Tài liệu Nghiên cứu giải mã trình tự hệ genome của chủng virus xoăn lá thuốc lá (tlcv) phân lập tại việt nam

Số hóa bởi trung tâm học liệu i http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC CAO DUY PHÚC NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ TRÌNH TỰ HỆ GENOME CỦA CHỦNG VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (TLCV) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên – 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu i http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học - người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, ThS. Phạm Thị Vân, Ks. Nguyễn Thị Thu Hiền, CN. Nguyễn Văn Đoài cùng tập thể cán bộ Phòng công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian làm khoá luận. Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận. Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./ Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả luận văn Cao Duy Phúc ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT µg microgam µl microlitre bp Base pair CP Coat protein (protein vỏ) DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine tetra-acetate acid EtBr Ethidium Bromide et al Đồng tác giả Kb Kilobase LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus polymerase v/p vòng/phút Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Trang Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã đƣợc xác định có ở Việt Nam …………………………………….. 4 1.2 Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra…………………….. 11 2.1 Nguồn gốc các mẫu thuốc lá nghiên cứu………………………….. 23 2.2 Trình tự và thông số của hai mồi………………………………….. 25 2.3 Thành phần phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N…………. 26 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N……. 26 2.5 Thành phần phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R………………... 27 2.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R………….. 27 2.7 Thành phần phản ứng ghép nối……………………………………. 29 2.8 Thành phần phản ứng colony-PCR………………………………... 31 2.9 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng colony-PCR………………………….. 31 2.10 Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI 32 2.11 Mã số, nguồn gốc đất nƣớc và cây chủ của một số thể phân lập, chủng Begomovirus trên GenBank…………………....................... 33 3.1 Kích thƣớc và vị trí các gen trên vòng DNA-A…………………... 41 3.2 Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit vòng DNA-A của 3 thể phân lập HN, BG, LS với các trình tự trên ngân hàng gen thế giới …………………................................................................. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 47 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tên hình Trang Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và cấu trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)………................. 14 1.2 Cấu trúc vòng DNA-β …………………………………………….. 17 1.3 Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá ………………………………. 18 1.4 Bọ phấn Bemisia tabaci..................................................................... 20 2.1 Mô hình minh họa vị trí các mồi trên genome TLCV……………... 25 2.2 Cấu tạo vector pBT ……………………………………………….. 28 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ lá bị bệnh xoăn lá.......... 35 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân vòng DNA-A ……….……… 36 3.3 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α……………………………………………………….. 38 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR……………………………. 38 3.5 Ảnh plasmid đã làm sạch để đọc trình tự ………………….……… 39 3.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen V1 và A bằng BamHI............................................................................................... 3.7 40 Kết quả so sánh trình tự nucleotit vòng DNA-A giữa 3 thể phân lập HN, BG, LS …............................................................................ 44 3.8 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập HN……... 45 3.9 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập BG……... 46 3.10 Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập LS……… 46 3.11 Cây phát sinh chủng loại ………………………………………….. 49 v MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ii Danh mục các bảng iii Danh mục các hình iv Mục lục v MỞ ĐẦU................................................................................................................ 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 3 1.1. VIRUS THỰC VẬT....................................................................................... 3 1.1.1. Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay............................................ 3 1.1.2. Cách phòng chống bệnh do virus thực vật gây ra................................... 5 1.1.3. Cấu trúc của virus thực vật...................................................................... 7 1.2. MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC LÁ............................. 8 1.2.1. Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)………... 8 1.2.2. Virus gây bệnh khảm dƣa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)…..... 9 1.2.3. Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV) 10 1.3. VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV)................ 12 1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại................................................ 12 1.3.2. Cấu trúc genome và chức năng của các protein...................................... 14 1.3.3. Triệu chứng và cơ chế lây bệnh............................................................. 18 1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng hệ gen Begomovirus trong tạo cây trồng chuyển gen kháng Begomovirus.............................................................. 20 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 23 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU............................................................................ 23 2.1.1. Nguồn vật liệu......................................................................................... 23 2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid và các bộ kit............................................... 23 2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị................................................................. 23 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu............................................................................... 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 24 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số.......................................................................... 24 2.2.2. Phản ứng PCR......................................................................................... 25 2.2.3. Phƣơng pháp điện di phân tích DNA trên gel agarose............................ 27 2.2.4. Phƣơng pháp thôi gel.............................................................................. 28 2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT....................................... 28 2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt...................................................................................... 29 2.2.7. Phản ứng colony-PCR............................................................................. 30 2.2.8. Phƣơng pháp tách chiết plasmid............................................................. 31 2.2.9. Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI.............................. 32 2.2.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank................................................................................... 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 35 3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE …………………………………………………………………. 35 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số............................................................. 35 3.1.2. Kết quả nhân gen bằng phản ứng PCR................................................... 36 3.1.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α..... 37 3.1.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR............ 38 3.1.5. Tách plasmid tái tổ hợp và cắt kiểm tra sự có mặt của gen tách dòng.... 39 3.1.6. Kết quả xác định trình tự......................................................................... 41 3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN..................................................... 44 3.2.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide......................................................... 44 3.2.2. Đánh giá tính đa dạng của các thể phân lập BG, HN, LS thông qua cây phát sinh chủng loại.................................................................................... 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 53 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày đƣợc trồng nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Không chỉ để sản xuất thuốc lá, nó còn đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Ngoài ra với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận gen ngoại lai thuốc lá còn đƣợc xem là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Tuy nhiên, với những đặc điểm sinh học của mình, thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng cây thuốc lá. Trong đó có bệnh xoăn lá do virus xoăn lá thuốc lá (Tobacco leaf curl virus, TLCV) gây nên. Khi cây mắc bệnh virus, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 95-100%. Cho đến nay chƣa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng chống lại bệnh do virus gây ra trên cây trồng. Con ngƣời chỉ có thể hạn chế tác hại của virus và kiểm soát nó ở mức độ nhất định. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đang đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc, các tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và miền Đông Nam Bộ và đƣợc đánh giá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia. Song bệnh hại (đặc biệt là bệnh do virus) cũng đang đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây thuốc lá. Nghiên cứu hiểu rõ vật liệu di truyền của virus tác nhân gây bệnh trên cây thuốc lá là vấn đề rất cần thiết, kết quả này sẽ có định hƣớng trong phòng chống đúng loại virus bằng việc tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh. Hiện nay, với những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học, ngƣời ta đã tạo ra đƣợc một số loại cây trồng kháng đƣợc bệnh do virus gây ra thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính virus gây bệnh [15]. Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. 2 Vì vậy, giải trình tự toàn bộ genome của TLCV cho từng vùng khác nhau là cần thiết. Genome của nhiều chủng TLCV đƣợc phân lập từ các vùng khác nhau trên thế giới nhƣ Hawaii, Mexico, Brazil, Thái Lan, Đài Loan,... đã đƣợc công bố chi tiết. Tuy nhiên thông tin về toàn bộ trình tự genome TLCV gây bệnh trên cây thuốc lá ở Việt Nam chƣa nhiều, mà chủ yếu tập trung trên các loài cây cà chua, ớt...[20]. Xuất phát từ những cơ sở trên tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải mã trình tự hệ genome của chủng virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định trình tự toàn bộ genome của virus xoăn lá thuốc lá (TLCV). Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA tổng số của TLCV - Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu - Tách dòng gen - Đọc trình tự gen và phân tích trình tự Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Comment [SCD1]: VIRUS 1.1. VIRUS THỰC VẬT 1.1.1. Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay Cho tới nay, hơn 2000 virus đã đƣợc phát hiện và công nhận, trong đó khoảng 1000 là các virus gây hại thực vật. Các virus thực vật nhìn chung không làm chết cây nhƣng chúng ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sinh trƣởng, phát triển của cây, năng suất và chất lƣợng nông phẩm. Nhiều trƣờng hợp, bệnh do virus gây có thể là một trong các nguyên nhân chính cản trở sản xuất của một cây trồng nào đó. Ở cây lâu năm, một số virus sau khi gây bệnh nặng trong mùa khi có thời tiết và nhiệt độ ôn hòa, nhƣng khi nhiệt độ thấp hay quá cao thƣờng gây nên hiện tƣợng mất triệu chứng (latent period) làm cho ngƣời sản xuất bị nhầm lẫn, không phát hiện đƣợc cây bị bệnh và mức nguy hiểm của bệnh, chỉ đến lúc nào đó cây không còn khả năng phục hồi theo chu kỳ bệnh nữa, hoàn toàn tàn lụi, khi đó mới biết thì đã quá muộn.Virus cũng có thể gây nên những thiệt hại nặng nề và nhanh chóng ngay trong vụ trồng của các cây thƣờng năm nhƣ Rice grassy stunt virus gây bệnh lùn lúa cỏ, Rice tungro spherical virus và Rice tungro bacilliform virus gây bệnh tungro (hại lúa), Tomato yellow leaf curl virus gây bệnh xoăn vàng lá (hại cà chua) [44]. Các virus hại khoai mì đã từng hủy diệt hàng chục vạn hecta ở châu Á và châu Phi [43] trong một thời gian ngắn chƣa tới 30 ngày từ một cánh đồng xanh tƣơi trở thành vàng úa, chết lụi. Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hƣởng của bệnh tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp. Hạt lúa bị bệnh virus thƣờng bị lép không cho thu hoạch, trong trƣờng hợp đƣợc thu hoạch hạt thƣờng rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn cỗi, lá khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lƣợng tinh bột và các chất dinh dƣỡng đều thấp. Có trƣờng hợp bệnh do một chủng đặc biệt của virus làm vỏ quả, củ có vết loét, bẩn giảm giá trị thƣơng phẩm, nhƣ khi khoai tây bị nhiễm một chủng Potato virus Y [7]. Ở cà chua bị xoăn lá, quả bé, múi khô và hoa rụng, năng suất và phẩm chất đều rất thấp. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 4 Citrus tristeza virus [41] hại cam quýt rất nặng tại vùng bờ biển Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông Nam Á... Bệnh làm cho quả cam chín ép và rụng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ, nƣớc cam nhạt không mùi vị. Bệnh virus còn nguy hiểm do virus ký sinh bắt buộc trong tế bào cây ký chủ. Vì vậy khi tế bào bị hủy hoại, chết, virus mới bị mất hoạt tính. Khi tế bào non phát triển mạnh, virus cũng phát triển mạnh, tạo ra những triệu chứng rất điển hình trên cây non hay bộ phận non của một cây. Chính vì vậy khi nhân giống vô tính trong phòng thí nghiệm, virus có khả năng lây lan rất lớn trong việc phát triển công nghệ sinh học và các vùng trồng trọt công nghệ cao. Cho tới nay, 52 virus thực vật thuộc 52 loài đã đƣợc xác định ở Việt Nam (Bảng 1.1), phần lớn đã đƣợc giải trình tự. Trong số này, đa số là các virus thuộc 2 chi Begomovirus (22 virus) và Potyvirus (18 virus). Đây cũng là 2 chi virus thực vật lớn nhất với mỗi chi chiếm khoảng 20 % tổng số virus thực vật toàn thế giới. Ngoài ra, nhiều virus có ý nghĩa kinh tế, chẳng hạn các virus gây bệnh trên lúa nhƣ bệnh lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus, RRSV), bệnh lúa cỏ hay còn gọi là bệnh vàng lùn (Rice grassy stunt virus), bệnh lúa lùn sọc đen (Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV) cũng mới đƣợc xác định chính xác [20]. Bảng 1.1: Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã đƣợc xác định có ở Việt Nam STT Tên bệnh 1 Bệnh xoăn vàng lá cà chua do nhiều begomovirus. 2 Bệnh chùn ngọn chuối do banana bunchytop virus (BBTV). 3 Bệnh đốm hình nhẫn đu đủ, bầu bí do papaya ring spot virus (PRSV). 4 Bệnh tàn lụi cây có múi do citrus tristeza virus (CTV). 5 Bệnh khảm lá khoai tây trên khoai tây do potato virus Y (PVY). 6 Bệnh khảm lá cây họ đậu do bean common mosaic virus virus (BCMV). 7 Bệnh tungro hại lúa nhƣ bệnh tungro do phức hợp 2 virus là rice tungro bacilliform virus (RTHN) và rice tungro spherical virus (RTSV). 8 Bệnh vàng lùn (lúa cỏ) hại lúa do rice grasy stunt virus (RGSV). 9 Bệnh lùn xoắn lá (táp lá) hại lúa do rice ragged stunt virus (RGSV). 10 Bệnh lùn sọc đen hại lúa, ngô do southern rice black streaked dwarf virus Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 5 (SRBSDV). 11 Bệnh vàng lụi (vàng tạm thời, vàng lá di động) trên lúa do rice yellow stunt virus (RYSV). 1.1.2. Cách phòng chống bệnh do virus thực vật gây ra Có nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã đƣợc áp dụng nhƣ loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng môi giới, diệt cỏ dại, luân canh cây trồng, dùng giống sạch bệnh hoặc giống chống bệnh, chịu bệnh. Dựa vào đặc điểm của từng loài virus gây hại, đặc tính của cây trồng ngƣời ta đã đề ra những biện pháp phòng trừ cho từng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại của nguồn bệnh. *Sử dụng giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus Phƣơng pháp này đem lại hiệu quả tạo đƣợc cây sạch bệnh. Tuy nhiên biện pháp giống kháng bệnh c , năng suất và chất lƣợng của giống kháng cũng là điều đáng lƣu tâm vì rất khó tích hợp đƣợc nhiều phẩm chất trong một giống cây trồng. *Sử dụng vật liệu giống sạch bệnh Phƣơng pháp này áp dụng đối với các virus truyền qua vật liệu giống (hạt giống, các cây nhân giống vô tính). Vật liệu giống sạch bệnh có thể đƣợc tạo ra bằng một số cách nhƣ: Chọn giống từ nguồn sạch (ruộng không bị bệnh, khu vực không bị bệnh), xử lý nhiệt, xử lý hóa chất để tiêu diệt virus tồn tại trên vỏ hạt, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, tạo giống in vitro, sử dụng hóa chất (ribavirin) để tiêu diệt virus trong nuôi cấy mô. *Biện pháp canh tác Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Comment [SCD2]: in vitro 6 . . Tuy nhiên, nhiều loại virus nhƣ TMV lây truyền qua đƣờng cơ giới, virus lây lan trực : chỉ cần 1 con rầy nâu/cây lúa đã có thể truyền virus lùn lúa cỏ (RGSV). *Sử dụng giống kháng bệnh mang gen kháng của cây Quan hệ gen-đối-gen: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tƣơng ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tƣơng tác đặc hiệu với nhau. Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã đƣợc chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus...) gây ra. Các gen cây ký chủ qui định tính kháng đƣợc gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh đƣợc gọi chung là gen Avr (Avirulence). Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen đƣợc gọi là tính kháng gen-đối-gen. Tính kháng gen-đối-gen thƣờng là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững. Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thƣờng là phản ứng siêu nhạy/apoptosis. Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã đƣợc xác định. Sản phẩm của các gen này gọi là các protein kháng R. Hiện nay, các protein kháng R đƣợc chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong tế bào ký. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ. Các protein kháng R của cây chống virus phần lớn thuộc 2 lớp CNL và TNL. Đây là 2 lớp chiếm số lƣợng lớn nhất trong tất cả các loại protein kháng R của thực vật. Cả 2 lớp CNL và TNL còn đƣợc xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR. Số lƣợng gen kháng của họ này đƣơc xem là chiếm số lƣợng lớn nhất trong các họ protein. *Sử dụng giống kháng bệnh dùng gen virus Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 7 Gen qui định tính kháng là gen virus. Tính kháng này đƣợc gọi là tính kháng từ tác nhân gây bệnh, (Pathogen Derived Resistance, PDR). Tính kháng PDR đƣợc chia làm 2 nhóm: (i) Tính kháng thông qua protein (của virus); (ii) Tính kháng thông qua RNA (của virus) (i) Tính kháng thông qua protein: Trong những năm 1980 - 1990, nhiều nghiên cứu chuyển gen virus vào cây đã đƣợc thực hiện. Các gen virus có thể khác nhau nhƣ gen CP, gen replicase, gen vận chuyển MP, gen thể vùi NIa/b của potyvirus..., tuy nhiên phần lớn là gen CP. Đặc điểm nhóm này là tính kháng hình thành khi gen chuyển đƣợc biểu hiện thành protein trong cây chuyển gen. Hai ví dụ điển hình là cây thuốc lá chuyển gen CP của TMV kháng đƣợc virus TMV [33] và cây đu đủ chuyển gen CP của PRSV kháng đƣợc virus PRSV (Golsalves et al., 2004). (ii) Tính kháng thông qua RNA: tính kháng của virus thông qua RNA đã đƣợc chứng minh là do cơ chế câm gen (RNA silencing) hay là cơ chế kiểm soát RNA (RNA interference) của các sinh vật nhân chuẩn [15]. Việc phát hiện ra cơ chế RNAi là cơ sở quan trọng cho kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus. 1.1.3. Cấu trúc của virus thực vật Virus hại thực vật là những nucleoprotein rất bé nhỏ. Những virus dạng cầu nhóm Luteovirus kích thƣớc chỉ từ 23-24 nm. Những virus dạng cầu nhóm Ilarvirus có kích thƣớc biến động từ 26-35 nm. Hơn mƣời nhóm virus khác cũng có kích thƣớc biến động trong khoảng 30-34 nm. Virus lớn nhất dạng cầu là Tomato spotted wilt virus cũng chỉ có đƣờng kính 80 nm. Nhóm Rhabdoviridae là virus dạng vi khuẩn to nhất (135-380 x 45-96 nm). Virus dài nhất là các virus dạng sợi nhóm Closterovirus dài 2000 x 12 nm. Chúng nhỏ bé nhƣ vậy nên việc tìm kiếm phát hiện đòi hỏi phải có những phƣơng pháp đặc biệt. Virus có cấu tạo rất đơn giản, chúng có 2 thành phần chính là protein và nucleic acid. Lõi nucleic acid ở bên trong đƣợc bao bằng một lớp vỏ protein (capsid). Hầu hết virus thực vật có genome RNA sợi đơn mạch (+) và nhiều dạng có capsid hình que, các protein capsomer hình xoắn. Ví dụ: Tobacco mosaic virus (TMV) Genome TMV là RNA sợi đơn. Genome của chúng mã hoá ít nhất 4 chuỗi polypeptid. Protein 130 và 180 kDa đƣợc dịch mã trực tiếp từ Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 8 cùng một codon bắt đầu trên RNA bộ gene. Hai protein khác, 30 kDa và protein vỏ đƣợc dịch mã từ đoạn RNA. Protein 130 và 180 kDa liên quan với sao chép virus, trong khi đó protein 30 kDa cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào này đến tế bào khác. Vì vậy 3 loại protein này cần cho sự nhân lên của virus trong toàn bộ cây. Các virus DNA Virus thực vật có bộ gene DNA rất hiếm, chỉ gồm 2 nhóm: tuy nhiên 2 nhóm virus thực vật đƣợc nghiên cứu nhiều nhất có chứa genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus. Comment [SCD3]: kDa Comment [SCD4]: kDa Comment [SCD5]: kDa Comment [SCD6]: virus Cauliflower mosaic virus: CaMV đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm Caulimovirus. Đây là nhóm virus dạng cầu, chứa genome DNA vòng tròn, mạch kép, kích thƣớc khoảng 8 kb. Caulimovirus gây ra một số bệnh làm thiệt hại kinh tế cấy trồng. Chúng có phổ vật chủ hạn chế, chỉ nhiễm cây 2 lá mầm.DNA của CaMV có cấu trúc không bình thƣờng, có 3 điểm gián đoạn trên sợi kép, hai điểm trên một sợi và một điểm trên sợi còn lại với những vùng trình tự overlap. Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn. Từ các nghiên cứu ở CaMV [22], [30] cho rằng sao chép CaMV liên quan với phiên mã ngƣợc qua trung gian RNA của bộ gene. Chu trình sao chép giống với retrovirus và hepatitis B virus. Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có phổ xâm nhiễm rộng, cả cây một lá mầm và 2 lá mầm.Virus sọc vằn lá ngô (Maize streak virus, MSV) là một gemini virus lây nhiễm qua lá, đƣợc truyền do côn trùng. Bộ gene của geminivirus chứa phân tử DNA vòng tròn sợi đơn. Sao chép DNA virus đƣợc nghĩ là xảy ra nhờ trung gian DNA và genome của virus sao chép cho nhiều bản sao trong nhân của những tế bào tăng sinh nhanh. Virus gây ra sự ức chế sinh trƣởng và lá có sọc vàng của những cây ngô bị nhiễm 1.2. MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC LÁ 1.2.1. Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV) TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực vật đƣợc mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886). Tuy nhiên, bản chất bất thƣờng của tác nhân gây bệnh vẫn không đƣợc nhận biết mãi đến những nghiên cứu của Beijerinck (1898), TMV là virus đầu tiên đƣợc nhận biết. Từ đó, đã có nhiều khám phá quan trọng về TMV, tác động tích cực đến sự phát triển của nghành virus học. TMV phân bố rộng khắp thế giới và gây bệnh cho ít nhất 199 loài của Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Comment [SCD7]: Maize streak virus, MSV Comment [SCD8]: Virus Comment [SCD9]: Tobacco mosaic virus 9 30 họ thực vật [37]. TMV tấn công vào những cây có tầm quan trọng về kinh tế nhƣ: cà chua, thuốc lá, ớt, cà tím... gây thiệt hại nghiêm trọng. TMV là virus đơn dƣơng (ssRNa) có hình cuộn xoắn, dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130 đơn vị capsid (capsomeres), cứ 16 capsomeres tạo thành một vòng xoắn. Mỗi capsomeres có 158 amino acid và có trọng lƣợng 1800 Daltons. Virion có chiều dài 300 mm và đƣờng kính là 18mm. Các tiểu đơn vị protein liên kết chặt chẽ tạo thành cấu trúc dạng xoắn (độ khoảng 2,3 nm hay 16 + 1/3 tiểu đơn vị/vòng) xung quanh một ống trụ có bán kính khoảng 2nm. Một sợi đơn RNA dài 6395 nucleotide, có cấu trúc xoắn tƣơng tự (49 nucleotide/vòng hay 3 nucleotide/tiểu đơn vị) có bán kính khoản 4nm, và liên kết với bề mặt trong của tiểu đơn vị protein. Virus có thể phân tách thành acid nucleic và vỏ protein và cũng có thể hợp nhất lại thành dạng virus gây bệnh bền vững. TMV có thể gây bệnh trên rất nhiều loại cây trồng và cây dại khác nhau nhƣng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Đây là bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của lá thuốc, nhất là đối với thuốc lá sợi vàng. Bệnh còn có tên là bệnh hoa lá vàng. Bệnh có thể tấn công cây con, cây trƣởng thành và cả cây đời tái sinh. Bệnh nặng và phân bố rộng ở nhiều nơi và vào bất kỳ mùa vụ nào trong năm. Bệnh xuất hiện càng sớm thì càng ảnh hƣởng đến năng suất. Tuy nhiên, phẩm chất của lá thuốc thƣờng bị tác hại nghiêm trọng hơn so với tác hại về năng suất: lá thuốc bị bệnh, sau khi sấy, lá sẽ bị nâu đen, dòn, dễ bị nát vụn ra, không có mùi vị thơm ngon và hút nặng. Khi cây bị bệnh các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các vùng xanh nhạt xanh đậm không đều xen lẫm nhau, hình loang lổ nhƣ da ếch, hay còn gọi là dạng khảm. TMV đƣợc lan truyền bằng đƣờng cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào qua vết thƣơng và qua khí khổng lá, thân hoặc rễ. TMV rất bền nhƣ ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây bệnh sau một năm. 1.2.2. Virus gây bệnh khảm dƣa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV) CMV thuộc loại Cucumovirus, họ Bromoviridae đƣợc Price phát hiện lần đầu tiên vào năm 1934 ở Mỹ. Loài virus này phân bố khắp nơi trên thế giới, phổ biến ở vùng có khí hậu ôn hòa. CMV là loại virus thực vật có phổ gây bệnh rộng nhất với số loại cây có thể bị lây nhiễm lên đến 1000 loài [18], [29] bao gồm 85 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Comment [SCD10]: Cucumber mosaic virus, CMV 10 họ thực vật. CMV có khả năng thích ứng cao, biến đổi hệ gen rất nhanh nên nó trở thành mối đe dọa cho nông nghiệp thế giới. Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử CMV có dạng hình cầu, đƣờng kính 28-30nm, trọng lƣợng phân tử từ 5,06,7.106 Da. Virion của CMV không có vỏ, có nhiều loại virion nhƣng kích thƣớc tƣơng đối giống nhau. Genome của CMV bao gồm 3 sợi RNA đơn dƣơng (RNA1, RNA2 và RNA3) chứa 5 khung đọc mở (ORF): ORF 1a và 2a nằm trên RNA 1 và 2, tách biệt và là những thành phần của enzym sao chép replicase; ORF 2b là một gen gối lên ORF 2a, nằm trên subgenome RNA4A và mã hóa một suppressor của quá trình câm gen sau phiên mã [9]. ORF 3a và CP nằm trên RNA3, trong đó ORF 3a mã hóa cho protein 3a-protein di chuyển của virus (MP) còn ORF CP mã hóa cho protein vỏ (CP); CP đƣợc biểu hiện từ subgenome RNA4 [29]. Trong ba RNA của CMV, RNA3 xảy ra sự tái tổ hợp thƣờng xuyên hơn RNA1 và RNA2. Vì vậy có rất nhiều nghiên cứu dựa trên RNA3 để đánh giá bảng đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh của chủng CMV. Đầu tận cùng 3’ của 4 loại RNA 1-4 có trình tự tƣơng tự nhau và chia sẻ một cấu trúc bậc hai giống nhƣ tRNA. Virus có thể chứa nhứng phân tử RNA vệ tinh sợi đơn, nhỏ (332-405 nucleotide), nó cần thiết cho sự sao chép của CMV, phụ thuộc vào CMV để có hoạt tính sinh học. Đến nay xác định đƣợc trình tự nucleotide của hơn 40 RNA vệ tinh. Khi cây bị bệnh có biểu hiện các lá non ngả màu vàng nhạt, lá nhỏ lại, các ngọn bị chùn lại, không phát triển đƣợc. Trên các mặt lá có biểu hiện các vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ nhạt. Ngoài ra còn có những biểu hiện khác nhƣ: Phiến lá nhăn nheo, lồi lõm, do các gân lá bị kìm hãm sinh trƣởng trong khi thịt lá vẫn phát triển, kích thƣớc lá bị thu nhỏ lại. Bệnh nặng thì cây cằn cỗi, chết dần từ ngọn xuống. 1.2.3. Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV) TSWV là virus thuộc loại Tospovirus họ Bunyaviridae, đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1915 khi gây thiệt hại lớn trên cà chua trồng ở Australia. TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp các lục địa. Trong số đó, cỏ dại là nguồn chứa TSWV chính [2]. Tospovirus đƣợc đánh giá là một trong mƣời nhóm virus gây bệnh cây nghiêm trọng nhất. Virus thuộc họ này có vật liệu di truyền là ssRNA. Genome của TSWV gồm ba Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 11 phần: Một sợi RNA âm tính và hai sợi ambisene. Ba sợi RNA này khác nhau về kích thƣớc và đƣợc gọi là Large (L), Middle (M), Short (S). Mỗi RNA đƣợc bao bọc bởi nhiều bản copy của 1 tiểu đơn vị Nucleocapside (N) và 10 – 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus [5]. Giữa các đoạn L, M, S có trình tự kết thúc nhƣ nhau. TSWV hình cầu, đƣờng kính 80 – 110 nm. TSWV đƣợc truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác nhau. Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhƣng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Từ cây con đến cây trƣởng thành đều có thể bị TSWV tấn công. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên (ne ngọn). Hình thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, nhƣ bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thƣờng. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhƣng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả. Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng thƣơng phẩm. Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trƣờng gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác. Bên cạnh một số virus kể trên còn rất nhiều loài virus khác gây bệnh trên cây thuốc lá và gây thiệt hại đáng kể thể hiện ở bảng dƣới đây Bảng 1.2: Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra Tên bệnh Tên virus gây bệnh 1 Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus (virus khảm linh lăng) 2 Quăn ngọn cúc tần Beet curty top virus (virus gây bệnh quăn ngọn cúc tần) 3 Ngọn cây bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân STT thuốc lá) và tobacco bushy top virus (virus ngọn cây bụi thuốc lá) 4 Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (virus gây bệnh khảm dƣa chuột) 5 Vàng hoại tử rau diếp Vàng hoại tử rau diếp (trong Nicotiana glutinosa) 6 Còi cọc cây lạc Peanut stunt virus Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 12 7 Bệnh hình hoa hồng 8 Kỵ axit thuốc lá Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây bệnh biến dạng gân lá thuốc lá) và tobacco mottle virus (virus gây đốm thuốc lá) Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá) 9 Xoăn thuốc lá Tobacco leaf curl virus (virus gây xoăn thuốc lá) 10 Khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh) 11 Hoại tử thuốc lá Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá) 12 Bung hạt thuốc lá Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá) 13 Đốm vòng thuốc lá Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) 14 Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá) 15 Còi cọc thuốc lá Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá) 16 Vằn gân thuốc lá Tobacco vein mottling virus (virus gây bệnh vằn gân thuốc lá) 17 Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (virus gây bệnh héo đốm cà chua) 18 Viền gân lá Potato virus (virus Y khoai tây) 19 U vết thƣơng Wound tumor virus (virus gây bệnh khối u vết thƣơng) (Nguồn: http://www.apsnet.org/online/comcom/names/tobacco.asp) 1.3. VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV) 1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại Virus xoăn lá thuốc lá-Tobacco leaf curl virus (TLCV) là một trong những virus gây bệnh trên các cây họ cà ở nhiều vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Đƣợc Storey phát hiện đầu tiên vào năm 1931. TLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae. Họ này gồm có 4 chi lớn đó là Begomovirus, Curtovirus, Mastrevirus và Topocovirus phân biệt nhau bởi cấu trúc genome, vector truyền bệnh và cây chủ ký sinh. Geminiviridae là họ virus gây bệnh thực vật lớn thứ hai với khoảng trên 300 loài đã đƣợc xác định. Begomovirus là chi lớn nhất trong họ với khoảng 266 loài chủ yếu lây truyền thông qua vector truyền bệnh là loài bọ phấn Bemisia tabaci [16]. Ngƣời ta đã phát hiện khoảng 18 loài gây bệnh xoăn lá và 11 loài gây bệnh xoăn vàng lá [23]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 13 Hiện nay số loài mới phát hiện ngày càng nhiều có thể do sự tái tổ hợp lại giữa các chủng virus. TLCV có dạng hình chày, kích thƣớc khoảng 18 x 60nm. Lớp protein vỏ có trọng lƣợng khoảng 28-34 đvC, gồm hai capsom giống nhau, mỗi capsom gồm 5 phân tử protein (Murphy et al., 1994). Khi soi dƣới kính hiển vi thấy các hạt virion thuần khiết luôn ở dạng cầu ghép đôi. Mỗi hạt trong cặp chỉ chứa một trong hai loại DNA có trình tự nucleotide khác nhau. Những loài Begomovirus phát hiện trƣớc đây có hệ gen gồm các gen trùm nằm trên cùng một vòng DNA-A sợi đơn kích thƣớc khoảng 2,7 kb (thể monopartite). Sau đó, ngƣời ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm 2 vòng DNA sợi đơn tách biệt với kích thƣớc xấp xỉ nhau khoảng 2,6 - 2,8 kb là DNA-A và DNA-B (thể bipartite). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện một số loài thuộc nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA-A còn có một hoặc hai vòng DNA vệ tinh (DNAβ và DNA1) với kích thƣớc xấp xỉ một nửa DNA-A có tác dụng tăng cƣờng biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [8]; [11]; [20]. Dựa vào hệ thống phát sinh loài và sự sắp xếp các gen trong genome, Begomovirrus đƣợc chia làm hai nhóm chính: (1) nhóm virus OldWorld (OW) gồm những virus có nguồn gốc phát sinh từ các vùng Đông bán cầu, Châu Phi, Châu Âu và một số khu vực thuộc Châu Á và (2) nhóm virus NewWorld (NW) có nguồn gốc phát sinh ở Tây bán cầu và Châu Mỹ [28]. Tất cả các virus thuộc nhóm NW đều là thể bipartite trong khi cả hai thể monopartite và bipartite đều xuất hiện trong nhóm OW. Bên cạnh đó, DNA-A của các virus bipartite trong nhóm NW đều thiếu khung đọc ORF của AV2 [40]. Protein vỏ của chúng mang một motif (vùng cấu trúc) có tên là PWRsMaGT ở đầu 5’ trong khi nhóm OW thì không có. Hầu hết các dẫn chứng về phát sinh chủng loại đều cho rằng các virus NW phát sinh sau OW từ sau thời kỳ phân tách lục địa của Châu Mỹ từ Gondwara [35]. Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã phân lập một số chủng virus thuộc khu vực OW nhƣng có sự tƣơng đồng chặt chẽ với virus NW. Điều này gợi ý rằng những virus NW có thể có mặt trong OW từ trƣớc thời kỳ phân tách lục địa [20]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Comment [SCD11]: Đơn vị Cacbon