Tài liệu Nghiên cứu hoàn thiện kít thử và quy trình tạo tiêu bản xác định sự phân mảnh dna tinh trùng người

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu hoàn thiện kít thử và quy trình tạo tiêu bản xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng người LÊ NGỌC TUỆ NHI [email protected] Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn PGS. TS. Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu hoàn thiện kít thử và quy trình tạo tiêu bản xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng người LÊ NGỌC TUỆ NHI [email protected] Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. Trương Quốc Phong Viện: Chữ ký của GVHD Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 2022 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên tác giả luận văn: Lê Ngọc Tuệ Nhi Đề tài luận văn: Nghiên cứu hoàn thiện kít thử và quy trình tạo tiêu bản xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng người Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số SV: 20202100M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 21 tháng 10 năm 2022 với các nội dung sau: 1. Bổ sung một số đặc điểm người tham gia vào nghiên cứu. 2. Mô tả nguyên tắc các phương pháp còn sơ sài, cần phải mô tả kỹ hơn. 3. Phương pháp nên mô tả thêm về xác định các đặc điểm của tinh trùng, các chỉ số phản ánh mức độ di động/bất thường như thế nào 4. Nên cân nhắc sử dụng “Bệnh nhân” hay “đối tượng”. Ngày Giáo viên hướng dẫn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG tháng năm 2022 Tác giả luận văn LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trương Quốc Phong đã luôn tận tình hướng dẫn, đồng hành cùng em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Em luôn luôn ghi nhớ và biết ơn các thầy, cô giáo trong viện công nghệ sinh học và thực phẩm đã luôn tận tình giảng dạy cho em trong suốt quá trình em học cao học. Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, các phòng ban chức năng của trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi tới lãnh đạo và toàn thể đồng nghiệp trong Trung tâm Hỗ trợ sinh sản và Nam học, Bệnh viện Sản Nhi tỉnh Phú Thọ lời cảm ơn chân thành vì đã luôn tạo điều kiện tốt về mọi mặt, và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong học tập cũng như công việc. Đặc biệt cảm ơn các bạn chuyên viên phôi đã luôn động viên và chia sẻ cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ vì đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên con những lúc khó khăn nhất, luôn định hướng cho con trong mỗi bước đi trong cuộc sống cũng như sự nghiệp. Cuối cùng, tất cả tình yêu thương xin dành cho gia đình bé nhỏ của tôi nguồn sức mạnh vô tận cho tôi vượt qua mọi khó khăn thử thách. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Học viên Lê Ngọc Tuệ Nhi LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn của tôi. Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành. Mọi dữ liệu, hình ảnh và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên. Hà Nội, ngày tháng Học viên Lê Ngọc Tuệ Nhi năm 2022 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VẼ ......................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vi LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 2 1. 1. Đặc điểm của tinh trùng người .................................................................. 2 1.1.1 Sự hình thành tinh trùng người .......................................................... 2 1.1.2. Hình thái và cấu trúc ......................................................................... 3 1.1.3. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng ..................................................... 4 1.2. Tình hình vô sinh ở nam giới ...................................................................... 6 1.2.1. Sơ lược vô sinh nam .......................................................................... 6 1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới ...................................................... 6 1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ .......................................................................... 7 1.3. Sự phân mảnh DNA tinh trùng người......................................................... 8 1.3.1. Khái niệm phân mảnh DNA tinh trùng ............................................. 8 1.3.2. Cơ chế gây phân mảnh DNA tinh trùng ............................................ 8 1.3.3. Nguyên nhân phân mảnh DNA tinh trùng người .............................. 9 1.4. Ảnh hưởng của sự phân mảnh DNA tinh trùng tới khả năng sinh sản của nam giới ............................................................................................................. 9 1.4.1. Mối liên quan giữa phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ....................................................................................................... 10 1.4.2. Mối liên quan giữa phân mảnh DNA tinh trùng và các đặc điểm lâm sàng............................................................................................................ 10 1.4.3. Liên quan giữa phân mảnh DNA tinh trùng đến khả năng thụ thai ........ 11 1.4.4. Liên quan giữa phân mảnh DNA tinh trùng đến giãn tĩnh mạch tinh ở nam giới ..................................................................................................... 12 1.4.5. Liên quan giữa phân mảnh DNA tinh trùng ở nam giới với sảy thai, thai lưu ....................................................................................................... 12 1.5. Các phương pháp xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng ...................... 13 1.5.1. Phương pháp COMET (Comet assays) ........................................... 13 1.5.2. Phương pháp SCSA (Sperm Chromatin structure) ......................... 13 1.5.3. Phương pháp TUNEL (Mediated dUDP nick end labelling) .......... 13 1.5.4. Phương pháp SCD (Sperm Chromatin Dispersion) ........................ 14 1.6. Kít Halosperm Tây Ban Nha [62] ............................................................. 15 1.6.1. Nguyên lý ..................................................................................... 15 1.6.2. Thành phần chính ......................................................................... 15 i 1.6.3. Quy trình thực hiện ...................................................................... 16 1.6.4. Nhận định kết quả ........................................................................ 16 1.7. Kít BK- Halosperm [63] ............................................................................ 17 1.7.1. Nguyên lý ..................................................................................... 17 1.7.2. 1.7.3. 1.7.4. Thành phần bộ kít ........................................................................ 17 Quy trình thực hiện ...................................................................... 17 Đọc kết quả .................................................................................. 18 1.7.5. Đánh giá bộ kít BK-HaloSperm................................................... 19 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................................................................. 20 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................ 20 2.1.1. Đối tượng ..................................................................................... 20 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 20 2.1.3. Thời gian nghiên cứu ................................................................... 20 2.1.4. Cỡ mẫu ......................................................................................... 21 2.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................... 21 2.2.1. Hóa chất .......................................................................................... 21 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................... 22 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 22 2.4. Quy trình nghiên cứu ................................................................................. 23 2.4.1. Xác định một số điều kiện thích hợp để chế tạo kít thử làm tiêu bản xác định mức độ phân mảnh của DNA tinh trùng .................................... 23 2.4.1.1. Xác định điều kiện cố định tinh trùng ........................................ 23 2.4.1.2. Xác định điều kiện biến tính DNA tinh trùng............................. 24 2.4.1.3. Xác định điều kiện ly giải nhân tinh trùng ................................. 24 2.4.1.4. Nhuộm tinh trùng ........................................................................ 24 2.4.1.6. Đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ phân DNA tinh trùng bằng kit BK-Halosperm và kit thương mại Halosperm Tây Ban Nha .................................................................................................................. 25 2.4.2. Đánh giá mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm lâm sàng và chỉ số tinh dịch đồ ........................................... 25 2.4.2.1. Đánh giá mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm lâm sàng .................................................................... 25 2.4.2.2. Đánh giá mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm tinh dịch đồ ............................................................... 25 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 25 2.6. Đạo đức nghiên cứu ................................................................................... 25 ii CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 26 3.1. Đặc điểm lâm sàng và các chỉ số tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu 26 3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu ................................ 26 3.1.2. Đặc điểm tinh dịch của đối tượng nghiên cứu ................................ 26 3.2. Hoàn thiện một số điều kiện thích hợp để chế tạo kít thử làm tiêu bản xác định mức độ phân mảnh của DNA tinh trùng người ....................................... 27 3.2.1. Nghiên cứu điều kiện cố định tinh trùng ......................................... 27 3.2.1.1. Nồng độ thạch agarose ................................................................ 27 3.2.1.2. Nồng độ thạch agarose phủ lam kính .......................................... 28 3.2.2. Xác định điều kiện biến tính DNA tinh trùng ................................. 30 3.2.3. Xác định điều kiện ly giải nhân tinh trùng ...................................... 31 3.2.4. Thiết lập kít và quy trình phân tích sự phân mảnh DNA tinh trùng ...... 33 3.2.4.1. Thành phần bộ kít........................................................................ 33 3.2.4.2. Quy trình xét nghiệm .................................................................. 34 3.2.5. Đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng bằng kít BK-Halosperm và kit thương mại halosperm Tây Ban Nha.... 35 3.3. Kết quả mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm lâm sàng và chỉ số tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ..................... 36 3.3.1. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm lâm sàng............................................................................................ 36 3.3.1.1. Mối tương quan giữa việc sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng............................................................................... 36 3.3.1.2. Mối tương quan giữa việc sử dụng rượu bia với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng............................................................................... 38 3.3.1.3. Mối tương quan giữa độ tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng .................................................................................................................. 39 3.3.2. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với chỉ số tinh dịch đồ ................................................................................................ 40 3.3.2.1. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thời gian kiêng xuất tinh .................................................................................. 40 3.3.2.2. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với độ pH của tinh dịch ....................................................................................... 41 3.3.2.3. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thể tích xuất tinh ............................................................................................. 41 3.3.2.4. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng .................................................................................................................. 42 iii 3.3.2.5. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh trùng ........................................................................................... 43 3.3.2.6. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh trùng .................................................................................................. 45 3.3.2.7. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh trùng .................................................................................................. 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 51 PHỤ LỤC 1.......................................................................................................... 62 iv DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1. 1. Sơ đồ các giai đoạn chính trong quá trình sinh tinh [3] ........................ 2 Hình 1. 2. Sự biến đổi tinh tử thành tinh trùng [3]................................................. 3 Hình 1. 3. Hình thái và cấu trúc tinh trùng (điều trị.vn) ........................................ 4 Hình 1. 4. Cấu trúc chromatin của tinh trùng [18] ................................................. 5 Hình 1. 5.Các cơ chế gây phân mảnh DNA tinh trùng [31] .................................. 8 Hình 1. 6. Hình ảnh tinh trùng sau nhuộm SCD .................................................. 14 Hình 2. 1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu ………………………...…..…....23 Hình 3. 1. Tinh trùng được cố định trên lam ở các nồng độ agarose khác nhau 1% (A), 2% (B), 3% (C) và 4% (C)………………………………. .. …………………...28 Hình 3. 2. Tinh trùng được cố định ở các nồng độ agarose trên lam kính khác nhau 0,3% (A), 0,5% (B), 0,7% (C) và 0,9% (C). ............................................... 29 Hình 3. 3. Biến tính DNA tinh trùng ở các nồng độ axit HCl khác nhau 0,05 N(A); 0,08 N(B); 0,1 N(C); 0,15 N(D) ................................................................ 31 Hình 3. 4. Thay đổi nồng độ DTT trong đệm ly giải nhân tinh trùng 100 mM (A), 50 mM (B) và 10 mM (C) .................................................................................... 33 Hình 3. 5. Hình ảnh tiêu bản đặc trưng nhuộm DNA tinh trùng sử dụng bộ kít BK-HaloSperm ..................................................................................................... 35 Hình 3. 6. Biểu đồ so sánh tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng giữa bộ kit thương mại Halosperm Tây Ban Nha và bộ kit BK-Halosperm ...................................... 36 Hình 3. 7. Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng .................................................................................................. 43 Hình 3. 8. Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh trùng .......................................................................................... 44 Hình 3. 9. Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh trùng ........................................................................................... 46 Hình 3. 10. Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh trùng ....................................................................................... 48 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [27] [28] .......................................... 7 Bảng 2. 2. Danh mục dụng cụ sử dụng cho nghiên cứu ........................................... 22 Bảng 2. 3 Danh mục thiết bị sử dụng cho nghiên cứu .............................................. 22 Bảng 3. 1. Đặc điểm lâm sàngcủa đối tượng nghiên cứu ......................................... 26 Bảng 3. 2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ................................... 26 Bảng 3. 3. Kết quả giữa các nồng độ thạch agarose ................................................. 27 Bảng 3. 4. Kết quả giữa các nồng độ thạch agarose phủ lam kính ........................... 29 Bảng 3. 5. Kết quả giữa các nồng độ axit HCl (N) ................................................... 30 Bảng 3. 6. Kết quả giữa các nồng độ DTT (mM) ..................................................... 32 Bảng 3. 7. Bảng kiểm định hệ số tương quan giữa 2 bộ kít...................................... 35 Bảng 3. 8. Bảng kiểm định T - test của chênh lệch giữa 2 phương pháp ................. 36 Bảng 3. 9. Mối tương quan giữa việc sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ......................................................................................................... 37 Bảng 3. 10. Mối tương quan giữa việc sử dụng rượu bia với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ......................................................................................................... 38 Bảng 3. 11. Mối tương quan giữa độ tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng 39 Bảng 3. 12. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thời gian kiêng xuất tinh ................................................................................................... 40 Bảng 3. 13. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với độ pH của tinh dịch .............................................................................................................. 41 Bảng 3. 14. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thể tích xuất tinh .................................................................................................................... 42 Bảng 3. 15. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng . 42 Bảng 3. 16. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh trùng ................................................................................................................... 44 Bảng 3. 17. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh trùng ................................................................................................................... 45 Bảng 3. 18. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh trùng ................................................................................................................... 47 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AB Aniline Blue Sử dụng chất nhuộm aniline blue AO Acridine orange Chất nhuộm acridine orange Comet assays Điện di tế bào đơn DFI DNA fragmentation index Chỉ số phân mảnh DNA DNA Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic DTT Dithiothreitol ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection Kỹ thuật tiêm tinh trùng Vào bào tương trứng IM Immotile Bất động IUI Intra Uterine Insemination Kỹ thuật bơm tinh trùng Vào buồng tử cung IVF Invitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm LS Lysis Dung dịch ly giải NP Non - progressive Di động không tiến tới COMET Tiếng anh NST Tiếng việt Nhiễm sắc thể Progressive Di động tiến tới SCD Sperm Chromatin Dispersion Khảo sát mức độ phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng SCSA Sperm Chromatin Structure Assay Khảo sát cấu trúc chromatin tinh trùng TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase nick end labeling Đánh dấu phân mảnh dna bằng các dutp PR WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới vii LỜI MỞ ĐẦU Vô sinh là một vấn đề sức khỏe sinh sản cấp thiết và đang có xu hướng gia tăng trong xã hội hiện nay. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ hiếm muộn trung bình khoảng 6-12% dân số toàn cầu [1].Tại Việt Nam, một nghiên cứu phối hợp giữa Bệnh viện Phụ sản Trung ương và Đại học Y Hà Nội tiến hành trên 13.300 cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ (15-49) ở 8 tỉnh đại diện cho 8 vùng sinh thái ở nước ta, cũng xác định tỉ lệ vô sinh của các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ là 7.7%, tỷ lệ vô sinh nam và vô sinh nữ tương đương nhau [2]. Đây là những con số rất đáng báo động vì tỉ lệ vô sinh đang tăng rất nhanh theo thời gian. Các kết quả nghiên cứu cho thấy nam giới có vai trò không kém nữ giới trong vấn đề chẩn đoán và điều trị vô sinh. Để chẩn đoán vô sinh nam thì tinh dịch đồ là xét nghiệm thường quy. Tuy nhiên, xét nghiệm này không đánh giá được tính toàn vẹn về mặt vật chất di truyền trong tinh trùng và còn mang nặng tính chủ quan. Để chẩn đoán được chính xác những nguyên nhân làm giảm số lượng và chất lượng tinh trùng, đối tượng nam giới vô sinh cần được làm thêm nhiều xét nghiệm khác, trong đó có xét nghiệm đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng. Để đáp ứng nhu cầu xét nghiệm, kít xác định phân mảnh DNA tinh trùng trên thế giới đã được chế tạo rất nhiều tuy nhiên khả năng phát hiện phân mảnh DNA tinh trùng vẫn chưa thực sự ổn định và giá thành còn rất cao (khoảng 1 - 2 triệu đồng/xét nghiệm). Do đó việc phát triển được một bộ kít chuẩn, xây dựng được một quy trình xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng chuẩn, ổn định và giá thành thấp đang dần trở nên cấp thiết và thực sự có ý nghĩa thực tiễn, góp phần quan trọng trong việc chẩn đoán và đưa ra hướng điều trị vô sinh nam để đạt được kết quả khả quan nhất. Vì vậy tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện kít thử và quy trình tạo tiêu bản xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng người" với các mục tiêu sau: - Xác định được một số điều kiện thích hợp để chế tạo kít thử làm tiêu bản xác định mức độ phân mảnh của DNA tinh trùng người. - Đánh giá mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và một số đặc tính tinh trùng sử dụng kít BK-Halosperm. 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1. Đặc điểm của tinh trùng người 1.1.1 Sự hình thành tinh trùng người Tinh trùng người là các tế bào đơn bội, mang 23 nhiễm sắc thể (NST) là đặc điểm di truyền của người cha. Tinh trùng có cấu tạo phù hợp giúp tinh trùng có thể di chuyển, nhận biết và thụ tinh với noãn trong đường sinh dục nữ. Sự sinh tinh là một quá trình liên tục và có thể chia làm 3 giai đoạn: sự sản xuất các tế bào mầm (giao tử); sự biệt hoá chức năng để thụ tinh (giảm phân); và sự biệt hoá cấu trúc để hoạt hoá khả năng di động [3]. Hình 1. 1. Sơ đồ các giai đoạn chính trong quá trình sinh tinh [3] - Sự tạo thành giao tử Trong tiểu quản sinh tinh, có hai loại tế bào somatic: tế bào cơ trơn và tế bào Sertoli; và năm loại tế bào mầm: tinh nguyên bào (spermatogonia), tinh bào sơ cấp và tinh bào thứ cấp (spermatocyte), tinh tử (spermatid) và tinh trùng (spermatozoa). Các tinh nguyên bào nằm dọc theo bờ ngoài của các tiểu quản, tiếp xúc với các tế bào hỗ trợ, đó là các tế bào Sertoli. Các tế bào Sertoli tạo thành một lớp liên tục trên màng đáy của tiểu quản và gắn kết chắc chắn với nhau do ranh giới tế bào khít. Bằng cách này chúng tạo thành hàng rào tinh hoàn - máu về mặt miễn dịch. - Sự biệt hoá về mặt chức năng  Tinh nguyên bào (spermatogonia): Khi các tế bào mầm nguyên thuỷ phân chia nguyên phân, nó tạo ra các tinh nguyên bào 2 - Tinh bào sơ cấp (primary spermatocyte): Ngay sau lần nguyên phân cuối cùng của tinh nguyên bào B, các tế bào chị em còn gắn kết với nhau qua cầu nối bào tương, sẽ nhân đôi bộ NST kiểu như để chuẩn bị cho nguyên phân một lần nữa. - Sự giảm phân và tinh bào thứ cấp (secondary spermatocyte): Sự giảm phân I xảy ra khá nhanh và mỗi tinh bào sơ cấp chia thành 2 tinh bào thứ cấp, mỗi tinh bào thứ cấp lúc này chứa bộ NST đơn bội ở dạng kép (1n2c). Thời gian tồn tại của tinh bào thứ cấp ngắn, nó nhanh chóng phân chia lần hai để chia đôi các NST dạng kép và thành hai nửa và thành hai tinh tử đơn bội. - Sự biệt hoá về cấu trúc Các tinh tử trải qua sự biệt hoá về hình thái hình thành nên tinh trùng trưởng thành. Quá trình biệt hoá này được gọi là sự hình thành tinh trùng. Các tinh tử kéo dài ra và phát triển đuôi nhưng vẫn còn gắn với nhau và các tế bào Sertoli bên dưới bởi phương tiện là cầu nối tương bào. Kết quả của quá trình này là hình thành các tinh tử với đơn bội NST có nguồn gốc từ tế bào mẹ. Hình 1. 2. Sự biến đổi tinh tử thành tinh trùng [3] 1.1.2. Hình thái và cấu trúc Một tinh trùng trưởng thành có chiều dài khoảng 50μm, bao gồm phần đầu và phần đuôi. Phần đầu có hình bầu dục với chiều dài khoảng 4,0 - 5,5μm, chiều rộng 2,5 - 3.5μm. Tỉ lệ chiều rộng trên chiều dài vào khoảng 1,5 - 1,7. Đầu tinh trùng chia làm 2 vùng: nhân và cực đầu (acrosome) chứa các enzyme cần thiết 3 cho quá trình thụ tinh và nhân chứa vật chất di truyền [4]. Phần đuôi tinh trùng dài khoảng 40 - 50μm, chứa tất cả các thành phần cần thiết cho khả năng di động. Hình 1. 3. Hình thái và cấu trúc tinh trùng (điều trị.vn) 1.1.3. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng Nhiễm sắc chất (Chromatin) là vật chất di truyền của tế bào gồm các chuỗi DNA kết hợp với protein cấu trúc. Phần lớn chất nhiễm sắc của tinh trùng được ngưng tụ bởi các protamine ở dạng cấu trúc hình xuyến rất nhỏ gọn, mỗi cấu trúc chứa khoảng 50 Kb DNA [5], [6], mặc dù khoảng 8% DNA vẫn được tổ chức bởi histones [7] [8] [9]. Các protein cấu trúc này có vai trò tổ chức hình thái và điều hòa hoạt động của DNA. Ở tế bào sinh dưỡng, protein cấu trúc chủ yếu là các protein histone. Chromatin trong tế bào tinh trùng có sự khác biệt với chromatin của tế bào sinh dưỡng. Trước quá trình giảm phân, chromatin của tinh nguyên bào cũng mang các protein histone, khi các tế bào giảm phân, protein histone này được thay thế bởi biến thể histone đặc trưng cho tinh hoàn [10]. Trước khi tiến hành thay thế histone, chromatin dãn rộng và có nhiều vùng co cụm. Các biến thể histone thay thế vào giúp chromatin trở nên gọn gàng và đồng đều hơn [11]. Tiếp theo, trong các tinh tử hình cầu, protein histone được thay thế dần bởi protein chuyển tiếp. Đến giai đoạn tinh tử kéo dài, protein chuyển tiếp bị loại khỏi chromatin và thay bằng protamine. Ở người khi kết thúc quá trình sinh tinh, khoảng 85% histone được thay thế bởi protamine [12]. Quá trình thay thế histone thành protamine rất quan trọng trong sự hình thành tinh trùng cũng như chức năng sinh lý của tinh trùng khi gặp noãn [13]. 4 Protamine có kích thước khoảng một nửa histone. Chúng là các protein rất kiềm, giàu 2 amino axit là arginine và cysteine [12], [14]. Hàm lượng arginine cao (lên đến 70% trong tổng số các amino axit) hình thành một mạng lưới điện tích dương, giúp protamine có thể liên kết chặt chẽ với DNA mang điện tích âm [15]. Cysteine góp phần trong việc hình thành cầu nối disulfide nội phân tử của protamine và liên kết giữa các protamine với nhau [16]. Protamine giúp nén chặt các sợi DNA và hình thành các đơn vị đóng gói cơ bản của chromatin tinh trùng được gọi là toroid, một phần nhỏ liên kết với histone tạo cấu trúc lỏng lẻo hơn và phần còn lại liên kết với chất nền nhân tinh trùng (Matrix Attachment Regions - MAR) có kích thước khoảng 50kb (Hình 1.4). Các liên kết chéo disulfide nội phân tử và liên phân tử giữa các cysteine trong protamine giúp các toroid càng nén chặt hơn nữa [17]. Với cấu trúc có sự tham gia của protamine, DNA tinh trùng người được nén chặt bằng 1/6 so với DNA của tế bào sinh dưỡng bình thường. Hình 1. 4. Cấu trúc chromatin của tinh trùng [18] Thành phần protein quan trọng khác trong cấu trúc DNA tinh trùng là histone. Theo Hammoud và cộng sự (2009), có khoảng 4% lượng DNA 5 liên kết với histone tại các vùng gen khởi động phiên mã (gene promoter site) [9]. Toàn bộ các vùng gen đặc trưng cho quá trình sinh tinh và thụ tinh được xác định là liên kết với histone trong nhiễm sắc thể của tinh trùng. Tuy nhiên, những vùng gen này lại dễ bị bất hoạt bởi hoạt động của các enzyme nuclease. Histone trong DNA tinh trùng không được thay thế bởi histone của noãn sau quá trình thụ tinh nên bất cứ tổn thương nào ở vùng này cũng sẽ truyền trực tiếp cho phôi [19]. Do đó, nếu không được phát hiện và sửa chữa sẽ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của phôi và thai nhi. 1.2. Tình hình vô sinh ở nam giới 1.2.1. Sơ lược vô sinh nam Vô sinh nam được định nghĩa là tình trạng nam giới không có khả năng thụ thai cho nữ giới sau khi kết hôn 12 tháng mà không sử dụng biện pháp tránh thai nào [20]. Người ta ước tính rằng 20 - 30% các trường hợp vô sinh chỉ do yếu tố nam giới và 20% khác liên quan đến các vấn đề từ cả hai vợ chồng [21] và sự suy giảm số lượng tinh trùng được báo cáo trong các báo cáo khoa học ngày càng tăng [22]. Song song với số lượng tinh trùng, suy giảm là một xu hướng đáng lo ngại không kém và kéo dài trong các bất thường của hệ thống sinh sản nam giới, chẳng hạn như hiện tượng tinh hoàn ẩn, khối u tế bào mầm và đến tuổi dậy thì [23]. Nếu xu hướng tiêu cực về số lượng tinh trùng và các vấn đề về hệ thống sinh sản nam có giá trị, thì điều đó có nghĩa gì đối với khả năng sinh sản của nam giới nói chung và có những vấn đề khác liên quan đến sức khỏe sinh sản của nam giới [24]. 1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới Các nguyên nhân dẫn tới vô sinh nam bao gồm [25] - Nhóm nguyên nhân bất thường về tinh trùng:  Thiểu năng tinh trùng: Tinh trùng ít, yếu, dị dạng.  Không tinh trùng. - Nhóm nguyên nhân khác:  Giãn tĩnh mạch thừng tinh  Rối loạn chức năng giao hợp, rối loạn phóng tinh.  Rối loạn nội tiết. 6  Miễn dịch.  Bệnh lý toàn thân.  Tổn thương tinh hoàn mắc phải.  Nhiễm trùng tuyến sinh dục phụ.  Bệnh lý di truyền. 1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ Người ta ước tính các bất thường của tinh trùng về sản xuất hay hoạt động chức năng, chiếm từ 35% đến 50% các trường hợp vô sinh. Tinh dịch đồ là một xét nghiệm nhằm đánh giá chất lượng của tinh trùng, thông qua các chỉ số như số lượng, khả năng di động, hình dạng bình thường… mặc dù không cung cấp các thông tin về hoạt động chức năng của tinh trùng, dựa vào kết quả của một tinh dịch đồ, người ta có thể đánh giá một cách khái quát về khả năng sinh sản của nam giới [26], [27]. Đa số các trung tâm trên thế giới và khu vực đều đánh giá tinh dịch đồ dựa theo cẩm nang của Tổ chức Y tế Thế giới về xét nghiệm và xử lý tinh dịch người (WHO). Tính đến hiện tại đã có 6 phiên bản của cuốn cẩm nang nà, phiên bản mới nhất - phiên bản thứ sáu (WHO, 2021) [27]. Đây là phiên bản hoàn chỉnh nhất hiện nay, thay đổi quy trình và cách diễn giải kết quả, cũng như cách đánh giá theo tiêu chuẩn mới chính xác hơn, nghiêm ngặt hơn để hạn chế sai số tối thiểu và mang lại kết quả tối ưu nhất cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Bảng 1.1). Bảng 1. 1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [27] [28] Các chỉ số bình thường của WHO, Các chỉ số bình thường của WHO, 2021 2010 - Thể tích tinh dịch: ≥ 1,4ml. - Thể tích tinh dịch: ≥ 1,5ml. - pH ≥ 7,2. - pH ≥ 7,2. - Mật độ tinh trùng: ≥ 16.106/ml. - Mật độ tinh trùng: ≥ 15.106/ml. - Tổng số tinh trùng: ≥ 39.106/lần xuất tinh. Tổng số tinh trùng: ≥ 39.106/lần xuất tinh. - Độ di động của tinh trùng: - Độ di động của tinh trùng:  PR ≥ 30%, hoặc PR + NP ≥ 42%.  PR ≥ 32%, hoặc PR + NP ≥ 40%. - Hình dạng bình thường: ≥ 4%. - Hình dạng bình thường: ≥ 4%. - Tỉ lệ sống: ≥ 54%. - Tỉ lệ sống: ≥ 58%. 7