Tài liệu Nghiên cứu hiện tƣợng methyl hóa ở gen gstp1 liên quan đến ung thƣ tiền liệt tuyến ở bệnh nhân việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA Ở GEN GSTP1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN Ở BỆNH NHÂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017 1 Công trình được hoàn thành tại : Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi giờ ngày tháng năm 20... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Di truyền ngoại gen là thông tin di truyền qui định bởi cách thức methyl hóa DNA và biến đổi histone. Thay đổi mức độ methyl hóa DNA tham gia kiểm soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của gen. Do đó mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm năng trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư. Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư phổ biến, có tỷ lệ tử vong cao ở nam giới. Methyl hóa DNA tăng cao ở một số gen trong UTTTL, trong đó, gen được nghiên cứu nhiều nhất là GSTP1 (πclass glutathione S-transferase gene) mã cho enzym tham gia khử các độc tố gây ung thư. Ở Việt Nam, nghiên cứu cơ bản về methyl hóa DNA mới được triển khai. Nghiên cứu và phát triển thế hệ dấu chuẩn di truyền ngoại gen hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên lượng đúng và điều trị đích chính xác là nhiệm vụ bất khả kháng của sinh y học hiện đại. Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa ở gen GSTP1 liên quan ung thư tuyến tiền liệt ở bệnh nhân Việt Nam” với mục đích: - Phân tích mức độ methyl hóa promoter GSTP1ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt/phì đại tuyến người Việt Nam, - Xác định mối tương quan giữa mức độ methyl hóa promoter GSTP1 với các đặc điểm mô bệnh học, từ đó hoàn thiện kỹ thuật phát hiện sự methyl hóa làm tiền đề để phát triển bộ sinh phẩm sử dụng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 để hỗ trợ chẩn đoán UTTTL. Đóng góp và ý nghĩa thực tiễn của luận án: Lần đầu tiên xây dựng và tối ưu được điều kiện phản ứng MS-PCR để phát hiện promoter GSTP1 bị methyl hóa ở bệnh nhân UTTTL và PĐT người Việt Nam; Tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 ở bệnh nhân UT/PĐT người Việt Nam chiếm 66,1 % và 10,8 %. Sự sai khác có ý nghĩa giữa methyl hóa promoter GSTP1 với UT/PĐT; giữa methyl hóa promoter GSTP1 với phân độ Gleason; Bước đầu hoàn thiện các tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm phát hiện methyl hóa promoter GSTP1; kết hợp 3 MS-PCR với lai điểm để tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát hiện sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa. Giới thiệu luận án: Luận án gồm 109 trang (3 chương): Đặt vấn đề 3 trang, chương 1 (tổng quan) 28 trang, chương 2 (vật liệu, phương pháp) 18 trang, chương 3 (kết quả thảo luận) 38 trang, kết luận- kiến nghị 2 trang. Luận án có 39 hình, 13 bảng, 148 tài liệu tham khảo (3 tiếng việt, 136 tiếng anh, 9 trang web). CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Ung thƣ 1.1.1. Thực trạng ung thƣ Theo WHO, ước tính đến năm 2030 khả năng mắc UT mới mỗi năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người chết vì UT. Việt Nam có khoảng 110000 người mắc UT mới trong đó khoảng 82000 người tử vong do UT mỗi năm, chiếm tới 73,5 % tổng số bệnh nhân UT. 1.1.2. Cơ sở tế bào học ung thư Sáu đặc điểm cơ bản của tế bào UT: duy trì tín hiệu tăng sinh, trốn tránh các yếu tố ức chế khối u, chống lại apotosis, nhân lên bất tử, cảm ứng tăng sinh mạch máu, xâm lấn và di căn. 1.1.3. Di truyền học ung thư Các gen liên quan đến sự hình thành tế bào ác tính và phát triển khối u được phân thành hai nhóm chính là gen ức chế khối u và gen gây ung thư. 1.2. Di truyền ngoại gen và ung thƣ 1.2.1. Biến đổi histone trong ung thư Trong các dạng biến đổi, acetyl hóa và methyl hóa là phổ biến nhất và liên quan tới ung thư. 1.2.2. Methyl hóa DNA bất thường trong ung thư Methyl hóa DNA là hiện tượng gắn thêm gốc methyl vào nucleotide trên phân tử DNA. Methyl hóa DNA dưới mức trong UT xảy ra tại các trình tự lặp lại, yếu tố vận động Alu hay LINE1, vùng DNA vệ tinh α gần tâm động. Methyl hóa quá mức vùng promoter là 4 gây bất hoạt các gen ức chế khối u và mức độ methyl hóa của mỗi gen trong từng loại ut cũng khác nhau. 1.3. Methyl hóa DNA trong UTTTL 1.3.1. Phân độ trong ung thư tuyến tiền liệt Hệ thống phân loại Gleason được xem như tiêu chuẩn vàng cho phân chia các giai đoạn của UTTTL, gồm hai giá trị: độ Gleason và điểm Gleason. 1.3.2. Methyl hóa DNA trong ung thư tuyến tiền liệt Hơn 30 gen bị methyl hóa bất thường trong UTTTL, trong đó methyl hóa promoter gen GSTP1 là phổ biến và rộng rãi nhất. Methyl hóa GSTP1 có nhiều tiềm năng để phát triển thành dấu chuẩn hỗ trợ tiên lượng UTTTL. 1.4. Phƣơng pháp phân tích methyl hóa DNA 1.4.1. Phương pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) Khi DNA xử lý với bisulfite, các cytosine không bị methyl sẽ biến đổi thành uracil, sau phản ứng PCR, uracil thành thymine. Sự thay đổi nucleotide này có thể làm xuất hiện hoặc mất đi vị trí nhận biết của enzyme giới hạn. 1.4.2. Phương pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase chain reaction) MS-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa vào vùng giàu CpG cho phép phân biệt DNA bị methyl hóa với DNA không methyl hóa. Kết hợp hai kỹ thuật MS-PCR với lai điểm cho phép định lượng các cytosine bị methyl hóa không cần điện di. 1.4.3. Phương pháp định lượng qMS-PCR Để tăng tính chính xác, hạn chế dương tính giả, TaqMan và các mồi kết hợp với đầu dò được xây dựng và hoàn thiện, trong đó MethylLight và HeavyLight là hai kỹ thuật định lượng phổ biến. 5 1.5. Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng ung thƣ 1.5.1. Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng ung thư đang được đặc biệt quan tâm và áp dụng phổ biến: dấu chuẩn DNA, dấu chuẩn RNA và dấu chuẩn protein. 1.5.2. Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư tuyến tiền liệt PSA (kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt) là dấu chuẩn sinh học phổ biến, ngoài ra còn có alpha-methylacyl CoA racemase (AMACR), kháng nguyên màng đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSMA), protein 3 giàu cystein, Chromogranin A, PCA3… 1.5.3. Triển vọng các bộ kit sử dụng dấu chuẩn methyl hóa DNA Epi prolung ử dụng dấu chuẩn methyl hóa gen SHOX2 chẩn đoám sớm ung thư phổi. Epiprocolon dựa trên dấu chuẩn methyl hóa SEPT9 chẩn đoán sớm ung thư đại tràng. ConfirmMDx phân tích methyl hóa quá mức trên 3 gen GSTP1, APC và RASSF1A nhằm hạn chế những trường hợp sinh thiết không cần thiết trong UTTTL. 1.6. Nghiên cứu methyl hóa DNA trong ung thƣ ở Việt Nam Nghiên cứu của Trinh HT cho thấy 87,5 % mẫu UT đại trực tràng có sự methyl hóa quá mức ở gen ức chế khối u APC. Tran THT và cs.; Le NQ và cs. phát hiện tỷ lệ methyl hóa gen ER tương ứng ở 26/28 (92,9 %) và 21/24 (87,5 %) bệnh phẩm UT vú. Vi Thuật Thắng và cs. nhận thấy 11/20 (55 %) mẫu UT và 2/10 (20 %) mẫu PĐTTL có RASSF1A bị methyl hóa. Phân tích methyl hóa DNA trên từng gen riêng rẽ hay phân tích kết hợp sự methyl hóa đồng thời nhiều gen đối với UT còn rất ít. Vo LT và cs. phân tích đồng thời các dấu chuẩn methyl hóa trên gen BRCA1, RASSF1A và ER ở các bệnh nhân UT buồng trứng với tỷ lệ methyl hóa lần lượt là 11/59 (18,6 %) ở gen BRCA1, 40/59 (67,8 %) ở gen RASSF1A và 15/59 (25,4 %) ở gen ER. Tác giả cũng chỉ ra 45/59 (78 %) các bệnh nhân bị methyl hóa quá mức ít nhất một trong ba gen này. Ở Việt Nam, chưa có công bố nào phân tích sự methyl hóa GSTP1 trong ung thư tuyến tiền 6 liệt. Như vậy, phân tích dấu chuẩn di truyền ngoại gen và dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 nói riêng vẫn là một lĩnh vực mới ở Việt Nam. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 96 mẫu bệnh phẩm TTL, dòng tế bào PC3, mẫu máu, các nguyên vật liệu và hóa chất sinh học phân tử. 2.2. Thiết bị chính Các thiết bị chuyên dụng cho sinh học phân tử. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu - Chuẩn bị mẫu để tách chiết DNA - Nuôi cấy dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 - Tách chiết DNA tổng số - Xử lý DNA tổng số với bisulfite - Tách dòng - Phương pháp PCR - Phương pháp lai điểm - Phương pháp điện di - Xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ - Tinh sạch sản phẩm PCR - Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MS-PCR - Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học - Xác định số bản copy 2.4. Sơ đồ thí nghiệm Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm. 7 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và phân loại mẫu 96 mẫu bệnh phẩm TTL đúc paraffin (59 mẫu UT và 37 mẫu PĐT), được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội. Mẫu máu người khỏe mạnh chống đông với heparin, cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương. Tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 được nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu. 3.2. Tách chiết DNA tổng số 3.2.1. Tách chiết DNA từ mẫu máu và dòng tế bào nuôi cấy PC3 Hình 3.3. (A) Kết quả điện di DNA tổng số tách từ máu (P1) và từ dòng tế bào PC3 (P2) trên gel agarose 1 %. (B) Kết quả xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ. Băng DNA tổng số sáng, rõ nét chứng tỏ DNA tách được đạt chất lượng tốt. Tỷ lệ A260/A280 của các mẫu DNA đạt giá trị 1,8 - 2,0 chứng tỏ DNA có độ tinh sạch đạt yêu cầu. 3.2.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin DNA tổng số được tách chiết từ 20 lát cắt/mẫu của 96 mẫu TTL bằng kit QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen). Mẫu đúc 8 paraffin có nồng độ DNA thấp, bị đứt gãy và lẫn nhiều tạp chất nên điện di và xác định nồng độ bằng phương pháp đo độ hấp thụ không chính xác. Trong nghiên cứu, 5 ng và 25 ng DNA tổng số tách từ dòng tế bào PC3 và 1 µl DNA tổng số mẫu đúc được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR để khuếch đại trình tự 268 bp của gen đơn bản quản gia β-globin để đánh giá lượng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm. Kết quả cho thấy 1 µl DNA tách từ các mẫu đúc có ít nhất 5 ng và hầu hết DNA tách từ mẫu đúc đảm bảo số lượng theo yêu cầu của kit xử lý bisulfite. Hình 3.4. (A) Kết quả điện di minh họa DNA tổng số tách từ mẫu đúc nến UT (P1-P4) và PĐT (B1-B4) trên gel agarose 1 %. (B) Kết quả xác định nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ. Hình 3.5. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % minh họa sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin. 9 3.3. Xử lý DNA tổng số với bisulfite 3.3.1. Đánh giá chất lượng DNA sau xử lý bisulfite Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin với cặp mồi đặc hiệu cho DNA không xử lý bisulfite (A) và cho DNA sau xử lý (B) trên gel acrylamide 8 %. Quá trình xử lý yêu cầu: (1) DNA được xử lý hoàn toàn đảm bảo không còn DNA nguyên gốc và (2) DNA thu hồi sau xử lý đảm bảo đủ lượng khuôn cho phản ứng MS-PCR. Để đánh giá XL bisulfite xảy ra hoàn toàn, DNA sau XL được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi gen β-globin, cặp mồi đặc hiệu với DNA không XL bisulfite. Gen β-globin không bị methyl hóa nên trình tự nucleotide sau khi XL bisulfite sẽ có tất cả C biến đổi thành U. Do đó, cặp mồi được thiết kế theo trình tự DNA gốc không thể bắt cặp với DNA đã bị XL. Vì vậy nếu quá trình XL xảy ra hoàn toàn thì không có sản phẩm PCR. Ngược lại, những mẫu DNA không được xử lý hết sẽ xuất hiện băng DNA có kích thước 268 bp. Kết quả trên Hình 3.6A cho thấy không thu được băng có kích thước 268 bp cho gen β-globin ở mẫu DNA đã qua XL bisulfite. Băng 268 bp chỉ xuất hiện với DNA không bị xử lý. Điều này chứng tỏ các mẫu DNA đã được XL hoàn toàn. Sau quá trình XL bisulfite, lượng DNA bị hao hụt nhiều do bị biến tính và chịu tác động của các hóa chất xử lý, các bước tinh sạch. Vì vậy cần kiểm tra lượng DNA sau XL có đủ làm khuôn cho phân tích MS-PCR. Quá trình kiểm tra được thực hiện bằng phản ứng PCR với cặp mồi Un – Globin được thiết kế để khuếch đại trình tự gen đơn bản β globin từ DNA đã XL (có tất cả C biến đổi thành U). Kết quả PCR được trình bày trên Hình 3.6B cho thấy băng DNA 244 bp được khuếch đại từ DNA đã XL. Hơn nữa, kết quả âm tính không có sản phẩm PCR với khuôn là DNA chưa được XL chứng tỏ tính đặc hiệu của cặp mồi Un-globin không bắt cặp nhầm với loại DNA này. Như vậy, lượng DNA sau XL đảm bảo cho phản ứng MS-PCR. 10 3.3.2. Xử lý DNA tổng số của các mẫu bệnh phẩm với bisulfite 500 ng DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm UT/PĐT để XL với bisulfite. Hình 3.7 minh họa DNA đã được xử lý hoàn toàn nên không có sản phẩm PCR 268 bp trong khi băng này xuất hiện ở DNA không xử lý. Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR minh họa DNA được xử lý bisulfite hoàn toàn. 3.4. Tối ƣu phản ứng MS-PCR để phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1. Sau XL bisulfite có 2 loại DNA: DNA bị methyl hóa (mC giữ nguyên là C) và DNA không bị methyl hóa (C biến đổi thành U). Nguyên tắc của các cặp mồi trong kỹ thuật MS-PCR là có trình tự bổ sung với từng loại DNA xuất hiện sau XL, nhờ đó phản ứng MSPCR sẽ phân biệt được 2 loại DNA này. Đầu tiên, các cặp mồi tham khảo từ công bố quốc tế được sử dụng trong phản ứng MS-PCR với DNA tách từ PC3 và từ máu đã được xử lý. Trong tế bào PC3, promoter GSTP1 chỉ bị methyl hóa trên 1 allen; do đó, phản ứng MS-PCR sẽ có sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa và GSTP1 không bị methyl hóa. Trong tế bào máu tất cả DNA không bị methyl hóa nên phản ứng MS-PCR chỉ có sản phẩm GSTP1 không bị methyl hóa. Tham khảo các nghiên cứu đã công bố, cặp mồi phát hiện methyl hóa promoter GSTP1 được thiết kế từ vị trí -200 đến +50. Chúng tôi thiết kế các mồi mới cho kỹ thuật MS-PCR hai vòng (nested MSPCR) nhằm làm giàu khuôn và tăng tính đặc hiệu cho phản ứng. Các mồi thiết kế bao gồm: GS Me-F1/R, GS Me-F2/R khuếch đại đoạn DNA kích thước 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa; các mồi 11 GS Un-F1/R, GS Un-F2/R khuếch đại đoạn DNA kích thước 149 bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa. Hình 3.8. Vị trí các mồi đặc hiệu cho phản ứng nested MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 do đề tài thiết kế. Sử dụng các cặp mồi thiết kế, phản ứng nested MS-PCR được thực hiện với DNA dòng tế bào PC3 và DNA từ mẫu máu đã được XL bisulfite. Sản phẩm MS-PCR là băng DNA rõ nét có kích thước 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa và băng DNA 149 bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa. Tính đặc hiệu của cặp mồi MS-PCR cần được thể hiện ở 2 tiêu chí: (1) không khuếch đại trình tự GSTP1 chưa XL bisulfite và (2) cặp mồi đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa sẽ không khuếch đại nhầm GSTP1 không bị methyl hóa. Do đó, các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại DNA trước và sau XL bisulfite, các loại DNA này tách từ tế bào PC3 và từ mẫu máu. Hình 3.10 cho thấy DNA không XL cho kết quả âm tính trong phản ứng MS-PCR, như vậy đáp ứng tiêu chí đầu tiên. Cặp mồi đặc hiệu GSTP1 bị methyl hóa cho kết quả âm tính với DNA mẫu máu đã xử lý có GSTP1 không bị methyl hóa, như vậy đáp ứng tiêu chí thứ hai. Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện GSTP1 bị methyl hóa (A) và GSTP1 không bị methyl hóa (B) trên gel acrylamide 8 %. 12 Hình 3.10. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi MS-PCR phát hiện GSTP1 không bị methyl hóa (149 bp) (A) và GSTP1 bị methyl hóa (155 bp) (B). 3.5. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa 3.5.1. Kiểm tra sản phẩm đặc hiệu bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn Trình tự nucleotide promoter GSTP1 ở vùng thiết kế các mồi MS-PCR có chứa 2 vị trí CGCG nhận biết bởi enzym giới hạn BstUI. Khi GSTP1 bị methyl hóa thì CGCG được giữ nguyên, ngược lại sẽ biến đổi thành TGTG. Vì vậy, sử dụng enzym giới hạn có vị trí nhận biết chứa CG cho phép phân biệt trình tự bị methyl hóa/không bị methyl hóa. Phản ứng cắt BstUI xảy ra theo nguyên tắc: khi cả 2 vị trí đều bị methyl hóa thì trình tự 155 bp sẽ bị cắt tạo nên ba đoạn có kích thước lần lượt là 90 bp, 40 bp và 25 bp. Khi chỉ có một trong hai vị trí CGCG bị methyl hóa thì sẽ thu được tổ hợp của các đoạn có kích thước 115 bp, 40 bp hoặc 130 bp, 25 bp. Ngược lại, nếu cả hai vị trí nhận biết của BstUI đều không bị methyl hóa (trình tự 149 bp) thì sẽ không có sản phẩm cắt bởi enzyme giới hạn. Kết quả trên Hình 3.11B cho thấy sản phẩm 155 bp khuếch đại từ PC3 bị methyl hóa hoàn toàn ở 2 vị trí nhận biết của BstUI. Trong khi đó, sản phẩm 149 bp khuếch đại từ mẫu máu đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa đều không bị cắt ở cả hai vị trí này. 13 Hình 3.11. (A) Sơ đồ vị trí nhận biết của BstUI trên trình tự GSTP1 bị methyl hóa có kích thước 155 bp được khuếch đại trong phản ứng MSPCR. (B) Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR cắt với enzyme BstUI trên gel acrylamide 10 %. 3.5.2. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu bằng giải trình tự Sản phẩm 258 bp của promoter cùng với sản phẩm 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa trong tế bào PC3 và sản phẩm 149 bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa trong tế bào máu được tinh sạch, được tách dòng trong plasmid và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. Kết quả sàng lọc trên Hình 3.12 cho thấy các trình tự này đã được tách dòng thành công. Plasmid gK2 mang đoạn chèn GSTP1 không XL bisulfite, plasmid mK1 mang đoạn chèn GSTP1 bị methyl hóa, và plasmid uK6 mang đoạn chèn GSTP1 không bị methyl hóa được xác định trình tự. Trình tự GSTP1 khuếch đại từ DNA không XL bisulfite có mức độ tương đồng 100 % so với trình tự GSTP1 (NC_000011.9) trong ngân hàng dữ liệu (Hình 3.13A). Kết quả Hình 3.13B cho thấy 19 vị trí C biến đổi thành T ở trình tự GSTP1 không bị methyl hóa, chứng tỏ XL bisulfite xảy ra hoàn toàn. Tuy nhiên trình tự GSTP1 bị methyl hóa ở PC3 có 17 C bị methyl hóa ở phức CpG (trong khi các C này đều bị biến đổi thành T ở trình tự GSTP1 không bị methyl hóa của mẫu máu). Điều này chứng tỏ các C trong phức CpG bị methyl hóa. Như vậy, các cặp mồi MS-PCR đã khuếch đại đặc hiệu và cho phép phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa với trình tự không bị methyl hóa. 14 Hình 3.12. Kết quả kiểm tra sự có mặt của trình tự GSTP1 không xử lý bisulfite (A), của GSTP1 bị methyl hóa (B) và GSTP1 không bị methyl hóa (C) trong các plasmid tái tổ hợp. Hình 3.13. (A). Kết quả so sánh trình tự promoter gen GSTP1 với ngân hàng dữ liệu. (B). Kết quả giải trình tự trình tự GSTP1 không XL bisulfite, GSTP1 bị methyl hóa và không bị methyl hóa. 3.6. Xác định sự methyl hóa promoter gen GSTP1 ở các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt và phì đại tuyến Methyl hóa GSTP1 được phân tích đối với 59 mẫu ung thư tuyến tiền liệt và 37 mẫu phì đại tuyến. Kết quả MS-PCR cho thấy 39/59 mẫu UTTTL và 4/37 mẫu PĐT có GSTP1 bị methyl hóa, với tỷ lệ tương ứng 66,1 % và 10,8 %. tỷ lệ methyl hóa GSTP1 khác nhau giữa các tộc người. Yegnasubramanian & cs. (2004) nghiên cứu trên các bệnh nhân UTTTL ở Mỹ phát hiện được tỷ lệ methyl hóa GSTP1 đạt 94,0 %. 15 Enokida & cs. (2005) phát hiện được sự methyl hóa GSTP1 ở 92/170 mẫu đạt 54,0 % trong 170 mẫu UTTTL của bệnh nhân Nhật Bản. Nghiên cứu của Syeed & cs. (2010) ở bệnh nhân Ấn Độ đã phát hiện tỷ lệ methyl hóa GSTP1 ở 29/50 trường hợp UTTTL đạt 58,0 %. Hình 3.14. Kết quả minh họa sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 trên các mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt. Bên cạnh mẫu ung thư TTL, mẫu PĐT cũng phát hiện được methyl hóa gen GSTP1. Trong nghiên cứu, mẫu PĐT đạt tỷ lệ methyl hóa 10,8 %. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu đã công bố. Enokida & cs. (2005), Syeed & cs. (2010) phát hiện được methyl hóa quá mức GSTP1 lần lượt ở 4/69 (5,8 %) và 12/45 (26,6 %) mẫu PĐT. Tỷ lệ methyl hóa ở các bệnh nhân UT cao hơn rất nhiều so với các bệnh nhân PĐT. Vì vậy, bệnh nhân TTL Việt Nam có thể sử dụng bộ kit thương mại hỗ trợ phân biệt ung thư/phì đại tuyến tiền liệt bằng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1. 16 3.7. Phân tích tình trạng methyl hóa của promoter gen GSTP1 và các đặc điểm mô bệnh học Kết quả cho thấy sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa tỷ lệ methyl hóa GSTP1 ở mẫu UT và PĐT (p< 0.0001). Sử dụng phần mềm thống kê sinh học Medcalc, phân tích mối tương quan giữa sự methyl hóa GSTP1 với các đặc điểm mô bệnh học cho thấy mối tương quan giữa methyl hóa GSTP1 với loại mẫu và phân độ Gleason có ý nghĩa thống kê với xác suất p <0,05, đạt độ nhạy trên 90 % và độ đặc hiệu xấp xỉ 65 %. Yegnasubramanian và cs. (2004), Yoon và cs. (2012) phân tích dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 có độ nhạy lần lượt là 93 % và 85 %, độ đặc hiệu lên đến 100 %. Ở bệnh nhân gốc Mỹ, sử dụng kỹ thuật MS-PCR hoặc MS-PCR định lượng xác định được tỷ lệ methyl hóa GSTP1 đạt tương ứng 94 % (68/73) và 95 % (112/118). Như vậy, kết quả này hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa đặc điểm này với yếu tố tuổi bệnh nhân là ngẫu nhiên, không có ý nghĩa thống kê với p> 0,05. Kết quả này cho phép khẳng định dấu ấn methyl hóa GSTP1 đặc thù cho UTTTL, khác biệt ở các mẫu PĐT. Hầu hết các nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp MSPCR để đánh giá tình trạng methyl hóa của các gen riêng lẻ đơn giản và hiệu quả. Tuy vậy, phương pháp này vẫn tồn tại một vài hạn chế như hiện tượng dương tính giả, âm tính giả hay không cho phép định lượng hay xác định sự methyl hóa một phần đoạn trình tự nghiên cứu. Để cải tiến độ nhạy, phương pháp MS-PCR định lượng và pyrosequencing được phát triển, cho phép định lượng từng vị trí methyl hóa. Như vậy, áp dụng MS-PCR định lượng hay pyrosequencing là cần thiết để xác định chính xác từng vị trí Cytosine bị methyl hóa của dấu chuẩn GSTP1 trong hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng ung thư tuyến tiền liệt. 17 Bảng 3.1. Mối liên quan giữa đặc điểm mô học và sự methyl hóa promoter gen GSTP1 ở các mẫu ung thư tuyến tiền liệt và phì đại tuyến của bệnh nhân Việt Nam. Hình 3.15. Đường cong ROC thể hiện mối tương quan giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với loại mẫu ung thư tuyến tiền liệt/ phì đại tuyến (A), với độ Gleason (B) và độ tuổi bệnh nhân (C). 18 3.8. Xây dựng bộ sinh phẩm phát hiện GSTP1 bị methyl hóa 3.8.1. Xác định độ nhạy phản ứng MS-PCR phát hiện GSTP1 bị methyl hóa Để xác định độ nhạy, plasmid chuẩn được lựa chọn là plasmid tái tổ hợp mang đoạn GSTP1 bị methyl hóa, kí hiệu là pG-Me. DNA plasmid pG-Me tách chiết chủ yếu ở dạng siêu xoắn (Hình 3.16A). pG-Me được cắt mở vòng với enzyme EcoRI. Sản phẩm cắt được tinh sạch bằng kit và được xác định nồng độ thông qua giá trị A260. DNA tổng số tách từ máu (Hình 3.16B) là DNA không bị methyl hóa và được dùng làm đối chứng âm cho các cặp mồi phát hiện DNA bị methyl hóa. Trong nghiên cứu này, DNA từ máu trước và sau XL bisulfite được trộn với DNA plasmid pG-Me để tạo mẫu tương tự DNA tách từ tế bào. 50 ng DNA tổng số chưa XL (~1500 tế bào) hoặc 10 ng DNA đã XL được trộn với 10 copy plasmid pG-Me dạng thẳng. Kết quả Hình 3.17 cho thấy sự có mặt của DNA tổng số tách từ máu chưa hoặc đã bị xử lý bisulfite không làm ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện 10 bản copy GSTP1 bị methyl hóa. Như vậy, sử dụng DNA plasmid dạng thẳng làm đối chứng chuẩn thì độ nhạy phát hiện trình tự GSTP1 bị methyl hóa đạt 10 bản copy/2000 tế bào (4000 allen) tương đương 0,3 % allen GSTP1 bị methyl hóa. Hình 3.16. Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp pG-Me (A) và DNA tổng số tách từ máu (B) trên gel agarose 1 %. 19 Hình 3.17. (A). Kết quả PCR xác định độ nhạy phát hiện GSTP1 từ plasmid pG-Me dạng thẳng. (B). Kết quả PCR khuếch đại GSTP1 bị methyl hóa từ các mẫu DNA khác nhau. 3.8.2. Các thành phần của bộ sinh phẩm Tương tự bộ sinh phẩm thương mại “CpG WIZ GSTP1 Amplification Kit” phát hiện GSTP1 bị methyl hóa của Hãng Millipore (Code 7808), chúng tôi xây dựng bộ sinh phẩm “GSTP1METHYL Test” gồm 3 loại DNA và các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi loại DNA: DNA đối chứng cho GSTP1 bị methyl hóa (DNA-Me); loại DNA đối chứng cho GSTP1 không bị methyl hóa (DNA-Un) và loại “DNA control” dùng để kiểm tra hóa chất của phản ứng PCR. Mỗi mẫu DNA (sau XL) có thể được thực hiện cùng với 3 cặp mồi (GS Me, GS Un và UN-globin). Đồng thời, các DNA đối chứng được sử dụng với các cặp mồi đặc hiệu tương ứng. DNA-Un được khuếch đại với các cặp mồi GS Un; DNA-Me được khuếch đại với các cặp mồi GS Me. DNA-control đối chứng dương cho gen β globin không bị methyl hóa được khuếch đại bằng cặp mồi UN-globin. Sản phẩm PCR được điện di trên gel acrylamide 8 %. Sự xuất hiện băng DNA 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa và băng DNA 149 bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa. Băng DNA 244 bp đặc hiệu cho β globin không bị methyl hóa. Đối với các mẫu bệnh phẩm có thể thu được kết quả: (1) Mẫu chỉ có băng DNA 149 bp chứng tỏ promoter GSTP1 không bị methyl hóa; (2) Mẫu chỉ có băng DNA 155 bp chứng tỏ promoter gen GSTP1 bị methyl hóa; (3) Mẫu có cả hai băng 149 bp và 155 bp chứng tỏ promoter GSTP1 bị methyl hóa trên một allen hoặc còn lẫn các tế bào lành có GSTP1 không bị methyl hóa; (4) Mẫu DNA cho kết quả âm tính với cả hai cặp mồi 20