Tài liệu Nghiên cứu đánh giá chức năng của gen cr7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ c2h2zf đối với sự phát triển rễ lúa

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐINH VĂN LÂM NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CHỨC NĂNG CỦA GEN CR7 MÃ HÓA YẾU TỐ PHIÊN MÃ THUỘC HỌ C2H2ZF ĐỐI VỚI SỰ PHÁT TRIỂN RỄ LÚA Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 0201 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Hoàng Thị Giang 2. TS. Nguyễn Văn Giang NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Hoàng Thị Giang và TS. Nguyễn Văn Giang. Các số liệu, kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa công bố dưới bất cứ hình thức nào trước đây. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nếu phát hiện bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng kỷ luật Nhà nước. Hà Nội, ngày 29 tháng 9 năm 2017 Tác giả luận văn Đinh Văn Lâm i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân còn có sự giúp đỡ nhiệt tình, quý báu của các thầy cô, anh (chị, em) đồng nghiệp. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Hoàng Thị Giang, người đã trực tiếp, tận tình chỉ dạy tôi về mặt học thuật cũng như phương pháp tiếp cận nghiên cứu trong suốt quá trình thực tập và hoàn thiện luận văn thạc sĩ. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Nguyễn Văn Giang đã có nhiều đóng góp khoa học cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thơm cùng các anh, chị (em) đồng nghiệp phòng LMI RICE-2, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 29 tháng 9 năm 2017 Tác giả luận văn Đinh Văn Lâm ii MỤC LỤC Lời cam đoan .................................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................................... ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt .......................................................................................................v Danh mục bảng ............................................................................................................... vi Danh mục hình ............................................................................................................... vii Trích yếu luận văn ........................................................................................................ viii Thesis abstract...................................................................................................................x Phần 1. Mở đầu ...............................................................................................................1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài............................................................................2 Phần 2.Tổng quan tài liệu ..............................................................................................3 2.1. Hình thái giải phẫu và chức năng bộ rễ lúa .........................................................3 2.1.1. Hình thái giải phẫu ..............................................................................................3 2.1.2. Chức năng bộ rễ lúa.............................................................................................6 2.2. Vai trò của bộ rễ lúa trong việc chống chịu với các tác nhân phi sinh học .........7 2.2.1. Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa ...........7 2.2.2. Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu hạn .......................................9 2.2.3. Vai trò của bộ rễ lúa đối với khả năng chống chịu mặn ....................................10 2.3. Mạng lưới gen liên quan tới sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa....................12 Phần 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ..........................................................16 3.1. Vật liệu nghiên cứu ...........................................................................................16 3.1.1. Vật liệu thực vật ................................................................................................16 3.1.2. Mồi và các vật tư khác.......................................................................................16 3.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................17 3.2.1. Nghiên cứu hoạt động của promoter cr7 liên quan đến sự phát triển rễ lúa .....17 3.2.2. Nghiên cứu vai trò của gen cr7 đối với sự hình thành rễ ở cây lúa...................18 3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .....................................................................18 3.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................18 3.4.1. Chọn lọc dòng lúa t0 siêu biểu hiện gen cr7 bằng kỹ thuật qpcr ......................18 3.4.2. Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển ở thế hệ t1, t2 .............20 iii 3.4.3. Đánh giá sự phát triển bộ rễ của những dòng lúa siêu biểu hiện gen cr7 .........24 3.4.4. Đánh giá sự hoạt động của promoter cr7 thông qua biểu hiện của gen chỉ thị gus .....................................................................................................................24 Phần 4. Kết quả và thảo luận .......................................................................................26 4.1. Kết quả nghiên cứu hoạt động promoter cr7 thông qua sự biểu hiện của gen chỉ thị gus ................................................................................................................26 4.1.1. Kết quả chọn lọc dòng lúa t1 mang một copy cấu trúc gen procr7::gus ..........26 4.1.2. Kết quả chọn lọc dòng t2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen procr7::gus ............27 4.1.3. Kết quả đánh giá sự hoạt động promoter cr7 ....................................................29 4.2. Kết quả nghiên cứu vai trò của gen cr7 đối với sự hình thành rễ lúa................36 4.2.1. Kết quả nghiên cứu các dòng chuyển gen trên nền di truyền giống tc65 ..........36 4.2.2. Kết quả nghiên cứu các dòng chuyển gen trên nền di truyền thể đột biến crl1.42 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ......................................................................................45 5.1. Kết luận .............................................................................................................45 5.2. Kiến nghị ...........................................................................................................45 Tài liệu tham khảo ..........................................................................................................46 Phụ lục ...........................................................................................................................50 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Anh ABA Abscisic Acid ARF Auxin Responsive Factor ARL1 Adventitious Rootless 1 AUX/IAA Auxin/Indole-3-Acetic Acid cDNA Complementary DNA C2H2ZF Cys2 His2 Zinc Finger Protein CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide EC Electric Conductivity EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HKT High-Affinity K+ Transporter LOB LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN MS Murashige and Skoog Medium PCR Polymerase Chain Reaction qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative Trait Locus TC65 TaiChung 65 TE Tris-EDTA buffer RT-PCR Realtime Polymerase Chain Reaction v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen .......... 17 Bảng 3.2. Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS ............................................. 20 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR ....................................................................... 22 Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR .................................................................. 22 Bảng 4.1. Đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền thế hệ T1 của các dòng chuyển gen proCR7::GUS ............................................................................................ 27 Bảng 4.2. Kết quả chọn lọc dòng đồng hợp tử mang cấu trúc gen proCR7::GUS ............................................................................................ 28 Bảng 4.3. Kết quả chọn lọc dòng TC65 mang một copy cấu trúc gen chuyển ......... 38 Bảng 4.4. Kết quả chọn lọc dòng đồng hợp tử locus gen pUbi::CR7 ở cây TC65 chuyển gen thế hệ T2 ...................................................................... 39 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc và hình thái rễ lúa .......................................................................... 3 Hình 2.2. Sự hình thành rễ lúa từ các nốt thân............................................................. 4 Hình 2.3. Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa ............................................................. 5 Hình 2.4. Con đường vận chuyển nước và chất dinh dưỡng vào xylem của rễ ........... 7 Hình 2.5. Phản ứng của cây cảm ứng ABA trong điều kiện hạn ................................. 8 Hình 2.6. Gen liên quan tới khả năng chống chịu mặn ở lúa ..................................... 11 Hình 2.7. Đường truyền tín hiệu auxin cho sự phát sinh rễ phụ ở cây lúa ................ 13 Hình 2.8. Mạng lưới gen điều hòa bởi Crl1 ............................................................... 15 Hình 3.1. Hình ảnh giống lúa đối chứng .................................................................... 16 Hình 4.1. Kết quả điện di kiểm tra các cây chuyển gen T1 ....................................... 26 Hình 4.2. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 10.2.42.................................... 29 Hình 4.3. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 11.1.46.................................... 30 Hình 4.4. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 34.1.17.................................... 30 Hình 4.5. Biểu hiện của gen GUS ở bộ rễ của dòng 2TR7 GUS 10.2.42 và 11.1.46........................................................................................................ 32 Hình 4.6. Biểu hiện của gen GUS ở bộ rễ của dòng 2TR7 GUS 34.1.17 ................. 33 Hình 4.7. Lát cắt ngang phần gốc thân của dòng 2TR7 GUS 10.2.42 ....................... 34 Hình 4.8. Lát cắt ngang phần gốc thân cây lúa của dòng 2TR7 GUS 11.1.46 .......... 34 Hình 4.9. Lát cắt ngang phần gốc thân cây lúa của dòng 2TR7 GUS 34.1.7 ............ 35 Hình 4.10. Mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây lúa TC65 chuyển gen thế hệ T0 ........... 37 Hình 4.11. Kết quả điện di kiểm tra cây TC65 chuyển gen ở thế hệ T1...................... 38 Hình 4.12. Sàng lọc dòng TC65 mang đồng hợp tử cấu trúc gen chuyển bằng hygromycin ................................................................................................ 39 Hình 4.13. Số lượng rễ phụ của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi........... 40 Hình 4.14. Khối lượng khô bộ rễ của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi ..................................................................................................... 41 Hình 4.15. Số nhánh của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi................ 41 Hình 4.16. Mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây crl1 chuyển gen thế hệ T0 .................... 42 Hình 4.17. Kiểu hình bộ rễ của các dòng lúa crl1 chuyển gen sau 3 tuần tuổi ............ 43 Hình 4.18. Mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây crl1 chuyển gen thế hệ T1 .................... 44 Hình 4.19. Số lượng rễ phụ ở các dòng lúa crl1 chuyển gen thế hệ T1 ....................... 44 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đinh Văn Lâm Tên luận văn: “Nghiên cứu đánh giá chức năng của gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF liên quan tới sự phát triển rễ lúa”. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62 42 0201 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen và làm sáng tỏ vai trò của gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã họ C2H2ZF đối với sự hình thành và sự phát triển của bộ rễ ở các dòng lúa chuyển gen. Phương pháp nghiên cứu Vật liệu Các dòng lúa chuyển gen cdsCR7 vào các giống Taichung 65 và dạng đột biến crl1 ở các thế hệ T0, T1, T2 dưới sự kiểm soát của promoter Ubiquitin, ký hiệu là pUBi::cdsCR7. Các dòng lúa chuyển cấu trúc gen chứa promoter của gen CR7 gắn với gen chỉ thị GUS, ký hiệu là proCR7::GUS được chuyển vào cây TC65. Phương pháp nghiên cứu Đánh giá mức độ biểu hiện gen ở các dòng lúa chuyển gen bằng kỹ thuật qPCR. Phương pháp tế bào học đánh giá hoạt động của promoter gen CR7 dựa vào gen chỉ thị GUS Chọn lọc các dòng lúa chuyển gen bằng PCR, đánh giá biểu hiện GUS và khả năng kháng Hygromycine trên môi trường nuôi cấy. Đánh giá kiểu hình bộ rễ của các dòng lúa chuyển gen bằng các ống cát. Kết quả chính và kết luận Dựa vào mức độ phân ly di truyền ở thế hệ T1 đã chọn lọc được 6 dòng mang một copy cấu trúc gen chuyển proCR7::GUS là 1TR7 GUS 10.2, 11.1, 16.3, 29.4, 34.1 và 39.1. Ở thế hệ T2 đã sàng lọc thành công 3 dòng đồng hợp tử độc lập gồm: 2TR7 GUS 10.2.42, 11.1.46 và 34.1.17. Trong 3 dòng đồng hợp tử thu được, hoạt động của promoter CR7 chủ yếu được đánh giá dựa trên sự biểu hiện tương đồng của hai dòng 2TR7 GUS 10.2.42 và 11.1.46. Promoter CR7 hoạt động ở giai đoạn sớm từ giai đoạn nảy mầm đến khi cây ra viii lá thật đầu tiên và hoạt động chủ yếu tại vị trí gốc thân và mô phân sinh rễ. Trong gốc thân promoter CR7 hoạt động chính ở phần bó mạch trong thân cây, tại vùng hình thành các rễ phụ phôi ở nốt bao lá mầm và tại vùng mô phân sinh cho sự phát sinh mầm rễ phụ ở các nốt gốc thân. Ở bộ rễ hoạt động của promoter CR7 tập trung vào vùng mô phân sinh đầu ngọn rễ. Nhận định rằng gen CR7 có vai trò nhất định đối với quá trình hình thành rễ phụ phôi và rễ phụ cũng như tham gia vào sự phát triển rễ ở cây lúa. Phân tích bằng phương pháp qPCR khẳng định gen CR7 biến nạp thành công và biểu hiện mạnh trên nền di truyền của cây TC65 và crl1. Đã chọn lọc được 3 dòng TC65 mang 1 copy cấu trúc gen pUbi::cdsCR7 là 1TCR7 TC65 3.2, 11.1 và 12.1. Ở thế hệ T2 đã chọn lọc được 2 dòng TC65 đồng hợp tử độc lập là 2TCR7 TC65 11.1.6 và 12.1.17. Đánh giá bước đầu cho thấy rằng ở giai đoạn cây 4 tuần tuổi trồng trên bầu cát, sự siêu biểu hiện của gen CR7 ở cây TC65 đã làm tăng số lượng rễ phụ ở dòng đồng hợp tử 2TCR7 TC65 12.1.17, tuy nhiên không có sự khác biệt đáng kể về khối lượng khô bộ rễ và số nhánh. Ở giai đoạn cây con 3 tuần tuổi in vitro gen CR7 được siêu biểu hiện trong cây crl1 đã giúp khắc phục hiện tượng đột biến và làm khôi phục sự hình thành rễ phụ. Đã chọn được 2 dòng tiềm năng cho các bước nghiên cứu tiếp theo là 1TCR7 CRL1 11.3 và 94.3. ix THESIS ABSTRACT Master candidate: Dinh Van Lam Thesis title: “Functional characterization of CR7 gen encoding a transcriptional factor of C2H2ZF family involved in rice root development”. Major: Biotechnology Code: 62 42 0201 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Selecting transgenic lines and validating the function of CR7 gene encoding transcriptional factor of C2H2ZF family involved in formation and development of transgenic line root. Materials and Methods Material Transgenic lines containing cdsCR7 controlled by Ubiquitin promoter pUBi::cdsCR7 in wildtype TC65 and mutant CRL1 including T0, T1 and T2 generations. TC65 transgenic lines with structure containing promoter of CR7 gen and GUS reporter gene, proR7::GUS. Methods Assessing gen expression level of transgenic lines by qPCR technique. Histology method to assess promoter activity by reporter gene. Selecting transgenic lines by PCR, GUS expression and antibiotic resistant ability. Root phenotyping in sand columns. Main findings and conclusions Based on T1 segregation, 6 lines containing only one copy of transgenic construction proCR7::GUS were selected including 1TR7 GUS 10.2, 11.1, 16.3, 29.4, 34.1 and 39.1. Three independent homozygous lines 2TR7 GUS 10.2.42, 11.1.46 and 34.1.17 were obtained at T2 generation. The activity of promoter proCR7 was validated mostly based on the similar expression of GUS reporter gene of two lines 2TR7 GUS 10.2.42 and 11.1.46. Promoter proCR7 was activated very early from germination stage to real leaf formation and strongly expressed at stem base and root primordia. At stem base, promoter proCR7 mainly activated at vascular bundle, embryonic crown root formation region of cotyledon node and primordia region of stem base node that crown root x emergence. On roots, promoter proCR7 expressed at root tip. To summary, CR7 gene plays important role for embryonic, post-embryonic crown root and root development. Quantitative PCR for gene expression evaluating confirmed CR7 has transformed successfully and strongly expressed on TC65 and crl1 background. Selected three transgenic lines containing only one copy of construction pUbi::cdsCR7 was 1TCR7 TC65 3.2, 11.1 and 12.1. At T2 generation, we have selected 2 independent homozygous lines 2TCR7 TC65 11.1.6 and 12.1.17. Root phenotyping on sand columns after 4 weeks showed that overexpressed CR7 gene has increased the number of crown roots of 2TCR7 TC65 12.1.17 homozygous lines significantly but there was no significance about root biomass and number of tillers compared with control (TC65). At in vitro 3 week seedling stage, CR7 gene was overexpressed in crl1 mutant has recovered crown root formation. We also selected 2 potential lines for next study were 1TCR7 CRL1 11.3 and 94.3. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Lúa gạo là cây lương thực quan trọng nuôi sống hơn 50% dân số thế giới. Để đáp ứng với tình trạng dân số ngày càng tăng, việc tăng sản lượng lúa cần phải được cải thiện không ngừng (Sumithra et al., 2014). Đặc biệt là trong những năm gần đây, biến đổi khí hậu toàn cầu gây ra những hình thái khí hậu bất thường. Tình trạng hạn hán và xâm thực mặn đã và đang làm giảm đáng kể diện tích trồng lúa, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sản lượng lúa gạo. Chính vì vậy, mục tiêu chọn tạo giống lúa năng suất cao và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất thuận càng trở nên rất bức thiết (Shrivastava and Kumar, 2015). Hiện nay nghiên cứu cải thiện giống lúa chịu hạn mặn chia ra làm hai hướng chính. Thứ nhất, khai thác sự đa dạng tự nhiên về nguồn gen chống chịu hoặc chọn lọc di truyền các tính trạng số lượng, chọn lọc nhờ sự trợ giúp của các chỉ thị phân tử. Thứ hai, tạo giống chuyển gen, chỉnh sửa hệ gen hoặc giống có gen biểu hiện ở mức độ khác với gen sẵn có để thay đổi khả năng chống chịu. Như chúng ta đã biết, bộ rễ giữ vai trò chủ yếu trong việc hút nước và dinh dưỡng từ đất, cấu trúc bộ rễ liên quan đến khả năng vận chuyển nước và giữ vai trò quan trọng cho tính chịu hạn, chịu mặn và hiệu quả vào hạt ở cây trồng. Hiểu rõ được cơ chế phân tử và di truyền kiểm soát cấu trúc bộ rễ và xác định được các gen chức năng liên quan đến sự phát triển bộ rễ sẽ cung cấp công cụ trợ giúp đắc lực cho công tác chọn tạo giống chống chịu tốt với các stress hạn, mặn ở cây trồng (Yan-Bo et al., 2008; Coudert et al., 2015; Paez-Garcia et al., 2015). Cấu trúc bộ rễ lúa về cơ bản gồm có rễ chính, rễ phụ (crown root) và rễ bên. Trong đó, rễ phụ được hình thành ở các nốt phần gốc thân, chiếm đa số và giữ vai trò quan trọng đối với sinh trưởng và năng suất của cây lúa. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, sự phát sinh rễ phụ và rễ bên của cây lúa được điều khiển bởi đường truyền tín hiệu auxin. Trong đường truyền tín hiệu này, có rất nhiều gen tham gia mã hóa ra các yếu tố phiên mã liên quan đến sự hình thành rễ lúa, trong đó có gen crl1 (Inukai et al., 2005). Tuy nhiên, gen crl1 mới là gen nằm ở phần đầu trong mạng lưới điều hòa gen liên quan đến sự tạo thành bộ rễ ở cây lúa. Nghiên cứu tiếp theo về gen crl1 cho thấy crl1 kích hoạt một bộ gồm 277 gen, trong số đó chọn ra 13 gen có mức độ biểu hiện mạnh (Coudert et al., 1 2015). Một trong số 13 gen đó chính là gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF mà chúng tôi quan tâm. Để có thể xác định được chính xác chức năng của gen CR7 đối với sự phát triển rễ phụ ở cây lúa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá chức năng của gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF liên quan đến sự phát triển rễ lúa”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen và làm sáng tỏ vai trò của gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã họ C2H2ZF đối với sự hình thành và phát triển của bộ rễ ở các dòng lúa chuyển gen. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đánh giá kiểu hình bộ rễ của các dòng lúa chuyển gen trong phòng thí nghiệm và trong nhà lưới. Nghiên cứu giải phẫu bộ rễ lúa ở mức độ tế bào, mô để đánh giá sự hoạt động của promoter thông qua gen chỉ thị GUS. Ở mức độ phân tử, đánh giá sự biểu hiện gen bằng kỹ thuật qPCR, sàng lọc các cây chuyển gen. 1.4. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI Về mặt khoa học, đề tài bổ sung thêm những kiến thức mới về cơ sở phân tử và di truyền liên quan tới quá trình hình thành và phát triển của bộ rễ. Về mặt thực tiễn, là cơ sở cho công tác chọn tạo giống lúa với đặc điểm di truyền bộ rễ tiềm năng đối với việc tăng năng suất và khả năng chống chịu các stress phi sinh học. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. HÌNH THÁI GIẢI PHẪU VÀ CHỨC NĂNG BỘ RỄ LÚA 2.1.1 Hình thái giải phẫu Cấu trúc rễ lúa bao gồm một vài rễ phôi và một số loại rễ hậu phôi. Hệ thống rễ lúa gồm 5 loại rễ: rễ phôi (radical root), rễ phụ phôi (embryonic crown root), rễ phụ hậu phôi (postembryonic crown root), rễ bên lớn (large lateral root), rễ bên nhỏ (small lateral root) (Hình 2.1). Rễ phôi xuất hiện đầu tiên, khoảng 2-3 ngày sau khi hạt nảy mầm thì xuất hiện 5 rễ phụ phôi từ nốt bao lá mầm trong giai đoạn xuất hiện lá thứ nhất và thứ hai. Rễ phụ (rễ phụ hậu phôi) hình hành từ các nốt thân và các nhánh được sắp xếp trong cùng một hoặc hai hàng (Hình 2.2). Hình 2.1. Cấu trúc và hình thái rễ lúa (ra: rễ phôi, cr: rễ phụ, ecr: rễ phụ phôi, slr: rễ bên nhỏ, llr: rễ bên lớn) Nguồn: Rebouillat et al.(2008) Trên thực tế, rễ bên có thể phát triển từ bất kỳ loại rễ sơ cấp nào gồm cả rễ phụ phôi và rễ phụ, dựa vào hình thái giải phẫu người ta chia rễ bên thành 2 loại: rễ bên lớn và rễ bên nhỏ. Rễ bên nhỏ có số lượng rất lớn nên có vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng của cây hơn so với rễ bên lớn. Ngoài ra, rễ bên nhỏ phát triển kéo dài về hai bên, còn rễ bên lớn kéo dài về phía bên dưới (Rebouillat et al., 2008). 3 Hình 2.2 Sự hình thành rễ lúa từ các nốt thân Nguồn: Rebouillat et al. (2008) Cấu trúc giải phẫu đối xứng của bộ rễ lúa phản ánh khả năng thích nghi với môi trường ngập nước với các loại mô chuyên hóa giúp chúng có khả năng sinh trưởng bình thường. Từ ngoài vào trong gồm có biểu bì, ngoại bì, cương mô, gỗ giữa hoặc trung bì và nội bì cuối cùng và phần bó mạch trung tâm (Hình 2.3). Biểu bì, ngoại bì, cương mô và nội bì cấu tạo từ một lớp tế bào đơn và giống nhau ở tất cả các loại rễ. Bên trong lớp biểu bì là lớp ngoại bì, lớp gần ngoài cùng nhất có chức năng bảo vệ các rễ già khi mà lớp biểu bì mất đi, lúc này lớp ngoại bì đóng vai trò như là lớp biểu bì có chức năng hấp thụ nước và chất dinh dưỡng (Rebouillat et al., 2008). Lớp cương mô được lignin hóa có chức năng chống đỡ cho lớp ngoại bì và hạn chế sự khuếch tán oxy và các chất khí khác giúp cây chống lại tình trạng thiếu khí. Trung bì được cấu tạo bởi 4-5 lớp tế bào xếp đối xứng, sẽ phân hóa hình thành nên mô khí. Mô khí có các tế bào tự phân giải theo cơ chế tự chết được lập trình của tế bào hoặc di chuyển từ phía trong ra phía ngoài tạo thành khoảng trống giữa các tế bào và phát triển thành gian bào. Mô khí có chức năng 4 trao đổi khí được dẫn xuống từ bộ phận phía trên của cây là nguồn cung cấp khí oxy cho quá trình hô hấp của cây. Sự phát triển của mô khí được thấy ở hầu hết các loài thực vật sống ngập nước. Mô khí có mặt ở tất cả các loại rễ lúa trừ rễ bên nhỏ bởi vì chúng không có lớp tế bào trung bì. Nội bì là loại mô cuối cùng thuộc hệ thống mô cơ bản (ground tissue system). Ở lớp tế bào nội bì có chứa vành đai casparian được cấu tạo bởi suberin bao quanh toàn bộ tế bào (bần hóa). Đai casparian phát triển mạnh khi rễ lúa sinh trưởng trong đất và kém phát triển hơn khi nuôi dưỡng trong môi trường thủy canh. Các tế bào nội bì đóng vai trò là rào cản đối với nước và chất dinh dưỡng được vận chuyển theo con đường apoplastic (vận chuyển qua khoảng gian bào giữa các tế bào) và vận chuyển có chọn lọc các chất theo con đường vận chuyển liên tế bào (cell symplast) giữa trung bì và phần bó mạch trung tâm. Hình 2.3. Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa Nguồn: Rebouillat et al. (2008) Tổ chức phần bó mạch trung tâm điển hình ở lớp một lá mầm gồm có các bó mạch xylem xếp xen kẽ với các mạch phloem. Mạch xylem hình thành nên vùng có áp suất cao kết hợp với các mạch xylem đang phát triển thành protoxylem xuyên qua vùng trung trụ. Sự phân hóa xylem và phloem theo hướng từ ngoài vào trung tâm. Ở rễ phôi, một hoặc hai mạch xylem trung tâm được tìm thấy ở giữa phần trung trụ, bao quanh bởi 6-8 mạch xylem nhỏ hơn. Ở loại rễ này, 6-7 ống phloem được xen kẽ với các mạch xylem. Mạch phloem được hợp thành bởi một vài loại tế bào tổ chức tương tự nhau từ mỗi ống protophloem 5 được liên kết với hai tế bào cùng nhau, hình thành nên cấu trúc đối xứng. Khoảng không gian giữa xylem và phloem được lấp đầy bởi các sợi cương mô (Rebouillat et al., 2008). 2.1.2. Chức năng bộ rễ lúa Bộ rễ lúa có chức năng chính là vận chuyển nước và muối khoáng hòa tan cung cấp cho cây. Bộ rễ lúa phát triển sâu vào lòng đất tác dụng như mỏ neo vững chắc chống đỡ cho cây. Ngoài ra, hệ thống rễ lúa còn thực hiện những chức năng thứ cấp như là nơi dự trữ hoặc tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng của cây. Các loại hormone như auxin, ABA, ethylen được tổng hợp ở rễ đóng vai trò như là các chất dẫn truyền tín hiệu trao đổi thông tin giữa chồi và rễ, từ đó giúp cây điều chỉnh quá trình sinh trưởng hợp lý (Wu and Cheng, 2014; Gregory and Kirkegaard, 2017). Xylem là cơ quan chuyên hóa cho quá trình vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng trong cây. Đây là một loại mô không đồng nhất được cấu tạo từ 4 loại tế bào khác nhau đó là tế bào ống, khung xương, sợi, nhu mô. Tế bào xylem ống và khung xương là yếu tố quan trọng liên quan trực tiếp tới sự vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng. Xylem sợi và mô mềm là các yếu tố liên kết, đóng vai trò là các cấu trúc bổ trợ. Xylem ống, xương và xylem sợi là những thành phần không sống trong khi đó xylem mô mềm là thành phần sống. Xylem thứ cấp (gỗ) thực hiện nhiều chức năng trong đó có vận chuyển các chất ở khoảng cách xa và vận chuyển tới lá cây (Ulrich et al., 2016). Nước và các chất tan được vận chuyển vào rễ theo 2 con đường: con đường vận chuyển qua thành vách tế bào (apoplastic) và vận chuyển qua hệ thống chất nguyên sinh thông qua cầu nối liên bào (symplastic) (Hình 2.4). Nước và các chất dinh dưỡng đi trong hệ thống thành vách tế bào nhờ hệ thống mao quản thông suốt với nhau. Tuy nhiên, đến vòng đai casparin (tế bào nội bì hóa bần 2 mặt, 2 mặt không hóa bần) thì bị chặn lại, nước và chất dinh dưỡng phải xuyên qua tế bào nội bì nhờ hệ thống chất nguyên sinh ở 2 mặt chưa hóa bần, sau đó lại đi vào thành vách tế bào của tế bào nhu mô ruột để vào mạch dẫn. Động lực chi phối các chất vận chuyển trong hệ thống apoplast là lực hút của các mao quản, lực trương của keo trong thành tế bào. Vận chuyển các chất theo hệ thống chất nguyên sinh (symplast) nhờ lực hút trương của hệ thống keo nguyên sinh chất (Hoàng Minh Tấn và cs., 2006). 6 Hình 2.4. Con đường vận chuyển nước và chất dinh dưỡng vào xylem của rễ Nguồn: Ulrich et al. (2016) 2.2. VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ LÚA TRONG VIỆC CHỐNG CHỊU VỚI CÁC TÁC NHÂN PHI SINH HỌC 2.2.1. Ảnh hưởng của các stress phi sinh học đối với sự phát triển của cây lúa Stress hạn Hạn thường được định nghĩa là sự thiếu hụt nước và khả năng trữ ẩm của đất xảy ra khi lượng nước sẵn có trong đất bị bốc hơi liên tục dưới điều kiện thời tiết khô nóng, gây ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của cây trồng. Stress hạn tác động lên cây lúa theo một số cách khác nhau, dẫn tới quá trình đóng khí khổng và hạn chế trao đổi khí. Stress hạn được đánh giá bằng sự giảm hàm lượng nước, thế năng nước của lá, áp suất trương, hoạt động của khí khổng, giảm sự sinh trưởng và mở rộng tế bào. Ở mức độ nghiêm trọng hơn, stress hạn dẫn tới ngưng quá trình quang hợp, gây rối loạn trao đổi chất và cây không còn khả năng sống sót. Stress hạn tác động tới quá trình sinh trưởng của cây thông qua một số quá trình sinh lý và sinh hóa khác nhau như quá trình quang hợp, hô hấp, vận chuyển, hấp thu các ion, carbonhydrate, quá trình đồng hóa dinh dưỡng và các promoter sinh trưởng (Singh et al., 2012). 7 Hình 2.5. Phản ứng của cây cảm ứng ABA trong điều kiện hạn Nguồn: Singh et al. (2012) Stress mặn Đất trồng trọt bị ảnh hưởng mặn ước tính khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 đất trồng trên toàn thế giới. Đất mặn thường đi kèm theo hiện tượng đất kiềm và ngập nước (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003). NaCl là muối chủ yếu gây ra mặn đất. Đất mặn được định nghĩa là đất có độ dẫn điện EC > 4.0 dS/m. Lúa là cây trồng mẫn cảm với đất mặn. Khi đất có độ mặn cao gây ra những tác động không thể phục hồi đối với cây như là sự rối loạn quá trình đồng hóa ion, làm sai hỏng chức năng màng tế bào, ức chế quá trình trao đổi chất dẫn tới ức chế sinh trưởng và giảm năng suất (Ji-Ping et al., 2007). Ảnh hưởng lớn nhất của mặn là làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng. Mặn tác động tới cây thông qua hai loại stress: stress về áp suất thẩm thấu (giai đoạn đầu) ở vùng rễ gây ra bởi nồng độ muối cao và stress ion (giai đoạn sau) gây ngộ độc cho cây. Nồng độ ion Na+ cao làm giảm quá trình ra hoa và tính hữu dục của hoa, bông lúa phát triển kém, hoạt động quang hợp bị ức chế. 8