000 tấn) Châu Phi 860,74 20,02 17236,03 Châu Mỹ Châu Á 479,07 2436,49 50,86 33,58 24365,66 81812,01 Châu Âu Châu Úc 553,4 9,13 39,32 63,28 21760,15 577,6621 Nguồn: FAO Database Static 2011[32] Trong 10 năm từ năm 2001 ñến năm 2010 diện tích cà chua thế giới tăng 1,09 lần từ 3990,3 nhìn ha lên 4338,83 nghìn ha, sản lượng tăng 1,35 lần từ 107977,76 nghìn tấn lên 145751,83 nghìn tấn, trong khi năng xuất không có sự thay ñổi ñáng kể. Theo bảng trên thì năm 2010, châu Á có diện tích trồng cà chua và sản lượng cà chua lớn nhất thế giới. Tuy nhiên châu Úc và châu Mỹ có năng suất lớn nhất. Khoảng 150 triệu tấn cà chua ñã ñược sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn ðộ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới. ðến các năm sau ñó tới nay Trung Quốc vẫn ñứng ñầu trong sản xuất cà chua. Bảng 1.3: Những nước có sản lượng cà chua cao nhất năm 2010 STT Tên nước Sản lượng 1 2 Trung Quốc Mỹ 41879,68 12902,00 3 4 Ấn ðộ Thổ Nhĩ Kì 11979,7 10052,00 5 Ai Cập 8544,99 6 7 8 Italia Iran Tây Ban Nha 6024,8 5256,11 4312,70 9 10 Brazil Nga 3691,32 2000,00 Nguồn: FAO Database Static 2011[32] Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 6 Cà chua là loại rau cho hiệu quả kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước ở cả dạng ăn tươi và chế biến. ðứng ñầu về tiêu thụ cà chua là nước Mỹ, sau ñó là các nước châu Âu. Lượng cà chua trao ñổi trên thị trường thế giới năm 1999 là 36,7 triệu tấn, trong ñó cà chua dùng ở dạng ăn tươi chỉ chiếm 5-7%. ðiều ñó cho thấy, cà chua ñược sử dụng chủ yếu ở dạng ñã qua chế biến. Bảng 1.4: Những nước có giá trị nhập khẩu cà chua lớn nhất thế giới năm 2008 STT Tên nước Sản lượng Giá trị (tấn) (1000$) $/tấn 1 Mỹ 1116340 1431590 12823,96 2 Nga 673894 628923 9332,67 3 ðức 654966 1293840 19754,31 4 Pháp 482546 559936 11603,78 5 Anh 419045 745788 17797,32 6 Canada 193279 276433 14300,95 7 Tây Ban Nha 189391 79044 4175,175 8 Hà Lan 156280 285068 18240,850 9 Irắc 112129 61441 5479,492 10 A-rập 103498 58049 5608,707 Nguồn: FAO Database Static 2009 Cà chua chế biến ñược sản xuất ở nhiều nước trên thế giới nhưng nhiều nhất là ở Mỹ và Italia. Ở Mỹ, năm 2002 sản lượng nhiều nhất ước ñạt 10,1 triệu tấn. Trong ñó các sản phẩm cà chua chế biến chủ yếu là cà chua cô ñặc. Ở Italia, sản lượng cà chua chế biến ước tính ñạt ñược là 4,7 triệu tấn. Ở Châu Á, ðài Loan là một trong những nước có nền công nghiệp chế biến cà chua sớm nhất. Ngay từ 1918, ðài Loan ñã phát triển cà chua ñóng hộp. Năm 1967, họ mới chỉ có một công ty chế biến cà chua. ðến năm 1976, họ ñã có tới 50 nhà máy sản xuất cà chua ñóng hộp. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trên thế giới Trong khoảng 200 năm trở lại ñây tình hình chọn tạo cà chua trên thế giới ñã có nhiều tiến bộ. Lịch sử nghiên cứu chọn tạo cà chua trên thế giới bắt ñầu ở châu Âu. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 7 Người Italia là những người ñầu tiên phát triển các giống cà chua mới, họ chọn các giống có sự khác nhau về tính trạng quả, chủ yếu là màu sắc quả. Thế kỷ 20 ñã ñánh dấu những bước tiến to lớn trong công tác chọn tạo giống cà chua. Việc cải tiến năng suất, chất lượng luôn là hai mục tiêu hàng ñầu và chung cho tất cả các chương trình chọn tạo giống. Trước năm 1925, việc cải tiến giống cà chua ñược thực hiện bằng cách chọn các kiểu gen ngay từ bản thân các giống - từ các ñột biến tự nhiên, lai tự do hoặc tái tổ hợp của các biến thể di truyền ñang tồn tại trong tự nhiên (theo Tigchelaar E.C, 1986) [50]. Lịch sử công tác chọn tạo giống cà chua trên thế giới bắt ñầu ở Châu Âu với những tiến bộ ban ñầu về dòng, giống. Năm 1860 những giống cà chua mới ñã ñược giới thiệu ở Mỹ. Năm 1863, 23 giống cà chua ñược giới thiệu trong ñó giống Trophy ñược coi là giống có chất lượng tốt nhất. Chương trình thử nghiệm của Liberti Hyde Bailey tại trường nông nghiệp Michigan (Mỹ) bắt ñầu từ năm 1886, tác giả ñã tiến hành chọn lọc, phân loại giống cà chua trồng trọt. Từ năm 1870 ñến 1893, A.W.Livingston ñã giới thiệu 13 giống cà chua trồng trọt ñược giới thiệu theo phương pháp chọn lọc cá thể. Cuối thế kỷ XIX có trên 200 dòng, giống cà chua ñã ñược giới thiệu rộng rãi (Tạ Thị Cúc, Hồ Hữu An, Nghiêm Thị Bích Hà (2000) [19]. Nhiều công trình nghiên cứu của trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á (AVRDC) cho thấy những giống cà chua chọn tạo trong ñiều kiện ôn ñới không thích hợp với ñiều kiện nóng ẩm vì sẽ tạo những quả kém chất lượng như có màu ñỏ nhạt, nứt quả, vị nhạt hoặc chua…(Kuo và cs, 1998) [40] Theo ý kiến của Anpachev (1978), Iorganov (1971), Phiên Kì Mạnh (1961) (Kiều Thị Thư, 2006), [18] thì xu hướng chọn tạo giống cà chua mới là: + Tạo giống chín sớm phục vụ cho sản xuất vụ sớm. + Tạo giống cho sản lượng cao, giá trị sinh học cao, dùng làm rau tươi và nguyên liệu cho chế biến ñồ hộp. + Tạo giống chín ñồng loạt thích hợp cho cơ giới hóa. + Tạo giống chống chịu sâu bệnh Các nhà chọn tạo giống trên thế giới ñã sử dụng nguồn gen của các loài hoang dại làm nguồn gen chống chịu với các ñiều kiện bất thuận bằng nhiều con ñường khác Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 8 nhau như lai tạo, chọn lọc giao tử, hợp tử, ñột biến nhân tạo…bước ñầu ñã thu ñược những thành công nhất ñịnh. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á từ những ngày ñầu thành lập (1972) ñã bắt ñầu chương trình chọn tạo nhằm tăng cường khả năng thích ứng của cà chua với vùng ñiều kiện nóng ẩm. Và hầu hết các giống AVRDC lai tạo và các giống ñã ñược cải thiện trong tập ñoàn từ năm 1974 ñến nay ñều có khả năng chịu nhiệt cũng như chống chịu sâu bệnh tốt. Viện nghiên cứu và phát triển nông nghiệp Malaysia (MARDI) ñã phối hợp với AVRDC và trung tâm nghiên cứu nông nghiệp nhiệt ñới (TARC) ở Nhật Bản ñể xúc tiến chương trình cải tiến giống cà chua triển vọng. ðã chọn ñược 6 dòng có khả năng chịu nhiệt và chống chịu vi khuẩn: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT10 Nhiều thử nghiệm về các giống cà chua ñược tiến hành ở AVRDC- TOP, trường ñại học Kasestart, phân viện Kamphaeng Thái Lan chọn tạo nhiều giống ñược ñánh giá là chất lượng tốt kết hợp với tính chịu nóng, năng suất cao và chống bệnh cụ thể là các giống cà chua anh ñào CHT104, CHT92, CHT105 có năng suất cao, chống chịu bệnh tốt, màu sắc quả ñẹp, hương vị ngon, quả chắc.Các giống PT225, PT3027, PT4165, PT446, PT4121 cho năng suất cao, chất lượng tốt, chống bệnh và chống nứt quả. Nhiều nghiên cứu thử nghiệm giống cà chua quả nhỏ ñã ñược tiến hành ở AVRDC-TOP, Trường ðại học Kaset sart, phân viện Kamphaeng, Thái Lan. Trong ñó có nhiều mẫu giống ñược ñánh giá có chất lượng tốt kết hợp với ñặc tính chịu nóng, năng suất cao và chống chịu bệnh như: các giống lai cà chua Anh ñào CHT104, CHT92, CHT105… [40]. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á còn phát triển chương trình về các dòng tự phối hữu hạn và vô hạn có khả năng ñậu quả cho phép ở giới hạn nhiệt ñộ cực ñại 32-340C và cực tiểu 22-240C ñã ñưa ñược nhiều giống lai có triển vọng, ñược phát triển ở một số nước nhiệt ñới như CLN 161L, CLN 2001C, CL5915-204DH, CL143…(Morris, 1998) [42]. Chương trình chọn giống cà chua trường ðại học Florida ñược bắtñầu từ năm 1925. Một loạt các giống mới năng suất, chất lượng ñược ñưa ra như Tropic, Walter, Florida MH-1, Florañae, Floramerica…(Nature, 1982). Từ năm 1979 ñến 1984 Ai Cập Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 9 ñã tiến hành công trình nghiên cứu nhằm tăng năng suất và nâng cao chất lượng cà chua (ñây là một phần của ñề án cấp quốc gia). Các giống ñã ñược ñánh giá trồng ở các ñịa phương hầu hết nhập từ Mỹ như Housney, Pritchard, VFN8,...ñều có những ưu ñiểm về năng suất và chất lượng. ðể cải tiến chất lượng cho giống cà chua, các nhà chọn giống ñã sử dụng các loài hoang dại và bán hoang dại làm nguồn vật liệu quý cho lai tạo. Ví dụ như loài L.peruvianum có hàm lượng vitamin C rất cao hay loài L. pimpinellifolium có hàm lượng ñường, vitamin C, f-caroten cao. Các giống cà chua lai của công ty giống lai Ấn ðộ-Mỹ ở Bangalore (Ấn ðộ) như Naveen, Karnatak, Jajani, Vaishali có năng suất cao, chất lượng quả tốt, quả tròn to trung bình, màu sắc ñẹp, rất thích hợp cho cả ăn tươi và chế biến (Met wally R.,1986) [41]. Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn ðộ (IARI) ở Newdeli ñã tiến hành nhiều nghiên cứu về chọn tạo các giống cà chua chịu nhiệt. Từ năm 1975, Viện ñã thành công với các giống như Puas Rugy, Sel.120... (Singh J.H. and Checma D.S., 1989) [47]. Trong chọn tạo giống cà chua, người ta chú ý nhiều ñến ưu thế lai. Ở Nhật Bản ưu thế lai ñược sử dụng rộng rãi trên cà chua từ năm 1930. Khi lai thử giữa giống Rutgres với 5 giống khác nhau cho thấy ưu thế lai về tổng trọng lượng quả cao hơn bố mẹ nhưng về số quả trên cây và trọng lượng quả phần lớn là trung gian giữa bố và mẹ (Kiều Thị Thư, 1998) [18]. Gần ñây, nhiều nước trên thế giới ñặc biệt là Mỹ, các nhà khoa học ñã tạo ra những giống cây trồng biến ñổi gen trong ñó có cà chua. Những giống cây trồng này ngoài khả năng chống chịu ñược sâu bệnh, tuyến trùng, khô hạn, sương muối mà còn có khả năng cất giữ bảo quản lâu, chất lượng cao, mang nhiều dược tính, năng suất cao. Các nhà nghiên cứu tại ñại học bang Oregon (Mỹ) ñang hoàn thiện một giống cà chua tím, ñây là một sự kết hợp giữa màu sắc và chất dinh dưỡng.Loại cà chua này có nguồn gốc từ dạng dại ở Nam Mỹ. Hàng trăm năm trước các nhà khoa học ñã phát hiện cà chua màu tím trong thiên nhiên nhưng loài cây này nhỏ và có ñộc. Vào thập niên 1960-1970, các nhà khoa học ñã thu nhặt hạt giống từ cà chua tím và lai với loài hiện ñại ñể cho ra loại quả an toàn với mọi người hơn dạng ban ñầu của nó. Hiện nay với nền khoa học kỹ thuật hiện ñại các nhà khoa học trên thế giới vẫn Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 10