Tài liệu Nghiên cứu hệ gen của virus cúm ah5n1 phân lập từ gà nuôi tại hậu giang tóm tắt

1 MỞ ðẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc ñộ lây lan nhanh, với tỷ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Bệnh gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm từ ñộng vật sang người. Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần ñầu tiên tại Việt Nam năm 2003. Trong một thời gian rất ngắn, bệnh ñã lây lan trên toàn bộ ñất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế quốc dân; và từ ñó ñến nay bệnh xảy ra liên tục trở thành một vấn ñề dịch tễ phức tạp cần giải quyết tại nước ta. Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến ñổi, tái tổ hợp biến chủng và thay ñổi cấu trúc kháng nguyên ñể thích ứng gây bệnh. Trình tự nucleotide hệ gen là cơ sở ñể xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các biến chủng virus cúm A/H5N1. Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung cấp thông tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm. Thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide và amino acid có thể xác ñịnh những vùng gen thường biến ñổi, vùng gen ổn ñịnh làm cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1 xuất hiện từ những năm ñầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại vaccine thích hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm. ðể có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ ñó làm cơ sở dữ liệu cho những nghiên cứu về gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 và nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứng dụng trong chẩn ñoán và phòng bệnh, chúng tôi tiến hành ñề tài: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang. MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI (1) Giải mã ñược toàn bộ hệ gen gồm 8 phân ñoạn của một chủng virus cúm A/H5N1 từ gà nuôi tại Hậu Giang. (2) Phân tích ñược một số ñặc ñiểm sinh học phân tử của hệ gen nhằm thu ñược thêm dữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine phòng bệnh hiệu quả. 2 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI - ðây là luận án nghiên cứu khá ñầy ñủ, có hệ thống về sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi tại Hậu Giang. - Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu khoa học về virus cúm A/H5N1. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI - Kết quả nghiên cứu của ñề tài giúp hiểu biết thêm về tính ña dạng của virus cúm. Trên cơ sở ñó góp phần xây dựng phương pháp chẩn ñoán và lựa chọn vaccine phòng bệnh phù hợp. - Kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm ñầu tiên dịch xuất hiện ở vùng ñồng bằng sông Cửu Long. NHỮNG ðÓNG GÓP MỚI CỦA ðỀ TÀI (1) Giải trình tự và nghiên cứu hoàn chỉnh, có hệ thống hệ gen của một chủng virus cúm A/H5N1 thuộc thể ñộc lực cao (HPAI) phân lập từ gà tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu chủng là CkHG4) trong ñợt dịch cúm gia cầm lần ñầu tiên xuất hiện ồ ạt ở Việt Nam. (2) ðã phân tích ñặc ñiểm gen học hệ gen/gen của chủng CkHG4, bao gồm trình tự nucleotide/amino acid, cấu trúc, ñồng nhất/tương ñồng; so sánh với các chủng trong vùng và thế giới. (3) ðã làm sáng tỏ mối quan hệ phả hệ, nguồn gốc và tương quan gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 cường ñộc dòng Quảng ðông (chủng CkHG4), góp phần hiểu biết thêm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và ñóng góp dữ liệu cho ñối chiếu với các vaccine sử dụng tại Việt Nam. (4) ðã khảo sát và xác ñịnh ñược các cặp mồi sử dụng có hiệu quả ñể thu nhận và giải trình tự hệ gen của virus cúm A/H5N1 thuộc những phân dòng lần ñầu tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN: luận án gồm 159 trang (không kể phần phụ lục), chia thành các phần như sau: Mở ñầu (3 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (52 trang), Chương 2: Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (66 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Các công trình ñã công bố liên quan ñến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (21 trang). Luận án có 31 bảng biểu, 28 hình minh họa. Tổng số tài liệu tham khảo là 170, gồm 32 tài liệu tiếng Việt, 138 tài liệu tiếng Anh (có 3 trang web). 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM Cúm gia cầm (avian influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. ðây là nhóm virus có biên ñộ chủ rộng, ñược phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 ñến H16) và 9 phân type NA (từ N1 ñến N9). Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể ñộc lực cao xuất hiện ở vùng Quảng ðông, Trung Quốc năm 1996 và ñã lan ra hơn 60 nước trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi, ñược chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ ñộng vật sang người. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 lần ñầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003, từ ñó ñến nay bệnh xảy ra liên tục, ñang là vấn ñề dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải giải quyết tại nước ta. 1.2. HỆ GEN CỦA VIRUS CÚM A Hệ gen virus cúm A là RNA sợi ñơn âm, bao gồm 8 phân ñoạn gen riêng biệt mang tên từ 1-8, mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus gồm: PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2). Các phân ñoạn 1, 2 và 3 là những phân ñoạn mã hoá tổng hợp các enzym trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có ñộ dài ổn ñịnh và có tính bảo tồn cao bao gồm: - Phân ñoạn 1 (gen PB2) mã hoá tổng hợp protein enzym PB2, có kích thước 2341 bp. - Phân ñoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2341 bp, mã hoá tổng hợp enzym PB1. - Phân ñoạn 3 (gen PA) là phân ñoạn gen bảo tồn cao, mã hoá tổng hợp protein enzym PA, có kích thước 2233 bp. Các phân ñoạn 4 và 6 mã hoá cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên ñặc trưng theo từng chủng virus cúm A, bao gồm: - Phân ñoạn 4 (gen HA) có ñộ dài thay ñổi tùy theo từng chủng virus cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 - 1707 bp). ðây là gen chịu trách nhiệm mã hoá tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt của virus cúm. - Phân ñoạn 6 (gen NA) là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có chiều dài thay ñổi theo từng chủng 4 virus cúm A (ở A/H1N1 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay ñổi khoảng từ 1350 1410 bp). Các phân ñoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có ñộ dài tương ñối ổn ñịnh giữa các chủng virus cúm A, bao gồm: - Phân ñoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), kích thước khoảng 1565 bp. - Phân ñoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hoá cho protein ñệm (matrix protein) gồm hai tiểu phần là M1 và M2 ñược tạo ra bởi những khung ñọc mở khác nhau của cùng một phân ñoạn RNA. - Phân ñoạn 8 (gen NS) là gen mã hoá protein không cấu trúc, có ñộ dài ổn ñịnh nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hoá tổng hợp hai protein là NS1 và NS2. Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1) có hệ gen ñược cấu trúc từ 8 phân ñoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các ñột biến ñiểm trong các phân ñoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao ñổi các phân ñoạn gen giữa các chủng virus cúm ñồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn ñến thay ñổi ñặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới. 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM A/H5N1 TẠI VIỆT NAM Nghiên cứu ñặc tính sinh học phân tử (ñịnh týp, biến ñổi di truyền và gen học tiến hoá) của virus gây bệnh cúm gia cầm H5N1 ñược các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng ñầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Các chuỗi gen giúp xác ñịnh phân týp H5, phân týp N1 và các gen cấu trúc ñã ñược Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Trung tâm chẩn ñoán thú y trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen. Các nhà khoa học Việt Nam kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới xây dựng các phương pháp chẩn ñoán, phát hiện nhanh virus gây bệnh, phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA và NA. Các phương pháp phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử cũng ñã ñược xây dựng. Các nhà khoa học Việt Nam ñã có những ñóng góp nhất ñịnh trong lĩnh vực nghiên cứu vaccine và miễn dịch. Những chế phẩm kháng nguyên, vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam cũng ñã ñược tạo ra. 5 6 Những kết quả nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm và người trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam ñã và ñang làm sáng tỏ thêm về mối quan hệ tiến triển bệnh học lây nhiễm, dịch tễ học phân tử, phát triển tiến hoá và genotype, và kháng nguyên-miễn dịch-vaccine của cúm gia cầm tại Việt Nam. 2.5.3 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR Sản phẩm RT-PCR ñược kiểm tra bằng cách ñiện di ở 100-120V, 400 mA trong 25-30 phút trên thạch agarose 1%. Chỉ thị DNA sử dụng trong nghiên cứu là DNA thực khuẩn thể Lamda, có kích thước 43 kb, ñược cắt bằng enzym giới hạn HindIII. 2.5.4 Phương pháp dòng hóa Sản phẩm PCR/RT-PCR tinh sạch ñược dòng hóa vào vector là pCR2.1 hay pCR2.1TOPO (Invitrogen). 2.5.5 Phương pháp giải trình tự Sản phẩm giải trình tự sau khi tinh sạch, ñược ñông khô và ñọc trình tự trên máy tự ñộng ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ). 2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản ñồ chromatogram của chuỗi nucleotide thô bằng chương trình SeqEd1.03, sau ñó sử dụng chương trình AsemblyLIGN1.9 ñể so sánh các chuỗi, phân tích thành phần nucleotide và amino acid hoặc các ñặc tính gen và polypeptide bằng hệ chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. Các chuỗi nucleotide hay amino acid ñược sắp xếp và tính toán mức ñộ tương ñồng bằng chương trình GeneDoc 2.5; phân tích và xây dựng phả hệ bằng chương trình MEGA4.0. CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ðối tượng nghiên cứu của ñề tài là virus cúm A/H5N1 từ gà mắc bệnh cúm gia cầm nuôi tại tỉnh Hậu Giang, Việt Nam, phân lập năm 2005. 2.2 ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ðề tài ñược tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Thời gian thực hiện ñề tài: từ tháng 10/2005 ñến tháng 10/2009. 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1 Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4) phân lập từ gà Hậu Giang - Giải trình tự gen kháng nguyên HA và NA - Giải trình tự gen polymerase PB2, PB1 và PA - Giải trình tự các gen NP, M và NS 2.3.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới - Phân tích thành phần nucleotide và amino acid. - Phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid. - Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ. 2.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Nguyên liệu nghiên cứu là dịch khí quản - phế quản chứa virus cường ñộc cúm A/H5N1 thu nhận từ gà bị bệnh tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu chủng: A/Ck/Vietnam/HG4/2005(H5N1), viết tắt CkHG4). Bệnh phẩm ñã ñược vô hoạt ở nhiệt ñộ 100oC trong 30 giây, ñảm bảo an toàn sinh học, bảo quản ở -20oC cho ñến khi sử dụng ñể tách RNA tổng số. 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số Sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN) ñể tách RNA tổng số theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.5.2 Phương pháp RT-PCR Chúng tôi sử dụng phản ứng RT-PCR một bước (QIAGEN) ñể thu nhận các phân ñoạn gen của virus cúm A/H5N1. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS CÚM A/H5N1 CHỦNG CkHG4 3.1.1 Giải trình tự gen H5 (HA) ðể thu nhận gen kháng nguyên H5 (HA) của chủng CkHG4 chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR trực tiếp với khuôn là RNA tổng số có chứa RNA hệ gen của virus cúm A/H5N1. Plasmid tái tổ hợp sau khi giải trình tự chúng tôi thu ñược chuỗi gen H5 (HA) gồm 1707 nucleotide của chủng CkHG4 và ñăng ký trong Ngân hàng gen số EF051513. 3.1.2 Giải trình tự gen N1 (NA) DNA plasmid tái tổ hợp ñược giải trình tự, thu nhận chuỗi DNA của gen N1 (NA) chủng CkHG4 gồm 1350 nucleotide và ñăng ký trong Ngân hàng gen số EF057803. 3.1.3 Giải trình tự gen PB2 Phân ñoạn 1 của hệ gen virus cúm A/H5N1 mã hóa cho protein PB2 gồm 759 amino acid. Do phân ñoạn 1 có kích thước 2355 bp nên không thể bằng một phản ứng RT-PCR ñể nhân lên ñược mà phải thực hiện 2 phản ứng RT-PCR thu 2 ñoạn lồng vào nhau. Cặp mồi PB2F-PB2R1 7 8 ñược sử dụng ñể thu nhận ñoạn ñầu và cặp mồi PB2F3-PB2R dùng ñể thu nhận ñoạn sau của phân ñoạn 1 (gen PB2). Sản phẩm cuối cùng gồm 2 ñoạn DNA: phần ñầu của phân ñoạn 1 có kích thước khoảng 1kb (cặp mồi PB2F-PB2R1), và phần sau của phân ñoạn 1 có ñộ dài khoảng 1,4 kb (cặp mồi PB2F3-PB2R). DNA plasmid tái tổ hợp sau ñó ñược giải trình tự, sắp xếp nối chuỗi và phân tích bằng các chương trình tin-sinh học chuyên biệt, chúng tôi thu ñược chuỗi DNA của gen PB2 gồm 2280 nucleotide. 3.1.4 Giải trình tự gen PB1 Phân ñoạn 2 (gen PB1) của chủng CkHG4 ñược nhân lên bằng phản ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số, bằng 2 phản ứng sử dụng 2 cặp mồi PB1F1-PB1R2 và PB1F3-PB1R3. Phản ứng RT-PCR với cặp mồi PB1F1-PB1R2 cho ñoạn DNA sản phẩm (ñầu phân ñoạn) có ñộ dài 1,7 kb. Kết quả phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi PB1F3-PB1R3 cho sản phẩm 0,75 kb (cuối phân ñoạn), tổng ñộ dài của toàn bộ phân ñoạn 2 khoảng 2,35 kb ñã ñược thu nhận. Các DNA plasmid tái tổ hợp ñược giải trình tự và chuỗi DNA của phân ñoạn 2 chủng CkHG4 thu ñược chứa toàn bộ gen PB1 gồm 2274 bp. 3.1.5 Giải trình tự gen PA Phân ñoạn 3 (gen PA) ñược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số bằng các phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi thiết kế cho gen PA. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi PAF-PAR là phần ñầu của phân ñoạn 3 có ñộ dài khoảng 0,75 kb; với cặp mồi PAF2-PAR2 là phần giữa của phân ñoạn có kích thước khoảng 1,2 kb và với cặp mồi PAF3-PAR3 là phần sau của phân ñoạn có ñộ dài khoảng 0,73 kb; tổng ñộ dài của toàn bộ phân ñoạn 3 thu nhận ñược là khoảng 2,23 kb. DNA plasmid tái tổ hợp của các clone ñược giải trình tự và thu ñược chuỗi DNA của gen PA gồm 2151 nucleotide. 3.1.6 Giải trình tự gen NP Phân ñoạn 5 chứa gen NP của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 ñược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số bằng phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi NPF-NPR. DNA plasmid tái tổ hợp của clone tương ứng ñược giải trình tự và chúng tôi thu ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 5 chủng CkHG4 chứa toàn bộ gen NP gồm 1497 nucleotide. 3.1.7 Giải trình tự gen M DNA plasmid chứa gen M1 và M2 sau khi giải trình tự, chúng tôi thu ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 7 gồm 2 gen M1 (759 bp) và M2 (294 bp). 3.1.8 Giải trình tự gen NS Phân ñoạn 8 chứa gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 ñược nhân lên bằng phản ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số sử dụng cặp mồi NSF1-NSR1. DNA plasmid tái tổ hợp sau ñó ñược giải trình tự và thu nhận ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 8 chứa 2 gen NS1 gồm 678 bp và NS2 gồm 366 bp. 3.2 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA CHỦNG CkHG4 VỚI CÁC CHỦNG CỦA VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 3.2.1 Phân tích gen H5 3.2.1.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Trình tự nucleotide và amino acid gen H5 của chủng CkHG4 ñược so sánh với 26 chủng cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Quảng ðông và phân dòng Phúc Kiến của Việt Nam và thế giới phân lập trong các năm 20032009. Kết quả so sánh, phân tích cho thấy: - Gen H5 của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 có kích thước 1707 bp, mã hóa cho 568 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG (methionine) và kết thúc bằng bộ mã TAA. - Chuỗi nucleotide và polypeptide gen H5 chủng CkHG4 có cùng kích thước với gen tương ứng của các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông là 1707 bp và 568 amino acid so với 1704 bp (thiếu hụt 3 nucleotide) và 567 amino acid (thiếu hụt 1 amino acid) của các chủng phân dòng Phúc Kiến. - Chủng CkHG4 có tổng cộng 363 vị trí sai khác nucleotide với các chủng so sánh, chủ yếu là ñột biến ñồng hoán (transition) (ñột biến xảy ra giữa các base trong cùng nhóm purine hay pyrimidine với nhau, giữa A và G hoặc C và T). - Gen H5 của chủng CkHG4 có 15 vị trí sai khác nucleotide với hầu hết các chủng so sánh và 10 nucleotide sai khác so với các chủng cùng phân lập ở vùng Hậu Giang (thứ tự 2-5) tại các vị trí 159, 415, 445, 582, 676, 677, 933, 945, 1170 và 1494. Trong tổng số 363 sai khác về nucleotide của chủng CkHG4 với các chủng so sánh có một số sai khác không làm thay ñổi amino acid, nhưng một số sai khác ñã làm biến ñổi bộ mã của amino acid dẫn ñến thay ñổi amino acid tại 104 vị trí. Do ñó có thể ảnh hưởng ñến tính kháng nguyên miễn dịch và tính gây bệnh của các chủng ñó. - Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 có 5 vị trí sai khác về amino acid với tất cả các chủng so sánh tại các vị trí: F11V, I242M, 9 10 R275K, T325N và V512A (Bảng 3.1). - Thành phần chuỗi polypeptide nối giữa HA1 và HA2 của chủng CkHG4 bao gồm các amino acid RRRKK, và motif này không biến ñổi qua các năm 2003–2009 ở hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông. Ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến chuỗi nối này bị xóa 1 amino acid (K) do ñột biến mất ñi 3 nucleotide (AAG) trong trình tự chuỗi nối của gen H5. chuỗi protein H5 giữa hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông. Protein H5 của các chủng phân dòng Phúc Kiến chỉ có 6 vị trí glycosyl hóa tương ứng với các chủng phân dòng Quảng ðông. ðã có sự thay thế amino acid S (vị trí 171) thành N ở các chủng phân dòng Phúc Kiến tại vị trí thứ III (170 -172) ñể chuyển từ motif NST ở các chủng phân dòng Quảng ðông tạo thành motif NNT ở các chủng phân dòng Phúc Kiến. 3.2.1.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Trình tự nucleotide gen H5 của 27 chủng cúm A/H5N1 so sánh ñược ñưa vào chương trình GeneDoc2.5 ñể phân tích sự ñồng nhất (identity) về thành phần nucleotide và tương ñồng (homology) về amino acid. Kết quả phân tích cho thấy: 512 529 V - SoI sánh giữa các chủng vùng Hậu Giang với nhau, tỷ lệ ñồng nhất nucleotide và tương ñồng amino acid biến ñộng ít (96-98%). Mức ñộ A I A nhất I và tương ñồng cao nhất là 98%, thấp nhất là 96%. ñồng A - SoII sánh các chủng phân dòng Quảng ðông với nhau, tỷ lệ ñồng nhất A vàAtương I ñồng biến ñộng rất lớn, 91-99% về nucleotide và 87-100% về A T amino acid, chủ yếu là do có sự biến ñộng lớn giữa các chủng phân lập A I năm 2003-2007 với 3 chủng phân lập năm 2008-2009. A I So sánh các chủng phân dòng Phúc Kiến với nhau, tỷ lệ ñồng nhất A I A I nucleotide biến ñộng rất lớn (94-99%); tương tự, tỷ lệ tương ñồng amino A cũng I phản ánh ñúng mức ñộ biến ñổi lớn (94-100%). acid A I A - TỷI lệ ñồng nhất nucleotide và tương ñồng amino acid của các chủng phân Quảng ðông so với các chủng phân dòng Phúc Kiến là rất thấp, A dòng I A Tvề nucleotide và 88-96% về amino acid. 90-96% S T 3.2.1.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ S T A GenT hemagglutinin HA (H5) thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào A tích T phả hệ cùng với 54 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế phân A T giới phân lập qua các năm 1996-2011 (Hình 3.1). A T A Hình T 3.1 cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với T cácA chủng cúm A/H5N1 phân lập ở phía Nam của Việt Nam giai ñoạn A T 2004-2007, ñó là: Ck-VN-DT-171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04 A T (DQ099758), Dk-VN-HG680F-05 (ISDN230184), Ck-VN-LA636-05 A T (ISDN230180), Dk-VN-1231-05 (CY029519), Dk-VN-1771-05 (CY029551), Ck-VN-29-07 (CY029631); và một số chủng phân lập từ Thái Lan là Ck-TL-NIAH7618-04 (AB450562), Ck-Uthaithani-05 (FJ265572), Ck-TL-CU-354-08 (CY047457). ðiều này cho phép nhận xét, có thể các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang, ðồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Sóc Trăng là có cùng nguồn gốc và thuộc nhóm di Bảng 3.1: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5 giữa 27 chủng virus cúm Chủng Chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 8 F F F F F F L F F F F F F F F L L L L L I L L L F L L 11 F V V V V V V V V V V V V V V I T T V V V I I V V V V 102 V V V V V V A V V V V V V V V A A A A A A A A A A A A 110 D D D D D D D D D D D D D V V N N N N N N D N N N N N 140 S S S S S S N S S S S S S S S N E D D D D D D D D D D 156 K K K K K K R K K K K K K K K N R R T T S V V S N T T 171 S S S S S S S S S S S S S S S N D D N N N N N N N N N Vị trí sai khác về amino acid 191 228 242 243 275 279 M R I E R T M R M E K T M R M E K T M R M E K T M R M E K T L R M E K T L K M E K A L R M E K T M R M E K T M R M E K T M R M E K T M R M E K T M R M E K T I R M E K T M R M E K T L K M D K A L K M E K T L K M E K T L K M D K A L K M D K A L K M D K A L K M D K A L K M D K A L K M D K A L K I D K T L K M D K A L K M D E A 285 L L L L L L L L L L L L L L L L L L V V V V V V V V V Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông, 19-27 là các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến. - Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 và các chủng so sánh có 7 vị trí glycosyl hóa, bao gồm 5 vị trí trên HA1 và 2 vị trí trên HA2. Không có sự khác biệt về các vị trí liên quan ñến khả năng glycosyl hóa của 298 I M M M M M M M M M M M M M V I M V I I M I I M M M M 325 T N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 326 R R R R R R R R R R R R R R R R K R K K K K K K K K K 11 12 truyền 1 (clade 1). ðây là các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông, genotype Z. Hình 3.1 cũng cho thấy, các chủng phân lập ở phía Nam của Việt Nam giai ñoạn 2008-2011, bao gồm Dk-VN-VL-NCVD080162-08, DkVN-CT-NCVD-361-09, Ck-VN-ST-R6-2-10, Ck-VN-TG-R6-2819-11 cũng tạo thành một nhóm kháng nguyên phụ khác, ñược xác ñịnh thuộc nhóm di truyền 1.1. 3.2.2 Phân tích gen N1 3.2.2.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Gen N1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 1350 nucleotide, mã hóa cho 449 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Trình tự nucleotide và amino acid của gen N1 chủng CkHG4 ñược so sánh với các chuỗi gen N1 tương ứng của 26 chủng Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009. MDk-VN-OIE-559-11 Ck-VN-TG-R6-2819-11 Dk-VN-VL-NCVD080162-08 Dk-VN-CT-NCVD-361-09 68 97 Ck-VN-ST-R6-2-10 71 Dk-VN-CaMau498-06 98 Dk-VN-BL-07-09-07 99 Ck-VN-15-07 Ck-VN-29-07 58 90 Dk-HG-07-12-07 96 Dk-VN-1771-05 97 85 Ck-VN-LA636-05 Dk-VN-HG680F-05 39 Dk-VN-1231-05 43 VN-CL2009-05 1 Ck-VN-NCVD12-05 Ck-VN-TG-023-04 35 20 Ck-VN-36-04 39 H5 Nucleotide 37 99 32 32 95 1.1 Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-DT-171-04 Ck-TL-NIAH7618-04 Ck-Uthaithani-05 Ck-VN-5-03 Ck-TL-CU-354-08 Ck-VN-27-03 100 Ck-India-NIV96526-09 2.2 Ck-Bangladesh-418-09 Ck-HK-YU324-03 2.1 Ck-Indo-BL-03 55 Ck-Hunan-8-08 86 100 Ck-VN-20346-09 2.3.2.1 A-Hubei-1-10 39 100 Dk-VN-QT801-11 47 47 Ck-VN-10-05 Ck-Guangxi-3154-05 95 70 2.3.2 MDk-VN-1455-06 72 Ck-Guangxi604-05 Dk-HN-101-04 2.3.1 2.3.3 77 Ck-GY-3570-05 Dk-TL-KU-56-07 71 Dk-VN-37-07 9839 Dk-VN-HaiPhong-208-06 35 Ck-Laos-1-08 41 Ck-Fujian-584-06 2.3.4 54 Dk-VN-50-07 30 VN-HN31242-07 100 Dk-PhuTho-07-92-07 61 Dk-VN-53-07 Ck-VN-Ncvd8-03 5 Dk-GD-07-2000 Gs-GD-1-96 0 99 99 A-HK-156-97 Ck-VN-NCVD-093-08 Ck-VN-NCVD-135-08 7 100 96 Ck-VN-NCVD-016-08 90 42 100 88 100 0.01 Dk-VN-CT-NCVD-361-09 Ck-VN-ST-R6-2-10 Dk-VN-VL-NCVD080162-08 MDk-VN-OIE-559-11 31 74 Ck-VN-TG-R6-2819-11 59 Dk-VN-BL-07-09-07 28 Ck-VN-15-07 76 Dk-VN-CaMau498-06 Ck-VN-29-07 46 60 Dk-HG-07-12-07 35 Dk-VN-1771-05 61 Ck-VN-LA636-05 57 Dk-VN-HG680F-05 23 Dk-VN-1231-05 VN-CL2009-05 56 Ck-VN-NCVD12-05 H5 Amino acid 62 21 79 1.1 Bảng 3.2: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1 giữa 27 chủng virus cúm Chủng 1 Ck-VN-HG4-05 Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-36-04 Ck-Uthaithani-05 99 Ck-TL-NIAH7618-04 21 Ck-VN-5-03 Ck-TL-CU-354-08 Ck-VN-27-03 31 65 Ck-HK-YU324-03 2.1 Ck-Indo-BL-03 98 Ck-India-NIV96526-09 2.2 Ck-Bangladesh-418-09 66 Dk-VN-HaiPhong-208-06 24 51 Ck-Laos-1-08 40 Ck-Fujian-584-06 23 Dk-TL-KU-56-07 2.3.4 Dk-PhuTho-07-92-07 21 39 48 Dk-VN-50-07 88 27 Dk-VN-53-07 VN-HN31242-07 Dk-VN-37-07 58 Dk-HN-101-04 2.3.1 61 Ck-GY-3570-05 2.3.3 65 MDk-VN-1455-06 32 Ck-Guangxi-3154-05 43 2.3.2 Ck-Guangxi604-05 Ck-VN-10-05 80 72 Ck-Hunan-8-08 50 Ck-VN-20346-09 2.3.2.1 99 A-Hubei-1-10 91 Dk-VN-QT801-11 Ck-VN-Ncvd8-03 5 Dk-GD-07-2000 57 0 Gs-GD-1-96 81 82 A-HK-156-97 Ck-VN-NCVD-093-08 Ck-VN-NCVD-135-08 7 100 93 Ck-VN-NCVD-016-08 15 17 18 0.02 Hình 3.1: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen kháng nguyên H5 về thành phần nucleotide và amino acid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 17 T T T T T T T T T T T T I I I T T I I T T I V I I I I 26 V V V V V V L V I I V V I I I V V I I I I I I V I I I 39 H H H H H H H H H H H N Q Q Q H H Q Q H H Q Q Q Q Q Q 56 N T N T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T A Vị trí sai khác về amino acid 64 75 80 233 K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H K N Y H T R H Y T R H Y T R H Y K N Y H K N Y H T S H Y T R H Y K N Y H K N Y H T R H Y T R H Y T R H Y T R H Y T S H Y T S Y Y 250 N D D D D N D D D D D D D N D D D D D D D N N D N D D 320 S S S S S S S S S S S S P P H S S P P S S P P P P L L 434 G G G G G G G G G G G G S S S G G G S G G S S S S G S Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới. Kết quả so sánh cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 262 vị trí sai khác về nucleotide với các chủng so sánh. Các ñột biến chủ yếu xảy ra ở vùng 5’ của gen N1 và hầu hết là các ñột biến ñồng hoán (A↔G hoặc C↔T). Chủng 13 14 CkHG4 chỉ có 4 nucleotide sai khác với phần lớn các chủng Việt Nam và thế giới ở các vị trí: 30, 167, 748 và 867. Trong ñó, sai khác ở 2 vị trí 167 và 748 là có dẫn ñến sai khác amino acid. Các sai khác về nucleotide ñã làm biến ñổi tổng cộng 91 amino acid giữa chủng CkHG4 với các chủng so sánh. Các biến ñổi lớn chủ yếu tập trung ở vùng tận cùng N của 80 amino acid ñầu tiên. Mười một vị trí có biến ñổi lớn về amino acid giữa các chủng so sánh ñược trình bày ở Bảng 3.2. Chuỗi polypeptide N1 của chủng CkHG4 chỉ có 2 amino acid sai khác với phần lớn các chủng so sánh ở 2 vị trí N56T và N250D (tương ứng với 2 vị trí sai khác về nucleotide 167 và 784 trong gen N1). Phân tích ñặc tính glycosyl hoá của protein N1 ở các chủng cúm A/H5N1 Kết quả phân tích ñặc tính glycosyl hóa cho thấy, chuỗi polypeptide N1 của chủng CkHG4 và 26 chủng so sánh cùng có 3 vị trí glycosyl hóa. Vị trí I có motif là NSS (amino acid 68-70), vị trí II là NGT (amino acid 126-128) và vị trí thứ III là NGS (amino acid 214-216). ðiều này chứng tỏ, không có sự biến ñổi vị trí có tiềm năng glycosyl hóa trong protein N1 ở các chủng cúm A/H5N1 phân lập trong các năm 2003-2009. 3.2.2.2 Phân tích ñột biến “trượt–xoá” gen N1 qua thời gian tiến hóa 41 chủng virus cúm A/H5N1 phân lập trong 50 năm qua, trong ñó có chủng CkHG4 do chúng tôi giải trình tự gen N1, ñược ñối chiếu so sánh về thành phần nucleotide và amino acid của gen N1. Các chủng so sánh ñược phân thành 3 nhóm chính: (i) nhóm các chủng phân lập từ 1959 ñến trước 2003; (ii) nhóm các chủng phân lập từ gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997; và (iii) nhóm các chủng phân lập giai ñoạn 2003-2009 từ các vật chủ khác nhau, trong ñó có chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập. Kết quả phân tích cho thấy, ñã có ñột biến xoá gen xảy ra trong các chủng thuộc nhóm (ii) và (iii), nhưng bản chất của ñột biến có khác nhau. Biến ñộng ñột biến xoá nucleotide xảy ra ở vùng nucleotide có vị trí 145213. Cụ thể: - Các chủng cúm A/H5N1 thuộc nhóm (i) có gen N1 có ñộ dài 1410 nucleotide. - Các chủng thuộc nhóm (ii) (phân lập ở Hồng Kông năm 1997) ñã có ñột biến xoá ñi 57 nucleotide vị trí 157-213 từ các chủng nhóm (i). - Các chủng thuộc nhóm (iii) có chuỗi gen N1 ngắn nhất, chỉ còn 1350 nucleotide do ñã có ñột biến xoá ñi 60 nucleotide ở các vị trí 145-204. 3.2.2.3 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích về thành phần nucleotide và tương ñồng (homology) về amino acid cho thấy: - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2005, 99% về thành phần nucleotide và amino acid. - So sánh giữa chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam, tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng có biến ñộng lớn hơn. Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 95-99% và tương ñồng về amino acid là 94-99%. 3.2.2.4 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Gen N1 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập ñược ñưa vào phân tích phả hệ cùng với 47 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: Ck-VN-DT171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), VN-HG-178-04 (DQ094286), VN-HG-207-05 (DQ094292), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280). ðiều này cho thấy, các chủng cúm A/H5N1 từ người và gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long là có cùng nguồn gốc, hoàn toàn giống như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử dụng gen H5. 3.2.3 Phân tích gen PB2 3.2.3.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Gen PB2 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2280 bp, mã hóa cho 759 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Trình tự nucleotide và amino acid của gen PB2 ñược so sánh với 26 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2004-2009. Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 455 nucleotide sai khác với các chủng so sánh. Chủng CkHG4 có 3 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 365, 580, 2080; và cả 3 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi amino acid. Sai khác về nucleotide giữa chủng CkHG4 với các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 82 vị trí. Trong số ñó, mười ba vị trí sai khác lớn ñược liệt kê ở Bảng 3.3. Chủng CkHG4 có 3 amino acid sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí A122V, K194Q và L694F (Bảng 3.3), tương ứng với 3 vị trí ñột biến nucleotide 15 16 như ñã phân tích ở trên. Vị trí amino acid 627 ở protein PB2 ñược cho là có liên quan ñến tính thích nghi nhiệt ñộ cơ thể loài vật chủ và ñộc lực của virus. Ở virus cúm gia cầm vị trí này là glutamic acid (E), còn ở virus thích nghi trên người là lysin (Wasilenko và cs, 2008) [155]. Các chủng virus H5N1 ñộc lực cao ñối với ñộng vật có vú, thành phần amino acid của PB2 có chứa lysin (K) ở vị trí 627 hoặc tổ hợp 627E/701N (Li và cs, 2010) [100]. Vị trí 627 ở protein PB2 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập là glutamic acid (E) và amino acid ở vị trí 701 là asparatic acid (D). 3.2.3.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy: - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 97-99% cả 2 thành phần nucleotide và amino acid. - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 90-99% và tương ñồng về amino acid là 96-99% so với các chủng của Việt Nam; 93-97% về thành phần nucleotide và 97-98% về thành phần amino acid khi so với các chủng của thế giới. 3.2.3.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Bảng 3.3: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2 giữa 27 chủng virus cúm Chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Vị trí có thay ñổi amino acid 105 A A A A A A A A A T T A A T T A A T T T T T T T T T T 108 A A A A A A A A A T T A A T T A A T T A T T A T T A T 122 A V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V 147 I V V I I I I I I T T I I T I I I T V I T T I T T I V 194 K Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 338 V I I I V V I V V V V V I V V I I V V V V V V V V V V 339 K K K K K K K K K T T K K T K K K A K T T T T T T T K 357 H Y Y Y H H Y H H H H H Y H H Y Y H H H H H H H H H H 368 R R R R R R R R R Q Q R R Q R R R Q R R Q Q R Q Q Q R 390 D D D D D D D D D N N D D N D D D N D D N N D N N D D 430 T T T T T T T T P P P T T P P T T P P P P P P P P P P 494 V I I I V V I V V V V I I V V I I V V V V V V V V V V 694 L F F F L F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới; 1-5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang; 10, 11, 14, 15, 18 là các chủng phân lập ở miền Bắc. Kết quả phân tích phả hệ sử dụng gen PB2 cho thấy, chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền Nam: Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc, tương tự như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử dụng gen H5 và N1 trình bày ở phần trước. 3.2.4 Phân tích gen PB1 và PB1-F2 3.2.4.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Toàn bộ gen PB1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2274 bp, mã hoá cho chuỗi polypeptide PB1 gồm 757 amino acid, bộ mã khởi ñầu là ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Lồng vào trong chuỗi nucleotide của PB1, từ vị trí 95 ñến 367 là PB1-F2, có ñộ dài 273 bp bao gồm 90 amino acid, khởi ñầu bằng bộ ba ATG và kết thúc bằng bộ ba TGA. Trình tự nucleotide và amino acid gen PB1 và PB1-F2 ñược so sánh với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009. Kết quả phân tích cho thấy, gen PB1 của chủng CkHG4 có tổng cộng 428 vị trí sai khác về nucleotide với các chủng so sánh. Những thay ñổi về nucleotide dẫn ñến sai khác về amino acid ở 62 vị trí, trong ñó có 8 vị trí sai khác lớn. Chủng CkHG4 có sai khác hoàn toàn 4 amino acid trên protein PB1 so với tất cả các chủng, cụ thể ở các vị trí R206G, S306N, M323T, L631F. Gen PB1-F2 của chủng CkHG4 có tổng cộng 52 nucleotide (trong ñó có 1 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng của Việt Nam và thế giới ở vị trí 131) và 41 amino acid sai khác với các chủng so sánh. 17 18 Chuỗi polypeptide PB1-F2 của chủng CkHG4 chỉ có một amino acid sai khác so với hầu hết các chủng ở vị trí K44R. 3.2.4.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid gen PB1 và PB1-F2 của chủng CkHG4 cho thấy: ðối với gen PB1: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng cao so với các chủng Việt Nam giai ñoạn 2004-2007, 97-99% về nucleotide và 98-99% về amino acid. ðối với các chủng của thế giới, mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng dao ñộng lớn hơn, tỷ lệ tương ứng là 91-98% và 97-99%. ðối với gen PB1-F2: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang theo thứ tự tương ứng là 99-100% và 97-100%, với các chủng Việt Nam khác là 9799% và 93-98%. Mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng với các chủng thế giới qua các năm 2003-2009 biến ñộng rất lớn: 90-99% về nucleotide và 7597% về amino acid. Như vậy, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid cao so với một số chủng vùng Hậu Giang phân lập qua các năm 2004-2007. Với các chủng phân lập càng về sau, mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng càng giảm. 3.2.4.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, chủng CkHG4 với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền Nam trong các năm 2004-2005: VN-HG-207-05 (DQ138165), Ck-VN-DT-171-04 (DQ138156), VN-HG-178-04 (DQ138160), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các chủng virus cúm A/H5N1 từ người và gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc. các vị trí: 203, 205, 324, 444, 693, 1059, 1105, 1332, 2053, 2060; 11 nucleotide sai khác với 5 chủng miền Bắc và các chủng của thế giới ở các vị trí: 51, 102, 342, 645, 808, 957, 1281, 1296, 1521, 1695, 1878. Những thay ñổi về nucleotide trên ñây dẫn ñến sai khác amino acid ở 76 vị trí, trong ñó có 5 amino acid sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: L68P, Y69N, T369A, R685G, F687Y. Mặc dù chủng CkHG4 có ñến 11 nucleotide sai khác với các chủng miền Bắc và thế giới, nhưng những sai khác này chỉ làm thay ñổi thành phần amino acid ở một số chủng. Nghiên cứu gần ñây cho thấy, các ñột biến T515A trong PA và Y436H trong PB1 ñã làm mất tính gây bệnh của virus H5N1 (Hulse-Post và cs, 2007) [82], nhưng chỉ ñột biến riêng lẻ ở các amino acid này thì không ảnh hưởng ñến ñộc lực của virus. Trong thành phần amino acid của chủng CkHG4 và tất cả các chủng A/H5N1 lựa chọn so sánh, threonin (T) ở vị trí 515 phát hiện không biến ñổi qua các năm 2003-2009. 3.2.5.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy: - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 98-99% về thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid. - Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng biến ñộng lớn hơn khi so với các chủng của Việt Nam. Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 9299% và tương ñồng amino acid là 96-99%; trong ñó với các chủng miền Bắc là 92-97% và 96-98% (theo thứ tự tương ứng), với các chủng miền Nam là 98-99% (cả 2 thành phần). - ðối với các chủng thế giới, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 90-97%, tương ñồng về amino acid là 96-98%. 3.2.5.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792), Ck-VN-DT171-04 (DQ099788), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280), Ck-VN-TG-02304 (DQ099758), chứng tỏ các chủng A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể có cùng nguồn gốc, tương tự như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ trình bày ở phần trước. 3.2.5 Phân tích gen PA 3.2.5.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Toàn bộ gen PA của chủng CkHG4 có ñộ dài 2151 bp, mã hóa cho 716 amino acid, có bộ mã khởi ñầu là ATG, bộ mã kết thúc là TAG. Trình tự nucleotide của gen PA này ñược so sánh với gen PA tương ứng của 26 chủng A/H5N1 phân lập tại Việt Nam và thế giới trong các năm 2003-2009. Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 có: - Tổng cộng 425 nucleotide sai khác với các chủng so sánh, trong ñó có 10 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở 20 19 3.2.6 Phân tích gen NP Long có cùng nguồn gốc. 3.2.6.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Toàn bộ gen NP thu nhận từ chủng CkHG4 có kích thước 1497 bp, mã hóa cho 498 amino acid, có bộ mã khởi ñầu là ATG và bộ mã kết thúc là TAA. Trình tự nucleotide và amino acid gen NP ñược so sánh, phân tích với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009. Kết quả phân tích cho thấy, gen NP của chủng CkHG4 có 7 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 36, 105, 138, 606, 795, 816, 1269; 14 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng miền Bắc ở các vị trí: 51, 204, 231, 258, 273, 318, 324, 483, 507, 537, 549, 915, 1116, 1149; 1 nucleotide sai khác với các chủng A/H5N1 vùng Hậu Giang và các chủng miền Nam khác ở vị trí 306. Chuỗi polypeptide NP chủng CkHG4 chỉ sai khác hoàn toàn 1 amino acid với tất cả các chủng so sánh ở vị trí M265I. Như vậy, NP là gen ổn ñịnh nhất về thành phần nucleotide và amino acid. Mặc dù có những biến ñổi nucleotide, nhưng hầu hết các ñột biến này không làm thay ñổi thành phần amino acid của chuỗi polypeptide. 3.2.6.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng với các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là 96-99%; 96-99% cũng là tỷ lệ ñồng nhất và tỷ lệ tương ñồng của chủng CkHG4 với các chủng khác của Việt Nam. Nếu so với các chủng của thế giới thì các tỷ lệ tương ứng sẽ là 92-97% và 98-99%. Xét một cách tổng thể, mức ñộ ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương ñồng về thành phần amino acid của gen NP chủng CkHG4 với các chủng Việt Nam và thế giới là tương ñối cao, ñặc biệt là thành phần amino acid. 3.2.6.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc Gen NP thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ cùng với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792), CkVN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các chủng A/H5N1 từ người và gia cầm các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu 3.2.7 Phân tích gen M 3.2.7.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Toàn bộ gen M thu nhận từ chủng CkHG4 có kích thước 982 bp, mã hóa cho 2 chuỗi polypeptide M1 và M2. Gen M1 có ñộ dài 759 bp (từ nucleotide ñầu tiên ñến nucleotide 759), mã hóa cho 252 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen M2 có kích thước 294 bp bao gồm 97 amino acid, bắt ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA. Gen M1 và M2 có chung 27 nucleotide ñầu 5’ của vùng mã hóa và gen M2 ñược tạo ra do nối 27 nucleotide này với 267 nucleotide từ vị trí 716 trở về sau cho ñến nucleotide 982. Trình tự nucleotide gen M1 và M2 ñược so sánh, phân tích với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 20032009. Kết quả phân tích cho thấy: - Gen M1 của chủng CkHG4 có tổng cộng 87 nucleotide sai khác với các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi tổng cộng 12 amino acid trong chuỗi polypeptide M1. Gen M1 của chủng CkHG4 có 3 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 132, 502 và 615, nhưng chỉ có thay ñổi ở vị trí 502 là dẫn ñến sai khác về amino acid ở vị trí 168 (V168I) trong protein M1. Bên cạnh ñó, chủng CkHG4 còn có 3 nucleotide (246, 522, 613) sai khác với phần lớn các chủng miền Bắc và thế giới, nhưng chỉ có sai khác ở vị trí 613 là làm thay ñổi amino acid ở vị trí 205 (I205V). - Gen M2 có tổng cộng 31 nucleotide sai khác so với các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 18 vị trí trong chuỗi polypeptide M2. Trong số các sai khác về nucleotide, chỉ có 1 nucleotide là có sai khác hoàn toàn với tất cả các chủng so sánh (vị trí 127), và sai khác này ñã làm thay ñổi thành phần amino acid của protein M2 tại vị trí 43 (F43L). Ngoài ra, gen M2 của chủng CkHG4 còn có 4 nucleotide (76, 92, 190, 197) sai khác với hầu hết các chủng miền Bắc và thế giới. Tất cả 4 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid ở các vị trí 26 (I26L), 31 (N31S), 64 (A64S), 66 (A66E). Protein M1 có liên quan ñến yếu tố ñộc lực của virus A/H5N1 ở ñộng vật có vú. Nghiên cứu gần ñây cho thấy, amino acid asparatic acid (D) ở vị trí 30 và alanin (A) ở vị trí 215 trong protein M1 là cần thiết ñể virus H5N1 gây chết chuột. Hai loại amino acid này (D30 và A125) cũng ñã 21 22 ñược phát hiện có trong thành phần protein M1 của chủng CkHG4 và tất cả các chủng so sánh, và không có biến ñổi qua các năm 2003-2009. M2 là một protein có liên quan ñến tính kháng amantadine của virus. Chỉ cần thay thế một amino acid ở các vị trí 26 (L→F), 27 (V→A hoặc T), 30 (A→T hoặc V) và 31 (S→N hoặc R) trong vùng xuyên màng của protein M2 có thể làm cho virus có khả năng kháng thuốc (Suzuki và cs, 2003) [142]. Các vị trí này trong protein M2 của chủng CkHG4 lần lượt là I26, V27, A30 và N31. Như vậy là ñã có ñột biến ở vị trí 31 (S→N) trong protein M2 của chủng CkHG4, và ñột biến này có thể làm cho virus ñề kháng với amantadine. 3.2.7.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy: - Gen M1 của chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng với các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là rất cao, 98-99% về thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid; so với các chủng khác của Việt Nam thì tỷ lệ này là 96-99% và 98-99%; so với các chủng của thế giới thì các tỷ lệ tương ứng là 96-98% và 96-99%. - Gen M2 chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang tương ứng là 99% và 97-98%, với các chủng khác của Việt Nam là 97-99% và 89-98%, với các chủng của thế giới là 94-98% và 90-97%. 3.2.7.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc Gen M thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ cùng với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094258) tạo thành một nhóm, chứng tỏ gen M của các chủng A/H5N1 từ người và gia cầm các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể có cùng nguồn gốc. 3.2.8 Phân tích gen NS 3.2.8.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid Gen NS thu nhận từ chủng CkHG4 mã hoá cho 2 chuỗi polypeptide NS1 và NS2. Gen NS1 có ñộ dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen NS2 có ñộ dài 366 bp bao gồm 121 amino acid, bắt ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA. Gen NS2 và NS1 có chung 30 nucleotide ñầu 5’ của vùng mã hóa và gen NS2 ñược tạo ra do nối 30 nucleotide này với 336 nucleotide từ vị trí 488 trở về sau cho ñến nucleotide 823. Trình tự nucleotide của gen NS1 và NS2 của chủng CkHG4 sau ñó ñược so sánh với các chuỗi gen tương ứng của 26 chủng A/H5N1 phân lập tại Việt Nam và thế giới qua các năm 2001-2009. Kết quả phân tích cho thấy: Gen NS1 chủng CkHG4 có: - 4 nucleotide sai khác hoàn toàn so với tất cả các chủng so sánh ở các vị trí: 166, 195, 394 và 512; trong ñó sai khác ở 3 vị trí 166, 394, 512 dẫn ñến thay ñổi các amino acid tương ứng A56T, A131T, I171N. - 7 nucleotide (273, 423, 444, 523, 563, 595, 642) sai khác với một số chủng vùng Hậu Giang. Trong ñó, sai khác ở các vị trí 413, 523, 563, 595 và 642 ñã làm biến ñổi các amino acid T138N, V175I, R188Q, R199G, K214N (theo thứ tự tương ứng). - 8 nucleotide (177, 180, 223, 242, 395, 408, 443, 568) sai khác với hầu hết các chủng miền Bắc và thế giới, nhưng chỉ 4 vị trí 223, 242, 443 và 568 là làm biến ñổi amino acid, tương ứng ở các vị trí K75E, V81A/T, G148E và T190S. Gen NS2 chủng CkHG4 có: - 1 nucleotide (vị trí 55) sai khác với tất cả các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi amino acid ở vị trí 19 (L19M). - 5 vị trí (66, 106, 138, 179, 185) sai khác về nucleotide so với một số chủng vùng Hậu Giang; trong ñó sai khác ở 3 vị trí 106, 179, 185 ñã làm biến ñổi amino acid ở các vị trí tương ứng E36K, I60T, và N62T. - 2 nucleotide (vị trí 112 và 250) sai khác với ña số các chủng so sánh phân lập ở miền Bắc và thế giới, tuy nhiên các sai khác này không làm biến ñổi thành phần amino acid. Nhằm tìm hiểu kỹ hơn sự biến ñộng thành phần nucleotide và amino acid của gen NS, chúng tôi tiến hành so sánh chủng CkHG4 với một số chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới qua các năm 1996-2009. Gen NS của chủng CkHG4 và một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập sau năm 2000 (giai ñoạn 2001-2009) bị xóa 15 nucleotide. Sự thay ñổi này dẫn ñến xóa ñi 5 amino acid “(A/T)IAS(V/S)” ở các vị trí 80 - 84 trong protein NS1. Theo Long và cộng sự (2008) [102] protein NS1 bị xóa 5 amino acid ở các 24 23 vị trí 80 - 84 dẫn ñến ñột biến D92E làm tăng ñộc lực của virus cúm A/H5N1 ở gà và chuột. ðồng thời, glutamic acid (E) ở vị trí 92 trong protein NS1 còn liên quan ñến khả năng của virus A/H5N1 ñiều chỉnh ñáp ứng với cytokine và tính ñộc lực cao của virus trên lợn (Seo và cs, 2002) [132]. E92 cũng ñược phát hiện trong thành phần protein NS1 của chủng CkHG4. Theo Jackson và cộng sự (2008) [84], bốn amino acid ở ñầu C của protein NS1 là vùng liên quan ñến ñộc lực của virus. Các chủng virus cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm với tỷ lệ chết cao gần ñây ñều có các amino acid ở ñầu C trong NS1 là ESEV hoặc EPEV. Bốn amino acid ở ñầu C của protein NS1 chủng CkHG4 cũng có motif là 222ESEV225. Các amino acid R38, K41 (Wang và cs, 1999) [153] và A149 (Li và cs, 2006) [99] trong protein NS1 ñược cho là liên quan ñến khả năng của virus ức chế tế bào sản xuất interferon và kháng lại ñáp ứng của chúng. Arginin (R) ở vị trí 38 và lysin (K) ở vị trí 41 cũng ñã ñược phát hiện trong thành phần amino acid của protein NS1 chủng CkHG4. 3.2.8.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid Kết quả phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy: - Gen NS1 của chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng với các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là 97-99% về thành phần nucleotide và 95-98% về thành phần amino acid; so với các chủng khác của Việt Nam tỷ lệ này là 94-99% và 92-98%; so với các chủng của thế giới các tỷ lệ tương ứng là 94-97% và 93-97%. - Gen NS2 của chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang theo thứ tự tương ứng là 98-99% và 95-99%, với các chủng Việt Nam khác là 93-99% và 9199%, với các chủng thế giới là 95-98% và 94-97%. 3.2.8.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc Gen NS thu nhận từ chủng CkHG4 ñược phân tích phả hệ cùng với 36 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094258), VN-CL2009-05 (DQ493254) tạo thành một nhóm, chứng tỏ gen NS của chủng A/Ck/VN/HG4/2005(H5N1) do chúng tôi phân lập có cùng nguồn gốc với các chủng cúm A/H5N1 từ người và gia cầm vùng ñồng bằng sông Cửu Long. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN (1) Toàn bộ 8 phân ñoạn gen của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4, bao gồm PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS ñã ñược thu nhận và giải trình tự, - Hệ gen mã hóa cho 11 chuỗi polypeptide, trong ñó có kích thước ngắn nhất là PB1-F2 (90 amino acid), dài nhất là PB2 (759 amino acid). - Tất cả 11 gen ñều khởi ñầu bằng bộ mã ATG. Các gen PB2, PB1, PA và N1 kết thúc bằng bộ mã TAG. Bộ mã kết thúc của các gen H5, NP, M2 và NS2 là TAA. Riêng các gen PB1-F2, M1 và NS1 có bộ mã kết thúc là TGA. - Kết quả phân tích thành phần gen cho thấy chuỗi polypeptide H5 có 7 vị trí glycosyl hóa, chuỗi nối giữa HA1 và HA2 có ñầy ñủ các amino acid RRRKK; chuỗi polypeptide N1 có 3 vị trí glycosyl hóa; chuỗi polypeptide NS1 bị xóa 5 amino acid ở các vị trí 80 - 84; chuỗi polypeptide PB2 chứa glutamic acid (E) ở vị trí 627 và asparatic acid (D) ở vị trí 701, thích ứng gây bệnh ở gia cầm và ñặc trưng của virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao. (2) Hệ gen của chủng CkHG4 phù hợp với các chủng virus cúm A/H5N1 phân dòng Quảng ðông, thuộc nhóm kháng nguyên clade 1, nhóm di truyền genotype Z. (3) Chủng CkHG4 có mức ñộ ñồng nhất (về nucleotide) và tương ñồng (về amino acid) cao ở tất cả 8 phân ñoạn gen với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam trong các năm 2004-2005. (4) Phân tích mối quan hệ phả hệ từng gen riêng biệt của toàn bộ hệ gen cho thấy chủng CkHG4 tập hợp trong cùng nhóm với các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm vùng ñồng bằng sông Cửu Long giai ñoạn 2004-2007. KIẾN NGHỊ Tiếp tục giải trình tự hệ gen của các chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất hiện trong những năm gần ñây tại Việt Nam, phân tích ñặc tính sinh học phân tử ñể ñánh giá mức ñộ tiến hóa cũng như mối quan hệ về kháng nguyên-miễn dịch của các biến chủng A/H5N1 cập nhật với các chủng virus vaccine nhằm giúp cho việc phòng chống dịch cúm gia cầm có hiệu quả.