Tài liệu Nghiên cứu hệ thống vận tải và phân phối thuốc curcumin của màng bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua da

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== NGÔ THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG VẬN TẢI VÀ PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE LÊN MEN TỪ NƢỚC VO GẠO ĐỊNH HƢỚNG SỬ DỤNG QUA DA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý ngƣời và động vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. LÊ NGỌC HOÀN HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Ngọc Hoàn và các thầy cô trong Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ em để em hoàn thiện đƣợc bài khóa luận này. Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận đƣợc trên giảng đƣờng đại học sẽ là hành trang giúp em vững bƣớc trong tƣơng lai. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Nhƣng do buổi đầu em đƣợc làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, cũng nhƣ hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân chƣa thấy đƣợc. Em rất mong đƣợc sự đóng góp của quý thầy cô và các bạn để khóa luận của em đƣợc hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Ngô Thị Duyên LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của em trong suốt thời gian qua, những kết quả và số liệu trong khóa luận đƣợc em thực hiện tại “Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2”. Những số liệu đạt đƣợc không hề sao chép hay trùng lặp với bất kỳ tài liệu nào và cũng chƣa từng đƣợc công bố trên bất kỳ phƣơng tiện truyền thông nào. Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Ngô Thị Duyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài......................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 3 4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 3 5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5 1.1.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .............................................. 5 1.1.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 5 1.1.2.Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ...................................................... 7 1.2. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu. ....................................... 8 1.2.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum ................................. 8 1.2.1.1. Vị trí phân loại của A. xylinum ................................................... 8 1.2.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum ................................... 8 1.2.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A. xylinum............................ 9 1.2.2 . Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi Acetobacter xylinum ........ 9 1.2.2.1. Cấu trúc ...................................................................................... 9 1.2.2.2. Đặc tính của màng BC.............................................................. 10 1.2.2.3. Chức năng sinh lý của BC ........................................................ 11 1.2.2.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................... 11 1.2.3. Sơ lƣợc về Curcumin ...................................................................... 12 1.2.3.1. Tìm hiểu về Curcumin............................................................... 12 1.2.3.2. Dược tính của Curcumin .......................................................... 13 1.2.3.3. Hạn chế của Curcumin ............................................................. 14 1.2.4.Tình hình nghiên cứu về Curcumin ................................................. 15 1.2.4.1. Trên thế giới.............................................................................. 15 1.2.4.2. Tại Việt Nam ............................................................................. 16 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 18 2.2.1. Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn .................................................... 18 2.2.2. Chuẩn bị màng BC .......................................................................... 20 2.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng đệm PBS (Phosphat buffered saline)-PBS 1X ................................................................................................................... 22 2.3.4. Chế tạo màng BC nạp Curcumin .................................................... 22 2.3.5. Xác định lƣợng Curcumin nạp vào màng BC................................. 23 2.3.6. Xác định lƣợng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc Curcumin................................................................................................... 24 2.3.7. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả ......................................... 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 26 3.1. Nghiên cứu về độ dày màng ................................................................. 26 3.2. Tinh chế màng BC ................................................................................ 27 3.3. Thu màng BC nạp Curcumin ................................................................ 28 3.4. Giải phóng thuốc từ màng BC .............................................................. 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 38 1.Kết luận ..................................................................................................... 38 2.Kiến nghị: .................................................................................................. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 39 PHỤ LỤC .......................................................................................................... 1 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng trong nƣớc vo gạo ................................... 12 Bảng 2.1. Nồng độ Curcumin và giá trị OD427nm (n = 3) ................................ 19 Bảng 2.2. Môi trƣờng lên men tạo màng BC .................................................. 20 Bảng 2.3. Môi trƣờng đệm PBS ...................................................................... 22 Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tƣơi .............................................................. 26 Bảng 3.2. Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi hấp thụ thuốc (OD) (n = 3) ....... 28 Bảng 3.3. Lƣợng thuốc hấp thụ vào màng BC (n = 3) .................................... 29 Bảng 3.4. Nồng độ Curcumin và giá trị quang phổ (OD) thu đƣợc (n = 3): .. 32 Bảng 3.5. Gía trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc (n = 3) ........... 33 Bảng 3.6. Tỉ lệ giải phóng thuốc (n = 3) ......................................................... 34 Bảng 3.7. Hệ số tƣơng quan (R2), tốc độ giải phóng (K) của hai độ dày màng BC.................................................................................................................... 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của BC: chuỗi polime ß-1,4-glucopyranose không phân nhánh ........................................................................................... 10 Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn Curcumin ........................................................ 19 Hình 3.1. Màng BC khi lên men ..................................................................... 26 Hình 3.2. Màng BC tinh chế ........................................................................... 28 Hình 3.3. Màng BC khi cho vào dung dịch Curcumin 5% ............................. 30 Hình 3.4. Màng BC sau khi nạp thuốc Curcumin ........................................... 30 Hình 3.5. Màng BC sau 8 giờ giải phóng thuốc ............................................. 31 Hình 3.6. Màng BC sau 24 giờ giải phóng thuốc ........................................... 31 Hình 3.7. Đƣờng chuẩn hồi quy của Curcumin .............................................. 32 Hình 3.8. Đồ thị giải phóng thuốc của Curcumin của màng BC .................... 33 Hình 3.9. Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc của màng BC ..................................... 35 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quá trình tạo màng BC .................................................................. 20 Sơ đồ 2.2. Quy trình nuôi cấy thu nhận BC .................................................... 21 Sơ đồ 3.1. Quy trình tinh chế màng BC .......................................................... 27 BẢNG VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng Việt A. xylinum Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum BC Bacterial cellulose Cellulose vi khuẩn E. coli Escherichia coli Vi khuẩn đại tràng OD Optical Density Mật độ quang phổ MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hiện nay, Acetobacter xylinum (A. xylinum) cũng nhƣ bacterial cellulose (BC) là đối tƣợng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nƣớc cũng nhƣ nƣớc ngoài. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC đƣợc tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. BC là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng A. xylinum. BC đƣợc tạo thành từ A. xylinum có cấu trúc hóa học rất giống cellulose của thực vật nhƣng có một số tính chất lý hóa đặc biệt nhƣ: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nƣớc cao, sức căng lớn, trọng lƣợng thấp, ổn định về kích thƣớc và hƣớng, đƣờng kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao và độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy bởi enzyme [5], … Vì vậy BC là một loại nguyên liệu mới, đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ thực phẩm, công nghệ giấy, mỹ phẩm, … đặc biệt trong lĩnh vực y học. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả rõ rệt, khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của thuốc ở dạng thông thƣờng. Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của hàng loạt các loại thuốc đã đƣợc nghiên cứu, cụ thể là lidocaine, ibuprophen, caffeine, diclofenac và sulfadiazine bạc cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có độ bền và trƣơng nở tƣơng tự nhƣ da ngƣời; hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và di chuyển của tế bào da của con ngƣời Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC nạp thuốc là khả năng chữa lành vết thƣơng, đặc tính bảo vệ, khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan. Hầu hết các chế phẩm đắp qua da 1 đƣợc sản xuất bởi các vật liệu khác nhau. Do đó, một hệ thống nạp thuốc có khả năng giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí. Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da không có triệu chứng toàn thân đƣợc khuyến cáo tránh sử dụng các chế phẩm kháng sinh thƣờng đƣợc dùng rộng rãi toàn thân nhƣ penicilin, sulfonamid, streptomycin, gentamicin, ... do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc. Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng sinh bôi trên da. Curcumin có nhiều tác dụng trong việc điều trị ung thƣ, đau dạ dày, có khả năng mạnh mẽ giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ và làm tăng hồng cầu, … Ngoài ra Curcumin còn là một trong những chất chống viêm, chống oxi hóa điển hình. Nó không chỉ điều trị đắc lực cho các bệnh ung thƣ, đau dạ dày, tá tràng, … mà còn điều trị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả cao các bệnh rối loạn hệ miễn dịch nhƣ viêm toàn thân, viêm đa khớp, viêm lõi cầu khớp, bệnh đa sơ cứng, bệnh cứng bì, loãng xƣơng, … Tuy nhiên, Curcumin cũng giống nhƣ các chất oxi hóa khác, là con dao hai lƣỡi có nhiều tác dụng thì cũng có nhiều hạn chế. Nhiều nghiên cứu đã thấy Curcumin có khả năng thẩm thấu qua da thấp, nhanh bị khô trên bề mặt da [1, 2, 3], … Từ các nghiên cứu về màng BC và một số hạn chế của Curcumin trong điều trị kháng viêm trên da, xét thấy đây là hƣớng nghiên cứu mới và triển vọng. Đó là lí do em đã chọn đề tài: “Nghiên cứu hệ thống vận tải và phân phối thuốc Curcumin của màng bacterial cellulose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua da”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và thu sản phẩm BC từ A. xylinum từ đó chế tạo hệ thống vận tải và phân phối thuốc dựa trên màng BC nhằm khắc 2 phục đƣợc hạn chế của thuốc, tạo hệ giải phóng thuốc kéo dài, có thể giúp tăng lƣợng thuốc hấp thụ vào cơ thể để thuốc phát huy đƣợc hiệu quả tốt nhất trong việc chữa trị bệnh và làm đẹp. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Sự vận tải và phân phối thuốc Curcumin của màng bacterial cellulose qua da. - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu invitro (nghiên cứu ngoài cơ thể). - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý ngƣời và động vật trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. 4. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế, tạo màng BC, nạp Curcumin vào màng. - Thử nghiệm tác dụng của màng BC nạp Curcumin trong quá trình phân phối thuốc định hƣớng sử dụng qua da. Đánh giá sự vận tải và phân phối thuốc của màng BC. 5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn  Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC Về mặt khoa học thì việc nghiên cứu ứng dụng màng BC vào việc khắc phục hạn chế của thuốc Curcumin sẽ mở ra một hƣớng nghiên cứu mới không chỉ dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn. Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra đƣợc những ƣu nhƣợc điểm của màng BC để từ đó có những hƣớng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng BC, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh vực khác nhau.  Ý nghĩa thực tiễn 3 + Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng BC từ chủng A. xylinum + Từ màng BC đã đƣợc tạo ra đƣợc dùng làm hệ thống vận tải và phân phối thuốc + Từ kết quả nghiên cứu đƣợc có thể áp dụng vào thực tiễn. 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1.1.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới màng Bacterial cellulose (BC) đã đƣợc ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau. Tác giả Brown (1989), dùng màng BC làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad (1998) dùng màng nhƣ là một chất để chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [9]. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời [9]. Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng BC trong vận tải và phân phối thuốc đã đƣợc báo cáo [6], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng BC và 7 với các vật liệu Nanocomposite. Nhƣ vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục đƣợc tiến hành nghiên cứu. Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của thuốc ở dạng thông thƣờng [9]. Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu đƣợc sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã đƣợc tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S.aureus và B.subtilis. 5 Sợi BC với các hạt Nano bạc đã sản xuất thành công lên đến 99,99% hoạt tính kháng khuẩn chống lại E.coli và S.Aureus [22]. Nghiên cứu khác cho thấy việc sử dụng Nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [16]. Các S-enantiomer của propranolol, một loại thuốc chống cao huyết áp, có đƣợc giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate, và đã thử nghiệm invivo cho kết quả tốt [7, 10]. Một miếng dán có thể giải phóng thuốc enantiomeric đã đƣợc chứng minh bằng cách sử dụng một bể chứa gel và polyme in dấu phân tử (MIP) màng. Nghiên cứu về gel miếng dán gồm của chitosan và poloxamer chứng minh rằng sau 8 giờ, Cmax của S-propranolol đã đạt đƣợc (8,0 ± 1,0 ng/ml) từ một hồ chứa 1,5 mg propranolol racemic [13]. Tiềm năng vận tải và phân phối thuốc của màng BC qua da đã đƣợc nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không đƣợc chiếu xạ. BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hƣởng của BC chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC không chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng thuốc qua màng [6]. Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine [20, 21], ibuprophen [21], caffeine [18], diclofenac [17] và sulfadiazine bạc [12] cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt da. Tất cả 5 loại thuốc trên đã đƣợc thử nghiệm invitro cho thẩm thấu qua da [13] và so sánh với cách thức thông thƣờng. Kết quả cho thấy ibuprofen là chất ƣu mỡ thấm qua màng BC cao hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400; lidocaine hydrochloride thẩm thấu qua màng chậm hơn ibuprofen, do màng BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc đƣợc kéo dài và làm giảm tỷ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thƣờng, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc 6 mà không gây tình trạng quá mẫn [21]. Luan J. et al. (2012) [12], đã nghiên cứu màng BC cho băng vết thƣơng nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến đƣợc sử dụng trong điều trị vết thƣơng nhiễm khuẩn do bỏng. Nó đã đƣợc chứng minh rằng sau khi sử dụng màng BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine, hoạt động kháng khuẩn đối với P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi thông thƣờng. 1.1.2.Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bƣớc đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu nhƣ mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật-Vi sinh Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn đƣợc chủng A. xylinum có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bƣớc đầu cho thấy màng BC từ chủng A. xylinum có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho ngƣời [5]. Tại Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng nhóm nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [5] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng BC từ A. xylinum đạt hiệu quả cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm invivo trong ứng dụng màng BC điều trị bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn. Mong muốn khắc phục đƣợc một số tác dụng phụ của thuốc Curcumin trong việc làm đẹp, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm đƣợc chi 7 phí. Màng BC có thể tự sản xuất trong nƣớc từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo hệ thống vận tải và phân phối thuốc Curcumin. 1.2. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu. 1.2.1. Đặc điểm phân loại của A. xylinum 1.2.1.1. Vị trí phân loại của A. xylinum A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae [15]. Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào. Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc [15]:  Lớp: Schizomycetes  Bộ: Pseudomonadales  Bộ phụ: Pseudomonadieae  Họ: Pseudomonadaceae 1.2.1.2. Đặc điểm vi khuẩn A. xylinum A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc ngang khoảng 0,6-0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhƣng khi tế bào già hay do điều kiện môi trƣờng nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [15]. Trong môi trƣờng nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3-7 ngày nuôi cấy, sẽ thu đƣợc khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đƣờng kính hạt từ 2-5 mm, tròn, nhày, rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong. Nhƣng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô dần [15]. 8 1.2.1.3. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn A. xylinum A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ƣu cho vi khuẩn phát triển từ 25-30°C. Ở nhiệt độ 37°C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ thích hợp nhất là 25°C [11]. Vi khuẩn tăng trƣởng trong khoảng pH từ 3-8, pH tối ƣu để sản xuất cellulose là 5,5 . Nghiên cứu gần đây của Maccormick và cộng sự cho rằng A. xylinum có khả năng chịu đƣợc hàm lƣợng EtOH lên đến 10%. A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đƣờng khác nhau, tùy thuộc vào chủng mà lƣợng đƣờng có thể thay đổi, nhƣng đƣờng hay đƣợc sử dụng và cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đƣờng cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [11]. A. xylinum có thể tích tụ acid acetic trong môi trƣờng nuôi cấy. Các tế bào vi khuẩn kháng lại đƣợc sự thay đổi pH của môi trƣờng. Trong lúc nuôi cấy môi trƣờng có thể giảm đi từ 1-2 đơn vị do sự tạo ra acid acetic, acid gluconic, do đó khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, ngƣời ta thƣờng bổ sung acid acetic vào môi trƣờng [11]. Trong môi trƣờng nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đƣờng để chuyển hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trƣờng. Sau 36-48 giờ lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7-10 ngày [11]. 1.2.2 . Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A. xylinum 1.2.2.1. Cấu trúc Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer ß-1,4glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật (plant cellulose-PC), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [19]. 9 Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của BC: chuỗi polime ß-1,4glucopyranose không phân nhánh Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đƣờng kính 1,5 nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3-8 nm [19]. Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. (Watanabe et al.,1998a; Yamanaka et al.,2000). Khi nuôi cấy theo phƣơng pháp tĩnh, A. xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên bề mặt môi trƣờng. Màng BC thu đƣợc dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng. BC đƣợc tạo ra từ phƣơng pháp nuôi cấy tĩnh gọi là S-BC (S-BC: Static-Bacterial cellulose) trong đó chuỗi ß-1,4-glucogan xếp song song quanh trục. Các sợi cellulose sơ cấp đƣợc đẩy ra từ các lỗ nằm trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, các sợi sơ cấp này kết tinh lại thành các vi sợi đƣợc đẩy ra bên ngoài môi trƣờng nuôi cấy và các dãy cellulose tạo nên các mặt phẳng song song có vai trò chống đỡ cho tế bào A. xylinum [19]. 1.2.2.2. Đặc tính của màng BC Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trƣờng dinh dƣỡng lỏng thành lớp màng mỏng nhƣ da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tƣơng tự nhƣ giấy da với độ dày 0,01-0,5 nm. Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt nhƣ: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ 10 thƣờng, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn. Với các tính chất này BC đƣợc ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học [5]. 1.2.2.3. Chức năng sinh lý của BC A. xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào, những tế bào vi khuẩn này nằm trong mạng lƣới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt môi trƣờng và thu nhận chất dinh dƣỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn không nằm trong mạng lƣới polymer [5]. Cellulose có các đặc tính nhƣ độ bền cơ học cao, tính thấm và hút cao, trạng thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trƣờng nhƣ việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lƣợng nƣớc bị giảm đi, các chất chuyển hóa đƣợc sinh ra [5]. 1.2.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn dinh dƣỡng cần thiết nhƣ nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng [11]. A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose, fructose, manitol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, glactose, lactose, sucrose cho hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate. Việc sử dụng các loại đƣờng cũng nhƣ nồng độ các loại đƣờng trong môi trƣờng còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [11]. Nhu cầu sử dụng đƣờng của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhƣ: rỉ đƣờng, nƣớc dừa già, nƣớc mía, ... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A. xylinum. 11