Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( Melia Azedarach L,) phục vụ chuyển Gen

  • Số trang: 30 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 26 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp Më ®Çu 1. Lý do chän ®Ò tµi Xoan ta (Melia azedarach L.) lµ c©y th©n gç, sím rông l¸, thuéc hä xoan (Meliaceae), cã nguån gèc ë Ên ®é, miÒn nam Trung Quèc vµ Australia. Xoan ta ®−îc ph©n bè ë nhiÒu n−íc nh− ViÖt Nam, Lµo, Campuchia. Riªng ë ViÖt Nam tõ B¾c vµo Nam hÇu nh− tØnh nµo còng thÊy sù hiÖn diÖn cña c©y xoan ta, chóng mäc tù nhiªn hoÆc ®−îc trång thµnh rõng [18]. Xoan ta lµ mét trong nh÷ng c©y trång quan träng trong chiÕn l−îc ph¸t triÓn l©m nghiÖp, ®−îc trång ë 6 trong sè 9 vïng sinh th¸i l©m nghiÖp, trong ®ã cã c¸c vïng: vïng §ång b»ng s«ng hång, vïng Trung du, vïng T©y b¾c, vïng Nam trung bé, vïng T©y nguyªn, vïng §«ng nam bé [18]. Xoan ta ®øng ®Çu trong danh môc c¸c c©y trång ®−îc −u tiªn ph¸t triÓn theo quyÕt ®Þnh sè 16/2005/ Q§BNN ngµy 15/03/2005 cña bé tr−ëng bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n [26]. Xoan ta lµ loµi c©y gç lín cã thÓ cao ®Õn 30m, ®−êng kÝnh gÇn 100cm. Gç xoan cã lâi mµu hång hay n©u nh¹t, d¸c x¸m tr¾ng, gç nhÑ, v©n thí ®Ñp, nÕu ®−îc ng©m tÈm th× ®©y lµ lo¹i gç kh¸ bÒn vµ khã bÞ mèi mät, cho nªn gç xoan th−êng ®−îc dïng ®Ó x©y dùng, trang trÝ néi thÊt, ®iªu kh¾c [18]. V× lµ mét loµi c©y mang nhiÒu gi¸ trÞ kinh tÕ nªn hiÖn nay c©y xoan ®ang khuyÕn khÝch trång vµ ngµy cµng më réng diÖn tÝch. §Ó ®¸p øng nhu cÇu s¶n xuÊt th× cÇn ®−a ra c¸c gièng míi cã ®Æc ®iÓm nh− kh¸ng bÖnh, chèng chÞu c¸c ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr−êng, cã chÊt l−îng gç tèt, sinh tr−ëng ph¸t triÓn nhanh. C«ng nghÖ chuyÓn gen ®· dÇn trë thµnh nh©n tè mang tÝnh ch×a kho¸ ®Ó gi¶i quyÕt c¸c vÊn ®Ò trªn. Tuy nhiªn, ®Ó thùc hiÖn ®−îc viÖc chuyÓn gen th× ph¶i cã mét hÖ thèng t¸i sinh c©y hoµn chØnh. Víi môc ®Ých t¹o ra c©y xoan ta cã chÊt l−îng gç tèt, kh¶ n¨ng sinh tr−ëng, ph¸t triÓn nhanh nhê chuyÓn gen th× tr−íc tiªn cÇn ph¶i thiÕt lËp ®−îc hÖ thèng t¸i sinh xoan ta invitro ®¹t hiÖu suÊt cao. V× vËy chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi: “Nghiªn cøu hÖ thèng t¸i sinh xoan ta (Melia azedarach L.) phôc vô chuyÓn gen”. 2. Môc ®Ých nghiªn cøu DiÖpThÞ Lan 1 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp T¹o ra hÖ thèng t¸i sinh c©y xoan ta invitro hoµn chØnh phôc vô chuyÓn gen b»ng c¸ch t¹o ®a chåi tõ th©n mÇm, l¸ mÇm. 3. Néi dung nghiªn cøu ChuÈn bÞ c¸c m«i tr−êng nu«i cÊy kh¸c nhau ®Ó ®¸nh gi¸: Kh¶ n¨ng c¶m øng t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm Kh¶ n¨ng c¶m øng t¹o côm chåi tõ th©n mÇm Kh¶ n¨ng kÝch thÝch kÐo dµi chåi Kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ ra c©y Sau ®ã t×m ra m«i tr−êng thÝch hîp nhÊt cho sù t¸i sinh cña c©y 4. ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi §©y lµ h−íng nghiªn cøu míi øng dông c«ng nghÖ gen vµo c¶i tiÕn gièng xoan ta. ViÖc x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh c©y xoan ta hoµn chØnh lµ b−íc ®ét ph¸ quan träng trong quy tr×nh chän t¹o gièng míi cung cÊp cho c¸c ®¬n vÞ trång rõng, nh»m ph¸t triÓn rõng nguyªn liÖu cã n¨ng suÊt cao phÈm chÊt gç tèt. Néi dung DiÖpThÞ Lan 2 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp Ch−¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1.1. C¸c ®Æc ®iÓm tù nhiªn cña c©y xoan ta Lµ c©y th©n gç ph©n bè ë nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi nh− ViÖt Nam, Trung Quèc, Lµo ... ë ViÖt Nam chóng mäc tù nhiªn hoÆc ®−îc trång thµnh rõng [19]. Xoan ta lµ lo¹i c©y th−êng rông l¸ vµo mïa ®«ng, th©n th¼ng, t¸n l¸ th−a, vá mµu n©u x¸m. Hoa nhá, ®Òu, l−ìng tÝnh, cã mïi th¬m h¾c víi 5 c¸nh hoa cã mµu tÝm nh¹t hoÆc tÝm hoa cµ, mäc thµnh côm (h×nh 1). H×nh 1: ¶nh cµnh xoan mang hoa ®ang në [23] Qu¶ h¹ch cã mµu vµng nh¹t khi chÝn, treo trªn c©y suèt mïa ®«ng vµ cã nh©n mµu tr¾ng (h×nh 2) [21]. DiÖpThÞ Lan 3 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp H×nh 2: ¶nh cµnh xoan mang qu¶ [23] L¸ dµi ®Õn 50 cm mäc so le, cuèng l¸ víi 2 hoÆc 3 lÇn l¸ phøc mäc ®èi, l¸ chÐt mÐp cã r¨ng c−a [21]. HÖ rÔ ngang kh¸ ph¸t triÓn, th−êng ¨n n«ng vµ lan réng, rÔ cäc ¨n s©u. Xoan th−êng ph©n cµnh sím, kh¶ n¨ng ®©m chåi nhanh nªn cã thÓ lîi dông t¸i sinh chåi ®−îc [23]. ` Xoan lµ c©y nguyªn s¶n ë c¸c vïng nhiÖt ®íi ¸ vµ nhiÖt ®íi ch©u ¸. Xoan −a s¸ng, sinh tr−ëng nhanh, sau khi trång tõ 6-8 n¨m cã thÓ thu ho¹ch ®−îc. Xoan −a khÝ hËu nãng Èm cã 2 mïa: mïa m−a vµ mïa kh«, l−îng m−a hµng n¨m tõ 1000 mm trë lªn, nh÷ng vïng cã thÓ chÞu ®−îc h¹n víi l−îng m−a hµng n¨m lµ 500 mm [23]. Xoan sinh tr−ëng trªn nhiÒu lo¹i ®Êt kh¸c nhau nh−ng thÝch hîp nhÊt lµ ®Êt pha c¸t, ®Êt phï sa ven s«ng cã ®é ph× cao vµ s©u Èm. Xoan cã thÓ chÞu ®−îc muèi, l−îng muèi trong ®Êt tõ 0,4-0,5%, ®Êt chua cã ®é PH 5-6, h¬i kiÒm. Nh÷ng n¬i ®Êt b¹c mµu, kh« h¹n hoÆc óng n−íc ®Òu kh«ng thÝch hîp víi xoan [23]. Xoan cã kh¶ n¨ng t¸i sinh (mäc l¹i tõ gèc cò ®· thu ho¹ch) tõ 3-4 lÇn [18]. DiÖpThÞ Lan 4 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp C©y trång 3 - 4 n¨m ®· b¾t ®Çu cho qu¶. Chän nh÷ng c©y mÑ tõ 10 - 20 tuæi mäc tõ h¹t, cã th©n th¼ng, ph©n cµnh cao, t¸n l¸ ®Òu, Ýt cµnh ngang, kh«ng s©u bÖnh ®Ó thu h¸i h¹t lµm gièng [23]. Khi gieo ng©m h¹t trong n−íc Êm kho¶ng 450C trong 8h. NhiÖt ®é thÝch hîp cho sù n¶y mÇm lµ 16-220C, l−îng m−a trung b×nh tõ 1700-2000 mm [19], [20]. Xoan lµ c©y th−êng ph©n cµnh sím, v× vËy ®Ó thóc ®Èy c©y sinh tr−ëng, ph¸t triÓn nhanh vÒ ®−êng kÝnh, chiÒu cao vµ t¹o ra ®o¹n th©n sö dông dµi, cÇn tiÕn hµnh ch¨m sãc nh−: lµm cá, xíi ®Êt, vun gèc kÕt hîp víi bãn ph©n ®Çy ®ñ cho c©y ®ång thêi thùc hiÖn tØa cµnh nh©n t¹o ngay tõ khi c©y 1,5 - 3 tuæi. Sau tuæi nµy kh«ng nªn tØa th−a n÷a v× lóc nµy cµnh ®· lín viÖc tØa th−a dÔ lµm c©y bÞ rçng ruét [23]. Xoan ®©m chåi rÊt m¹nh, c¶ chåi th©n vµ chåi rÔ do vËy cã thÓ t¹o c©y chåi sau khi khai th¸c. Kinh nghiÖm nh©n d©n cho biÕt gç c©y mäc tõ chåi th−êng th¼ng, ch¾c h¬n mäc tõ h¹t nhÊt lµ nh÷ng c©y mäc tõ chåi rÔ [23]. 1.2. ý nghÜa kinh tÕ cña c©y xoan Gç xoan thuéc nhãm gç V, cã lâi mµu hång hay n©u nh¹t, d¸c x¸m tr¾ng, gç nhÑ mÒm tØ träng 0,565, lùc kÐo ngang thí 22kg/cm2, nÐn däc thí 339kg/cm2 [18]. Gç xoan nhÑ nh−ng kh¸ bÒn Ýt bÞ mèi mät, mÒm rÊt dÔ bµo nh½n, c−a xÎ tr¹m træ, nh−ng cã nh−îc ®iÓm lµ dÔ nøt. NÕu ®−îc ng©m n−íc tõ 5 - 6 th¸ng th× trë nªn rÊt bÒn vµ khã bÞ mèi mät cho nªn gç xoan th−êng ®−îc dïng trong x©y dùng nhµ cöa, ®ãng ®å gia dông, trang trÝ néi thÊt vµ dïng trong ®iªu kh¾c [23]. Than vµ cñi xoan cung cÊp mét l−îng nhiÖt lín. Ngoµi ra l¸, rÔ xoan cßn dïng lµm ph©n xanh, thuèc s¸t trïng, h¹t cã thÓ Ðp dÇu ch÷a mét sè bÖnh, trång xoan ®Ó che bãng vµ phßng hé …[18]. Víi ®Æc ®iÓm sinh ho¸ nh− trªn còng nh− cã gi¸ trÞ vÒ nhiÒu mÆt nªn xoan lµ loµi c©y trång l©m nghiÖp cã nhiÒu tiÒm n¨ng ph¸t triÓn réng r·i. 1.3. T×nh h×nh trång xoan ë n−íc ta Theo quyÕt ®Þnh cña Bé n«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n ViÖt Nam sè 16/2005/Q§- BNN ngµy 15/03/2005 DiÖpThÞ Lan 5 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp Danh môc c¸c loµi c©y chñ yÕu cho trång rõng s¶n xuÊt theo 9 vïng sinh th¸i l©m nghiÖp.Trong ®ã c¸c vïng trång xoan nh−: vïng T©y b¾c gåm c¸c tØnh Lai Ch©u, §iÖn Biªn, S¬n La, Hßa B×nh; vïng Trung du (TD) gåm 6 tØnh: Lào Cai, Yªn B¸i, Hà Giang, Tuyªn Quang, Phó Thä, VÜnh Phóc; vïng ®ång b»ng s«ng H«ng (§BSH) gåm 10 tØnh: H¶i Phßng, H¶i D−¬ng, B¾c Ninh, H−ng Yªn, Hµ Néi, Hµ T©y, Th¸i B×nh, Nam §Þnh, Hµ Nam, Ninh B×nh; vïng B¾c Trung Bé (BTB) gåm 6 tØnh: Thanh Hãa, NghÖ An, Hµ TÜnh, Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ, Thõa Thiªn HuÕ; vïng Nam Trung Bé (NTB) gåm 7 tØnh: Qu¶ng Nam, Qu¶ng Ng·i, B×nh §Þnh, Phó Yªn, Kh¸nh Hßa, Ninh ThuËn, B×nh ThuËn; vïng T©y Nguyªn (TN) gåm 5 tØnh: L©m §ång, §¾k N«ng, §¾c L¾c, Gia Lai, Kon Tum; vïng §«ng Nam Bé gåm 6 tØnh: Bµ RÞa - Vòng Tµu, §ång Nai, B×nh D−¬ng, B×nh Ph−íc, T©y Ninh, Tp Hå ChÝ Minh; vïng T©y Nam Bé (TNB) gåm 12 tØnh: Long An, BÕn Tre, §ång Th¸p, Sãc Tr¨ng, VÜnh Long, CÇn Th¬,TiÒn Giang, B¹c Liªu, Cµ Mau, Kiªn Giang, An Giang, Trµ Vinh [26]. 1.4. C¸c ph−¬ng ph¸p kü thuËt øng dông trong c¶i tiÕn di truyÒn gièng xoan 1.4.1. C¸c kü thuËt truyÒn thèng Ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng nh− gieo h¹t, hom rÔ nh−ng kh¶ n¨ng cung cÊp víi sè l−îng lín, ®óng mïa vô trång gÆp nhiÒu khã kh¨n. MÆt kh¸c do ph−¬ng ph¸p nh©n gièng b»ng h¹t cã nhiÒu nh−îc ®iÓm nh−: Thêi gian b¶o qu¶n ng¾n kho¶ng 6 - 7 th¸ng C©y sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn kh«ng ®ång ®Òu do cã sù ph©n li trong di truyÒn Kh¶ n¨ng kh¸ng s©u bÖnh cña c©y thÊp [18]. 1.4.2. Kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt Ta thÊy c©y xoan cã nhiÒu tiÒm n¨ng ph¸t triÓn réng kh¾p c¸c tØnh. Khi diÖn tÝch trång xoan t¨ng ®ång nghÜa víi viÖc t¨ng nguån gièng. §Ó kh¾c phôc nh−îc ®iÓm cña nh©n gièng b»ng h¹t vµ hom rÔ nªn trong thêi gian qua trung t©m øng dông tiÕn bé khoa häc vµ c«ng nghÖ ®· øng dông thµnh c«ng kü thuËt nh©n gièng v« tÝnh c©y xoan b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo nh»m gi¶i quyÕt nh÷ng khã kh¨n trªn [18]. DiÖpThÞ Lan 6 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp TÝnh −u viÖt cña c©y xoan cÊy m« lµ: ®¶m b¶o ®Æc tÝnh di truyÒn, Ýt tho¸i ho¸, c©y cã kh¶ n¨ng sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn nhanh, cã ®é ®ång ®Òu cao, ®¶m b¶o l−îng lín c©y trång ®óng thêi vô [18]. Cã thÓ nãi ®©y lµ mét b−íc ®ét ph¸ quan träng nh»m gi¶i quyÕt khã kh¨n vÒ nhiÒu mÆt, ®ång thêi s¶n xuÊt cung øng gièng cho c¸c ®¬n vÞ trång rõng kü thuËt, ph¸t triÓn rõng nguyªn liÖu, ®¶m b¶o chÊt l−îng, n©ng cao n¨ng suÊt c©y trång [18]. 1.5. C¬ së kÜ thuËt cña nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt 1.5.1. TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ ph¹m trï kh¸i niÖm chung cho tÊt c¶ c¸c lo¹i nu«i cÊy c¸c nguyªn liÖu (tÕ bµo, m«, ph«i...) thùc vËt hoµn toµn s¹ch c¸c vi sinh vËt trªn m«i tr−êng dinh d−ìng nh©n t¹o trong ®iÒu kiÖn v« trïng [1]. C«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ mét trong nh÷ng c«ng nghÖ quan träng cña c«ng nghÖ sinh häc, lµ nÒn t¶ng ®Ó nghiªn cøu vµ øng dông c¸c c«ng nghÖ kh¸c trong lÜnh vùc c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt [1]. C«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®−îc tiÕn hµnh ë n−íc ta tõ nh÷ng n¨m 1960 t¹i miÒn Nam vµ nh÷ng n¨m 1970 t¹i miÒn B¾c. Tuy nhiªn chØ tõ cuèi nh÷ng n¨m 1980 trë l¹i ®©y c«ng nghÖ m« tÕ bµo míi ph¸t triÓn m¹nh mÏ vµ nhanh chãng, nhiÒu phßng thÝ nghiÖm, nghiªn cøu ®· ®−îc x©y dùng vµ triÓn khai ë hÇu kh¾p c¸c tØnh thµnh trong c¶ n−íc [ 22]. C¬ së nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo, ®iÒu nµy lÇn ®Çu tiªn ®−îc haberlandt (1902) ®Ò cËp, «ng cho r»ng: mçi tÕ bµo bÊt kú cña c¬ thÓ ®a bµo ®Òu tiÒm tµng kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thµnh mét c¸ thÓ hoµn chØnh. Theo quan ®iÓm cña sinh häc hiÖn ®¹i th× mçi tÕ bµo riªng rÏ ®· ph©n ho¸ ®Òu mang toµn bé th«ng tin di truyÒn cña toµn bé c¬ thÓ. Trong ®iÒu kiÖn thÝch hîp, mçi tÕ bµo ®Òu cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh, ®ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo. TÝnh toµn n¨ng lµ c¬ së cña ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m«, tÕ bµo thùc vËt, trªn c¬ së ®ã ng−êi ta ®· t¹o ®−îc mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ [1]. HiÖn nay, ng−êi ta ®· thùc hiÖn ®−îc kh¶ n¨ng t¹o ra ®−îc mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ [1]. DiÖpThÞ Lan 7 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp 1.5.2. Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n hãa cña tÕ bµo C¬ thÓ thùc vËt tr−ëng thµnh lµ mét tæng thÓ thèng nhÊt bao gåm nhiÒu c¬ quan kh¸c nhau, cã chøc n¨ng kh¸c nhau vµ ®−îc h×nh thµnh tõ nhiÒu lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau. Tuy nhiªn, tÊt c¶ c¸c lo¹i tÕ bµo ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo hîp tö ban ®Çu. TÕ bµo hîp tö lóc ®Çu ph©n chia thµnh khèi tÕ bµo ch−a chuyªn hãa. C¸c tÕ bµo ch−a chuyªn hãa nµy tiÕp tôc ph©n chia thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn ho¸ ®Æc tr−ng cho c¸c m«, c¬ quan cã chøc n¨ng kh¸c nhau. §ã lµ hiÖn t−îng ph©n ho¸ tÕ bµo. Tuy nhiªn, c¸c tÕ bµo chuyªn hãa thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn biÖt l¹i kh«ng mÊt sù hoµn toµn biÕn ®æi cña m×nh. Trong nh÷ng ®iÒu kiÖn thÝch hîp nhÊt ®Þnh chóng cã thÓ trë thµnh d¹ng tÕ bµo nh− tÕ bµo ban ®Çu, nghÜa lµ ë d¹ng tÕ bµo ch−a chuyªn ho¸. HiÖn t−îng nµy gäi lµ hiÖn t−îng ph¶n ph©n hãa tÕ bµo [1]. Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n hãa tÕ bµo lµ mét qu¸ tr×nh ho¹t hãa, øc chÕ ho¹t ®éng cña c¸c gen. Trong mét giai ®o¹n ph¸t triÓn nhÊt ®Þnh cña c©y, mét sè gen nµo ®ã ®ang ë tr¹ng th¸i øc chÕ kh«ng ho¹t ®éng ®−îc ho¹t hãa ®Ó cho ra mét tÝnh tr¹ng biÓu hiÖn míi. Ng−îc l¹i mét sè gen l¹i bÞ øc chÕ ®×nh chØ ho¹t ®éng. Qu¸ tr×nh ho¹t hãa, øc chÕ diÔn ra theo mét ch−¬ng tr×nh ®· ®−îc lËp s½n trong cÊu tróc gen cña tÕ bµo, gióp cho sù sinh tr−ëng, ph¸t triÓn cña c¬ thÓ tÕ bµo thùc vËt ®−îc hµi hßa. Sù ho¹t ®éng hµi hoµ cña tÕ bµo vµ m« c¬ quan cßn phô thuéc vµo tÕ bµo n»m trong khèi m«, c¬ quan cña c¬ thÓ. Khi t¸ch riªng tõng tÕ bµo, hoÆc lµm gi¶m kÝch th−íc khèi m« sÏ t¹o ®iÒu kiÖn cho viÖc ho¹t hãa c¸c gen cña tÕ bµo [1]. KÜ thuËt nu«i cÊy m«, tÕ bµo thùc chÊt lµ ®iÒu khiÓn ph¸t triÓn sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña tÕ bµo thùc vËt mét c¸ch cã ®Þnh h−íng dùa vµo sù ph©n hãa vµ ph¶n ph©n hãa cña tÕ bµo thùc vËt. §Ó ®iÒu khiÓn sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña tÕ bµo, ng−êi ta bæ sung vµo m«i tr−êng nu«i cÊy hai nhãm ®iÒu hoµ sinh tr−ëng thùc vËt lµ auxin vµ cytokinin. Tû lÖ hµm l−îng cña 2 nhãm chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng nµy trong m«i tr−êng nu«i cÊy m« kh¸c nhau sÏ ®Þnh h−íng cho sù ph¸t sinh h×nh th¸i (ph¸t sinh chåi, rÔ hoÆc m« sÑo) cña m« nu«i cÊy kh¸c nhau. Trong m«i tr−êng nu«i cÊy, tû lÖ nång ®é auxin/cytokinin (®¹i diÖn lµ IAA/KIN) lµ thÊp th× nu«i cÊy ph¸t sinh theo h−íng t¹o chåi, tû lÖ nµy cao th× m« nu«i cÊy DiÖpThÞ Lan 8 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp sÏ t¹o ra m« sÑo. M« sÑo lµ d¹ng tÕ bµo ch−a ph©n ho¸ ph©n chia liªn tôc vµ cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh ph«i, chåi vµ c©y hoµn chØnh [1]. 1.6. Nu«i cÊy m« xoan 1.6.1. L−îc sö nu«i cÊy m« xoan Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®· ®−îc tiÕn hµnh trªn nhiÒu ®èi lo¹i c©y nh−: l¹c, ®Ëu t−¬ng, cµ chua, hoa loa kÌn, xoan... vµ ®· ®¹t ®−îc nh÷ng kÕt qu¶ nhÊt ®Þnh ®Ó phôc vô cho nhiÒu môc ®Ých cña con ng−êi vÝ dô nh− phôc vô cho chuyÓn gen, nh©n gièng ®Ó b¶o tån c¸c gièng quý... [3], [4], [5], [7], [8]. N«ng V¨n H¶i, Lª Xu©n §¾c, Hµ Hång H¶i, §µo ThÞ Thu Hµ, NguyÔn Thanh Danh, Lª ThÞ Xu©n, Lª TrÇn B×nh ®· x©y dùng ®−îc thµnh c«ng quy tr×nh nh©n nhanh invitro c©y Mµng tang ®Ó b¶o tån gièng quý [4]. NguyÔn ThÞ Ph−¬ng Th¶o, NguyÔn Quang Th¹ch, Hoµng ThÞ Mai ®· nghiªn cøu nh©n nhanh gièng hoa loa kÌn b»ng kü thuËt nu«i cÊy invitro nh»m t¹o ra nhiÒu gièng cung øng cho c¸c nhµ s¶n xuÊt [8]. §èi víi ®èi t−îng lµ ®Ëu t−¬ng NguyÔn ThÞ Nh−, §ç TiÕn Ph¸t, Lª ThÞ Muéi, §inh ThÞ Phßng ®· nghiªn cøu ®−îc hÖ thèng t¸i sinh c©y qua ph«i soma ®èi víi gièng §T12. HiÖu suÊt t¸i sinh ®¹t 39% vµ sè ph«i trung b×nh lµ 7,5. §©y lµ b−íc ®Çu ®Ó cã thÓ nghiªn cøu viÖc chuyÓn gen nh»m n©ng cao n¨ng suÊt vµ chÊt l−îng cña c¸c s¶n phÈm tõ ®Ëu t−¬ng[5]. Ngoµi ra ng−êi ta cßn nghiªn cøu quy tr×nh t¸i sinh c©y l¹c, c©y cµ chua phôc vô chuyÓn gen [3], [7]. Xoan lµ mét ®èi t−îng c©y l©m nghiÖp quan träng vµ ®· ®−îc nghiªn cøu nhiÒu. Cho ®Õn nay ®· cã nhiÒu c«ng tr×nh cña nhiÒu nhµ khoa häc nghiªn cøu vÒ t¸i sinh xoan phôc vô chuyÓn gen nh−: Ahmad vµ céng sù 1990, Thakur vµ céng sù 1998, Vila vµ céng sù 2003-2005, míi ®©y nhÊt lµ Sharry vµ céng sù 2006 [10], [13], [15], [16]. N¨m 1998 Thakur vµ céng sù ®· nghiªn cøu t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm vµ ®¹t tØ lÖ t¹o ®a chåi lµ 74% trong 7-9 tuÇn nu«i cÊy [15]. N¨m 2005 Vila vµ céng sù ®· nghiªn cøu t¸i sinh chåi tõ rÔ xoan ta víi viÖc sö dông 0,44 μM BAP cho tØ lÖ t¹o côm chåi lµ 66,8% kh«ng cã chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng tØ lÖ t¹o côm chåi lµ 40,3% [16]. DiÖpThÞ Lan 9 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp N¨m 2006 Sharry vµ Teixeira dasilva sö dông BAP kÕt hîp víi NAA trong viÖc c¶m øng t¹o chåi vµ ®· t¹o ®−îc 160-200 chåi/g mÉu cÊy [16]. ë ViÖt Nam, theo b¸o c¸o n¨m 2007 cña Hå V¨n Gi¶ng tr−êng §¹i häc L©m nghiÖp ®· tuyÓn chän ®−îc 15 c©y tréi cã s¶n l−îng gç cao lÊy mÉu nu«i cÊy m«. §ang x¸c ®Þnh chØ tiªu chÊt l−îng cã liªn quan ®Õn s¶n l−îng vµ chÊt l−îng gç. §· t¹o ®−îc mÉu s¹ch invitro xoan ta, b−íc ®Çu ®· x¸c ®Þnh ®−îc lo¹i vËt liÖu nu«i cÊy t¹o ph«i soma vµ côm chåi, ®· t¸i sinh ®−îc ph«i soma vµ côm chåi. HiÖn ®ang tiÕn hµnh nghiªn cøu tiÕp ®Ó hoµn thiÖn quy tr×nh kÜ thuËt t¸i sinh c©y xoan ta th«ng qua ph«i soma vµ ®a chåi [25]. N¨m 2007 theo b¸o c¸o cña §oµn ThÞ Mai ViÖn khoa häc L©m nghiÖp ViÖt Nam ®· tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm nh©n gièng sinh d−ìng b»ng nu«i cÊy m« cho 36 dßng, b−íc ®Çu ®· t×m ra ®−îc m«i tr−êng thÝch hîp cho tõng dßng, hÖ sè nh©n chåi ®¹t tõ 5,5 – 9,2 chåi/ côm chåi [24]. Nghiªn cøu ra rÔ chåi xoan ta Sharry vµ Teixeira dasilva (2006), sö dông IBA ë nång ®é thÊp 0,049μM tØ lÖ chåi ra rÔ chØ ®¹t 17% nh−ng khi sö dông NAA ë nång ®é thÊp 0,054μM th× tØ lÖ ra rÔ thu ®−îc 100% sau 6 tuÇn nu«i cÊy [13]. 1.6.2. ¶nh h−ëng cña c¸c thµnh phÇn m«i tr−êng ®Õn nu«i cÊy m« xoan Thµnh phÇn v« c¬ bao gåm c¸c muèi kho¸ng (c¶ ®a l−îng vµ vi l−îng) ®−îc ®−a vµo m«i tr−êng nu«i cÊy. Nhu cÇu vÒ muèi kho¸ng cña tÕ bµo vµ m« thùc vËt t¸ch rêi lµ kh«ng kh¸c nhiÒu so víi yªu cÇu cña c©y ®−îc trång trong ®iÒu kiÖn tù nhiªn. Trong thµnh phÇn muèi kho¸ng ®a l−îng c¸c nguyªn tè ph¶i cung cÊp lµ nit¬, kali, photpho…[2]. Nit¬ v« c¬ ®−îc ®−a vµo m«i tr−êng ë 2 d¹ng lµ nitrat (NO3-) vµ amon ( NH4+ ). §a sè c¸c m«i tr−êng cã chøa d¹ng nitrat nhiÒu h¬n amon. Theo Narayanas Wamy (1994) hµm l−îng nitrat trong nhiÒu m«i tr−êng kho¶ng 25μM cßn cña amon tõ 2 - 20 μM [2]. Trong m«i tr−êng MS amon ®−îc cung cÊp ë d¹ng muèi NH4NO3,, cßn m«i tr−êng B5 cña Gramborg cã amon ë d¹ng muèi (NH4)2SO4 - c¸c gèc nitrat ®−îc ®−a vµo m«i tr−êng d−íi d¹ng muèi nitrat canxi, nitrat kali hoÆc nitrat amon. Khi m«i tr−êng chØ chøa nit¬ ë d¹ng dÔ g©y kiÒm ho¸ m«i tr−êng v× thÕ DiÖpThÞ Lan 10 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp Yªu cÇu vÒ muèi kho¸ng vi l−îng cña m« thùc vËt trong nu«i cÊy kh¸ phøc t¹p vµ Ýt ®−îc nghiªn cøu. Tuy nhiªn trong nhiÒu lo¹i m«i tr−êng c¬ b¶n ®· ®−îc x©y dùng, c¸c t¸c gi¶ ®Òu cung cÊp cho m«i tr−êng hÇu hÕt c¸c nguyªn tè vi l−îng cÇn thiÕt nh»m môc ®Ých ®Ó thóc ®Èy sù sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn cña mÉu nu«i cÊy [2]. S¾t ®−îc ®−a vµo m«i tr−êng d¹ng muèi FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3. Nh−ng chóng sÏ bÞ kÕt tña vµ mÉu nu«i cÊy rÊt khã hÊp thô c¸c lo¹i muèi nµy do ®ã ph¶i cho thªm vµo m«i tr−êng nu«i cÊy Na2EDTA (sodium ethyline diamine tetra acetate) ®Ó t¹o muèi phøc Na2FeEDTA (d¹ng selat) cã ch−a Na, Fe vµ ®−îc m« nu«i cÊy hÊp thô dÔ dµng [2]. Ngoµi ra c¸c thµnh phÇn h÷u c¬ còng cã ¶nh h−ëng tíi nu«i cÊy m«. Nguån cacbon cung cÊp cho mÉu nu«i cÊy chÝnh lµ ®−êng sucrose, maltose...®−îc sö dông trong m«i tr−êng. Bªn c¹nh vai trß lµ nguån n¨ng l−îng, vËt chÊt c¬ b¶n, ®−êng cßn t¹o ra mét ¸p lùc thÈm thÊu gióp cho m« cã sù c©n b»ng cÇn thiÕt víi m«i tr−êng nu«i cÊy [2]. C¸c t¸c nh©n t¹o g el: quyÕt ®Þnh tr¹ng th¸i vËt lý cña m«i tr−êng nu«i cÊy. C¸c m«i tr−êng chøa ®ñ hµm l−îng chÊt t¹o gel lµm cho chóng ®«ng l¹i ë nhiÖt ®é b×nh th−êng (25 - 30oC) [2]. ChÊt gel ®−îc sö dông phæ biÕn lµ agar (thạch) gåm mét sè polysaccharide ®−îc lÊy tõ rong biÓn. C¸c polysaccharide kÕt hîp víi c¸c ph©n tö n−íc t¹o thµnh polymer vµ ®«ng l¹i thµnh gel ë nhiÖt ®é 450C. Hµm l−îng agar sö dông kho¶ng 0,5 - 10% tuú theo chÊt l−îng cña chóng vµ lo¹i m«i tr−êng ®−îc sö dông. NÕu nhiÒu qu¸ g©y h¹n chÕ kh¶ n¨ng trao ®æi chÊt gi÷a c¬ thÓ víi m«i tr−êng [2]. Mét sè tr−êng hîp ng−êi ta cßn bæ sung Adenin nång ®é 40 - 80mg/lit. 1.6.3. ¶nh h−ëng cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ®Õn nu«i cÊy m« xoan DiÖpThÞ Lan 11 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng cã vai trß quan träng trong kÜ thuËt nu«i cÊy m« thùc vËt. B»ng c¸ch cung cÊp c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ë mét møc thÝch hîp ng−êi nghiªn cøu cã thÓ ®iÒu khiÓn ®−îc chiÒu h−íng ph¸t sinh h×nh th¸i cña mÉu nu«i cÊy. Auxin vµ cytokinin lµ 2 chÊt ®−îc sö dông phæ biÕn nhÊt. Ngoµi ra ng−êi ta cßn sö dông gibberellin [6]. HiÖu qu¶ t¸c ®éng cña chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng phô thuéc vµo nång ®é sö dông, ho¹t tÝnh vèn cã cña chóng vµ mÉu nu«i cÊy. Auxin cã hiÖu qu¶ kÝch thÝch sù sinh tr−ëng cña tÕ bµo, cïng víi cytokinin lµm t¨ng ph©n bµo, h¹n chÕ −u thÕ ®Ønh, kÝch thÝch sù h×nh thµnh rÔ vµ tham gia vµo c¶m øng ph«i v« tÝnh [6]. C¸c lo¹i Auxin th−êng sö dông trong nu«i cÊy lµ: IAA - Indole acetic acid IBA - Indole butyric acid NOA - Naphthoxy acetic acid NAA - Naphthalene acetic acid 2,4D - 2,4 dichlorophenoxy acetic cid IAA Ýt ®−îc sö dông do kÐm bÒn víi nhiÖt vµ ¸nh s¸ng, nh÷ng tr−êng hîp cã bæ sung IAA vµo m«i tr−êng nghiªn cøu th× ph¶i dïng ë nång ®é cao 1,0 - 30mg/l (Dodds anh Roberts 1990) [2]. Theo Thakur vµ céng sù (2004), Vila vµ céng sù (2005) víi viÖc sö dông m«i tr−êng MS bæ sung thªm IBA ë nång ®é cao vµo giai ®o¹n tiÒn c¶m øng sÏ t¨ng c−êng kh¶ n¨ng ra rÔ chåi xoan ta invitro [15], [16], [17]. C¸c auxin kh¸c cã hµm l−îng sö dông tõ 0,1 - 2,0 mg/lit - chóng cã hiÖu qu¶ sinh lý ë nång ®é thÊp. Tuú lo¹i auxin hµm l−îng sö dông vµ ®èi t−îng nu«i cÊy mµ t¸c ®éng sinh lý cña auxin lµ kÝch thÝch sinh tr−ëng cña m«, ho¹t ho¸ sù h×nh thµnh rÔ hay thóc ®Èy sù ph©n chia m¹nh mÏ cña tÕ bµo dÉn ®Õn h×nh thµnh m« sÑo (callus) [2]. Cytokinin kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo, sù h×nh thµnh vµ sinh tr−ëng cña chåi invitro. C¸c cytokinin cã biÓu hiÖn øc chÕ sù t¹o rÔ vµ sù sinh tr−ëng cña m« sÑo nh−ng cã ¶nh h−ëng d−¬ng tÝnh râ rÖt ®Õn ph¸t sinh ph«i v« tÝnh cña mÉu nu«i cÊy [6]. DiÖpThÞ Lan 12 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp C¸c lo¹i cytokinin th−êng dïng lµ: Kinetin (KIN), zeatin, 6Bentyl amino purin (6BAP), Isopentenyl adenin (Zip) [2]. Kinetin ®−îc nhµ khoa häc Skoog ph¸t hiÖn ngÉu nhiªn trong khi chiÕt xuÊt axit nucleic, kinetin thùc chÊt lµ mét dÉn xuÊt cña baz¬ nit¬ adenin. BAP lµ cytokinin ®−îc tæng hîp nh©n t¹o cã ho¹t tÝnh m¹nh h¬n kinetin [6]. Theo b¸o c¸o cña Joarder vµ céng sù (1993) BAP thùc chÊt lµ ®iÒu hoµ sinh tr−ëng rÊt tèt cho viÖc ph¸t sinh chåi c©y neem [17]. BAP ®−îc sö dông ë nång ®é 0,44 μM ®· cho tØ lÖ t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm lµ 66,8%, BAP tèt h¬n c¸c cytokinin kh¸c trong viÖc c¶m øng ph¸t sinh chåi ë c©y gç [14], [16]. BAP ë nång ®é 4,44 μM kÝch thÝch c¶m øng t¹o ph«i soma ®¹t tØ lÖ cao nhÊt. Hµm l−îng sö dông c¸c lo¹i cytokinin dao ®éng tõ 0,1 - 2,0 mg/lit. ë nh÷ng nång ®é cao h¬n cytokinin kÝch thÝch râ rÖt sù h×nh thµnh chåi bÊt ®Þnh ®ång thêi øc chÕ m¹nh sù t¹o thµnh rÔ cña chåi nu«i cÊy. Trong c¸c lo¹i cytokinin nãi trªn th× KIN vµ BAP lµ 2 lo¹i ®−îc sö dông réng r·i h¬n c¶ [2]. Trong nu«i cÊy cã lo¹i mÉu chØ cÇn auxin hoÆc cytokinin hoÆc kh«ng cÇn c¶ 2, ®a sè c¸c tr−êng hîp sö dông phèi hîp c¶ auxin vµ cytokinin ë nh÷ng tr−êng hîp tû lÖ kh¸c nhau [2]. T¸c ®éng phèi hîp cña auxin vµ cytokinin cã t¸c dông quyÕt ®Þnh ®èi víi sù ph¸t triÓn vµ ph¸t sinh h×nh th¸i cña m«, tÕ bµo. Nh÷ng nghiªn cøu cña Skoog cho thÊy tû lÖ auxin/cytokinin cao th× thÝch hîp cho sù h×nh thµnh rÔ, tû lÖ thÊp sÏ kÝch thÝch qu¸ tr×nh ph¸t sinh chåi. NÕu tû lÖ nµy ë møc ®é c©n b»ng th× thuËn lîi cho ph¸t triÓn m« sÑo. Das (1958) vµ Nitsel (1968) kh¼ng ®Þnh r»ng chØ khi t¸c ®éng ®ång thêi cña auxin vµ cytokinin th× míi kÝch thÝch m¹nh mÏ sù tæng hîp ADN, liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh ph©n chia tÕ bµo [9]. 1.6.4. ¶nh h−ëng cña c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy C¸c mÉu nu«i cÊy th−êng ®−îc ®Æt trong phßng nu«i æn ®Þnh vÒ ¸nh s¸ng vµ nhiÖt ®é. TÊt c¶ c¸c tÕ bµo m« nu«i cÊy ®Òu cÇn ¸nh s¸ng trõ mét sè tr−êng hîp nu«i cÊy t¹o m« sÑo, nh−ng trong qu¸ tr×nh t¸i sinh vµ nh©n gièng cña chóng DiÖpThÞ Lan 13 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp 1.6.5. ¶nh h−ëng cña pH PH cña ®a sè m«i tr−êng nu«i cÊy ®Òu ®−îc ®iÒu chØnh trong ph¹m vi tõ 5,5 - 6.0. PH d−íi 5,5 lµm cho agar khã chuyÓn sang tr¹ng th¸i gel cßn pH > 6,0 agar cã thÓ rÊt cøng. NÕu trong thµnh phÇn m«i tr−êng nu«i d−ìng cã GA3 th× ph¶i ®iÒu chØnh gi¸ trÞ pH cña ph¹m vi nãi trªn. V× pH qu¸ kiÒm hoÆc qu¸ acid, GA3 sÏ chuyÓn sang d¹ng kh«ng cã ho¹t tÝnh (Vanbrapt and piert 1971). Trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy, pH cña m«i tr−êng cã thÓ gi¶m xuèng do mét sè mÉu thùc vËt s¶n sinh ra c¸c axit h÷u c¬ [2]. DiÖpThÞ Lan 14 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp Ch−¬ng 2: VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. VËt liÖu nghiªn cøu 2.1.1. VËt liÖu thùc vËt Qu¶ xoan ta thu h¸i vµ chän läc tõ nh÷ng c©y tréi ®−îc trung t©m gièng vµ c«ng nghÖ sinh häc, viÖn sinh th¸i rõng vµ m«i tr−êng, §¹i häc l©m nghiÖp cung cÊp. Sau ®ã lo¹i bá phÇn thÞt qu¶ b»ng c¬ giíi vµ t¸ch lÊy h¹t lµm vËt liÖu nu«i cÊy. 2.1.2. Dông cô vµ ho¸ chÊt thÝ nghiÖm C¸c ®iÒu kiÖn m¸y mãc vµ ho¸ chÊt ®−îc phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt - ViÖn c«ng nghÖ sinh häc cung cÊp. M«i tr−êng nu«i cÊy, m«i tr−êng c¬ b¶n MS ®−îc sö dông trong nghiªn cøu gåm c¸c muèi ®a l−îng vµ vi l−îng theo Murashige vµ Skoog Dông cô: nåi khö trïng, tñ cÊy, b×nh tam gi¸c, pipet, lß vi sãng, tñ sÊy, m¸y chuÈn pH.... Ho¸ chÊt: m«i tr−êng MS, m«i tr−êng B5 theo Gamborg, sucrose, 8gam agar/lit, pH = 5,8 ( b¶ng 1). DiÖpThÞ Lan 15 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp B¶ng 1: Thµnh phÇn m«i tr−êng MS (theo Murashige vµ Skoog) STT Thµnh phÇn Nång ®é Muèi kho¸ng 1 NH4N03 1650 mg/lit 2 KN03 1900 mg/lit 3 CaCl2.2H20 440 mg/lit 4 MgS04.7H20 370 mg/lit 5 KH2P04 170 mg/lit 6 H3B03 6,2 mg/lit 7 MnS04.4H20 22,3 mg/lit 8 ZnS04.7H20 8,6 mg/lit 9 KI 0.83 mg/lit 10 Na2Mo04.2H20 0,25 mg/lit 11 CuS04.5H20 0,025 mg/lit 12 CoCl2.6H20 0,025 mg/lit 13 Na2EDTA 37,3 mg/lit 14 FeS04.7H20 27,8 mg/lit C¸c chÊt h÷u c¬ vµ vitamin 15 Myo - Inositol 100 mg/lit 16 Nicotinic acid 0,5 mg/lit 17 Vitamin B1 0,5 mg/lit 18 Vitamin B6 0,1 mg/lit 19 Glycine 2,0 mg/lit 20 sucrose 30 g/lit 21 Agar 8 g/lit pH 5,6 B B DiÖpThÞ Lan 16 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp 2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu Khö trïng m«i tr−êng vµ dông cô nu«i cÊy ë nhiÖt ®é 1210C, ¸p suÊt 1,5 atm trong 15 phót. Nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 25 ± 20C c−êng ®é ¸nh s¸ng 3000 lux víi thêi gian chiÕu s¸ng 16h/ngµy. T¸i sinh côm chåi b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt gåm c¸c b−íc theo s¬ ®å [27]. C©y gièng trong v−ên gièng ®Çu dßng Khö trïng M«i tr−êng MS c¨n b¶n Chåi con trong èng nghiÖm CÊy chuyÓn M«i tr−êng nh©n chåi Côm chåi M«i tr−êng nh©n chåi M«i tr−êng v−¬n th©n C©y con chuÈn bÞ ra rÔ M«i tr−êng ra rÔ C©y con hoµn chØnh Nhµ huÊn luyÖn DiÖpThÞ Lan ¦¬m c©y trong v−ên −¬m 17 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp Chóng t«i tiÕn hµnh t¸i sinh côm chåi tõ l¸ mÇm, th©n mÇm theo c¸c b−íc nh− sau: V« trïng mÉu T¹o côm chåi KÐo dµi chåi KÐo dµi rÔ vµ hoµn thiÖn c©y con invitro §−a c©y ra nhµ l−íi 2.2.1. Khö trïng mÉu vµ chuÈn bÞ nguyªn liÖu t¹o chåi H¹t ®−îc s¸t khuÈn bÒ mÆt b»ng ethanol trong 3 phót. Khö trïng b»ng javen 60% trong 30 phót (l¾c m¹nh). Lo¹i bá javen vµ röa s¹ch b»ng n−íc cÊt v« trïng 5 lÇn. H¹t sau khi khö trïng ®−îc nu«i cÊy trªn m«i tr−êng dinh d−ìng MS bæ sung thªm sucrose víi mËt ®é 15 h¹t/b×nh tam gi¸c 250 ml. 2.2.2. C¶m øng t¹o côm chåi Sau 3 tuÇn nu«i cÊy h¹t n¶y mÇm, ph©n l¸ mÇm ®−îc c¾t bá viÒn l¸ vµ c¾t ®«i, phÇn th©n mÇm c¾t thµnh nh÷ng ®o¹n nhá cã kÝch th−íc 4 -5 mm cÊy lªn m«i tr−êng MS bæ sung thªm vitamin B5 (Gamborg vµ céng sù 1968) vµ 3% sucrose + 0,44 - 13,32 μM, 6BAP+ + 0,46 μM KIN nu«i cÊy trong 4 tuÇn. 2.2.3. KÝch thÝch kÐo dµi chåi C¸c chåi ®−îc t¸i sinh ra tõ côm chåi vµ cÊy chuyÓn sang m«i tr−êng kÝch thÝch kÐo dµi chåi MS bæ sung thªm vitamin B5 + 3% sucrose + 0,44 - 2,22 μM BAP + 0,3 μM GA3 nu«i cÊy trong 4 tuÇn. 2.2.4. Kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ ra c©y hoµn thiÖn c©y con invitro C¸c chåi ®¹t chiÒu dµi 20 – 30 mm ®Çu tiªn ®−îc cÊy lªn m«i tr−êng tiÒn c¶m øng t¹o rÔ MS bæ sung thªm 2% sucrose + 12,30 mM IAB nu«i cÊy trong 4 ngµy vµ sau ®ã cÊy sang m«i tr−êng MS cã bæ sung thªm 1% sucrose, kh«ng bæ sung chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng. Nu«i tiÕp trong 4 tuÇn ®Ó kÐo dµi rÔ. 2.2.5. §−a c©y ra nhµ l−íi C©y m« hoµn chØnh ®−îc ®−a ra nhµ l−íi, trång trªn gi¸ thÓ trÊu hun 100%, trÊu hun pha c¸t tØ lÖ 1:1, c¸t 100% trong vßng 2 tuÇn ®Çu ¸nh s¸ng trùc x¹. TÊt c¶ m«i tr−êng nu«i cÊy ®Òu ®−îc chuÈn ®é pH = 5,8 vµ bæ sung thªm agar DiÖpThÞ Lan 18 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp 2.2.5. Ph−¬ng ph¸p xö lÝ sè liÖu thùc nghiÖm Sè liÖu ®−îc xö lÝ ®¸nh gi¸ theo ph−¬ng ph¸p to¸n thèng kª trªn m¸y tÝnh nhê phÇn mÒm Excel - 2003 víi c¸c th«ng sè trung b×nh sè häc, ®é lÖch chuÈn, hÖ sè biÕn ®éng, sai sè cña trung b×nh sè häc, sai sè cña hiÖu c¸c trung b×nh sè häc, tiªu chuÈn ®é tin cña hiÖu. Trung b×nh sè häc: 1 n = X n ∑ X (X − i= 0 i δ y δ x δ = C V = m m d td = δ = X ) 2 n − 1 * 1 0 0 X δ n = m d m 2 1 + m 2 2 d DiÖpThÞ Lan 19 Líp K31A Tr−êng §HSP Hμ Néi 2 Kho¸ luËn tèt nghiÖp Ch−¬ng 3: KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. Kh¶ n¨ng c¶m øng côm chåi tõ l¸ mÇm Nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng BAP vµ KIN, NAA lªn kh¶ n¨ng c¶m øng t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm c©y xoan ta, kÕt qu¶ thu ®−îc ghi ë b¶ng 2 nh− sau: B¶ng 2: ¶nh h−ëng cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ®Õn kh¶ n¨ng c¶m øng t¹o côm chåi tõ m¶nh l¸ mÇm sau 4 tuÇn nu«i cÊy. PhÇn tr¨m BAP KIN NAA M¶nh (μM) (μM) (μM) cÊy t¹o chåi - - - 0/92 0 0 0,44 - - 0/97 0 0 2,22 - - 5/89 5,6 1,5 ± 0,2 4,44 - - 81/90 90,0 6,8 ± 0,1 6,66 - - 86/90 91,5 6,2 ± 0,4 90/96 93,8 5,8 ± 0,3 8,88 m¶nh cÊy C håi/m¶nh cÊy t¹o chåi 11,10 - - 72/85 84,7 5,5 ± 0,2 13,32 - - 61/76 80,3 5,0 ± 0,1 2,22 0,46 - 7/97 7,2 1,7 ± 0,3 4,44 0,46 - 84/86 97,7 7,0 ± 0,8 6,66 0,46 - 95/97 98,0 7,3 ± 0,8 8,88 0,46 - 85/92 92,4 6,0 ± 0,9 4,44 - 2,68 9/71 12,7 1,2 ± 0,0 6,66 - 2,68 9/74 12,2 1,0 ± 0,0 8,88 - 2,68 31/92 37,0 2,5 ± 0,5 11,10 - 2,68 26/97 26,8 2,2 ± 0,2 Ghi chó: (-) kh«ng cã chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng DiÖpThÞ Lan 20 Líp K31A
- Xem thêm -