Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của lactobacillus acidophilus trong chế phẩm probiotic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến: TS. Trần Thanh Thủy, người đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Bình Dương, Ban giám hiệu Trường Trung học phổ thông Bình Phú đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học. Quý thầy cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã tận tình dạy dỗ tôi trong thời gian học cao học. Quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh–Sinh hóa, Sinh lý trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh và Viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Trần Thị Minh Định, người đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài và chỉnh sửa luận văn. Tôi xin cảm ơn anh Phan Văn Giác, anh Nguyễn Xuân Đức, em Đỗ Thị Thu Nga, em Lê Đình Hưng và em Đặng Thị Tuyết đã nhiệt tình hỗ trợ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi. Trần Thị Ái Liên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực. Tác giả luận văn Trần Thị Ái Liên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 1 T 0 T 0 LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 2 T 0 T 0 MỤC LỤC .................................................................................................................... 3 T 0 T 0 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 6 T 0 T 0 MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7 T 0 T 0 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 9 T 0 T 0 1.1. Tổng quan về PROBIOTIC ........................................................................................9 T 0 T 0 1.1.1. Lược sử nghiên cứu .................................................................................................9 T 0 T 0 1.1.2. Các vi sinh vật probiotic thường gặp ....................................................................10 T 0 T 0 1.1.3. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic .............................................................12 T 0 T 0 1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic ....................................................................14 T 0 T 0 1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm probiotic....................................16 T 0 T 0 1.2.Vi khuẩn LACTIC ......................................................................................................18 T 0 T 0 1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý và phân loại ...............................................................18 T 0 T 0 1.2.2.Quá trình lên men lactic .........................................................................................22 T 0 T 0 1.2.3. Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic.............................23 T 0 T 0 1.2.4. Vai trò probiotic - lactic đối với người .................................................................24 T 0 T 0 1.2.5. Vai trò probiotic lactic đối với vật nuôi ................................................................26 T 0 T 0 1.2.6. Cơ chế tác động của probiotic – lactic ..................................................................28 T 0 T 0 1.2.7. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................30 T 0 T 0 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 32 T 0 T 0 2.1. Vật liệu ........................................................................................................................32 T 0 T 0 2.1.1. Nguyên liệu ...........................................................................................................32 T 0 T 0 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................................33 T 0 T 0 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................................33 T 0 T 0 2.1.4. Môi trường nuôi cấy ..............................................................................................33 T 0 T 0 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................35 T 0 T 0 2.2.1. Xác định khả năng sinh acid tổng bằng MT cacbonat agar ..................................35 T 0 T 0 2.2.2. Phân lập từ môi trường MRS ................................................................................36 T 0 T 0 2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [14]. ...................................................36 T 0 T 0 2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram [14] ............................................................................36 T 0 T 0 2.2.5. Phương pháp khảo sát khả năng di động [15] .......................................................37 T 0 T 0 2.2.6. Phương pháp xác định kiểu hô hấp [15]................................................................37 T 0 T 0 2.2.7. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính catalase [43] ..................................................38 T 0 T 0 2.2.8. Phương pháp xác định hoạt tính protease [15] ......................................................38 T 0 T 0 2.2.9. Phương pháp khảo sát khả năng sinh acid lactic [3], [11] ....................................38 T 0 T 0 2.2.10. Phương pháp khảo sát khả năng sinh bacteriocin ...............................................39 T 0 T 0 2.2.11. Phương pháp khảo sát khả năng đề kháng chất KS của LAB bằng đĩa giấy KS chuẩn ...............................................................................................................................40 T 0 T 0 2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng chịu đựng pH thấp [14], [15] ..........................41 T 0 T 0 2.2.13. Khả năng chịu đựng acid mật [14] ......................................................................41 T 0 T 0 2.2.14. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ..................42 T 0 T 0 2.2.15. Ảnh hưởng pH ban đầu đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ............................42 T 0 T 0 2.2.16. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ..................................43 T 0 T 0 2.2.17. Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh, lắc đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ...43 T 0 T 0 2.2.18. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon MT nuôi cấy đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn .............................................................................................................43 T 0 T 0 2.2.19. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ...............................................................................................................................44 T 0 T 0 2.2.20. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ....................................................................................................................44 T 0 T 0 2.2.21. Động thái quá trình sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn các chủng LAB được tuyển chọn .......................................................................................................................44 T 0 T 0 2.2.22. Bảo quản giống vi khuẩn lactic bằng phương pháp đông khô [14] [15].............45 T 0 T 0 2.2.23. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch [17] ..............................................................................................45 T 0 T 0 2.2.24. Phương pháp.định danh bằng sinh học phân tử ..................................................46 T 0 T 0 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 48 T 0 T 0 3.1. Kết quả phân lập chủng Lactobacillus acidophilus .................................................48 T 0 T 0 3.1.1. Xác định khả năng sinh acid bằng môi trường cacbonat agar ..............................48 T 0 T 0 3.1.2. Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trường MRS .....................................................48 T 0 T 0 3.2. Đặc điểm sinh học của hai chủng LAB được tuyển chọn .......................................52 T 0 T 0 3.2.1. Các đặc điểm hình thái của chủng PA2 và PP ......................................................52 T 0 T 0 3.2.2. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng PA2 và PP .......................................53 T 0 T 0 3.3. Phổ kháng khuẩn của 2 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu....................................56 T 0 T 0 3.4. Khả năng chịu đựng điều kiện bất lợi trong đường tiêu hóa của các chủng LAB nghiên cứu ..........................................................................................................................58 T 0 T 0 3.4.1. Khả năng kháng các chất kháng sinh ....................................................................58 T 0 T 0 3.4.2. Khả năng chịu đựng pH thấp.................................................................................60 T 0 T 0 3.4.3. Khả năng chịu acid mật .........................................................................................61 T 0 T 0 3.5. Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của chủng tuyển chọn ..............................................................................................................63 T 0 T 0 3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ........................................................................63 T 0 T 0 3.5.2. Ảnh hưởng pH ban đầu .........................................................................................66 T 0 T 0 3.5.3. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................68 T 0 0T 3.5.4. Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh và lắc.............................................................71 T 0 T 0 3.5.5. Nguồn cacbon ........................................................................................................73 T 0 T 0 3.5.6. Nồng độ glucose ....................................................................................................76 T 0 T 0 3.5.7. Nồng độ cao nấm men ...........................................................................................78 T 0 T 0 3.6. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng LAB trong điều kiện tối ưu ........................................................................................................................................80 T 0 T 0 3.7. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic sau đông khô ...........................83 T 0 T 0 3.8. Định danh đến loài bằng phương pháp sinh học phân tử ......................................84 T 0 T 0 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 86 T 0 T 0 Kết luận ..............................................................................................................................86 T 0 T 0 Kiến nghị ............................................................................................................................87 T 0 T 0 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 88 T 0 T 0 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 94 T 0 T 0 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU Colony forming unit (mật độ tế bào) ĐC Đối chứng G- Gram âm P P G+ Gram dương KS Kháng sinh LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) L Lactobacillus MT Môi trường MRS De Man - Rogosa - Sharpe OD Optical density (mật độ quang) ST Sinh trưởng VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật P P MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, khi chất lượng cuộc sống không ngừng được nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe con người ngày càng được chú trọng. Do vậy, việc tạo ra các chế phẩm sinh học nhằm cải thiện và tăng cường sức khỏe con người được tạo ra ngày càng nhiều. Một trong những chế phẩm sinh học đó chính là probiotic, chúng được tạo ra từ việc ứng dụng vi sinh vật (VSV) có lợi bổ sung vào hệ tiêu hóa của con người. Việc sử dụng VSV probiotic thực tế đã mang lại nhiều lợi ích to lớn đối với sức khỏe con người, thông qua các đặc tính probiotic vốn có của chúng. Điển hình là điều trị các chứng bệnh rối loạn đường tiêu hóa, khắc phục một số hạn chế do việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp đồng hóa lactose trong sữa uống đối với các bệnh nhân không có khả năng dung nạp lactose trong sữa. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được dễ dàng hơn, hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể chủ,... Những chủng vi sinh vật probiotic thường được nghiên cứu và sử dụng chủ yếu là vi khuẩn lactic nhờ có các đặc tính ưu việt phù hợp cho việc sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi. Những đặc tính đó là: khả năng sống sót và phát triển tốt trong điều kiện bất lợi ở đường tiêu hóa của người như acid mật, pH thấp, kháng sinh,... Đồng thời, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn như acid lactic, bacteriocin, H 2 O 2 , diacetyl,… tạo môi trường bất lợi, từ đó ức chế VSV gây bệnh và thiết R R R R lập sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy quá trình tiêu hóa hấp thu các chất của cơ thể vật chủ. Trong số các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu làm probiotic thì chủng Lactobacillus acidophilus sớm được biết đến và nghiên cứu nhiều nhất. Đây là chủng vi khuẩn được phân lập đầu tiên bởi Moro (1900) từ ruột người và động vật, đặc biệt là từ phân của trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa mẹ. Mặt khác, vi khuẩn này có mặt trong hầu hết các chế phẩm probiotic trên thị trường hiện nay. Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu cho mình là: “Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế phẩm probiotic”. Với mục tiêu: Nhằm tìm hiểu vai trò probiotic của L. acidophilus thông qua các đặc điểm sinh học của chủng này. Nhiệm vụ của đề tài: 1. Phân lập, tuyển chọn 2 chủng L. acidophilus từ các chế phẩm probiotic dành cho người. 2. Tìm hiểu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng L. acidophilus. 3. Khảo sát phổ kháng khuẩn của 2 chủng L. acidophilus với các VSV gây bệnh đường ruột ở người. 4. Nghiên cứu khả năng tồn tại trong điều kiện bất lợi ở đường ruột. 5. Xác định các điều kiện ST và sinh chất đối kháng của 2 chủng L. acidophilus được tuyển chọn. 6. Nghiên cứu khả năng sống sót sau quá trình đông khô. 7. Phân loại đến loài 2 chủng VK nghiên cứu bằng sinh học phân tử. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về PROBIOTIC 1.1.1. Lược sử nghiên cứu Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người bệnh và người khỏe mạnh. Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi là probiotic. Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ những vi sinh vật đã được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người và động vật [63]. Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có chứa “Lactobacillus acidophilus” [15]. Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công việc kích thích sự tăng trưởng của heo bằng thức ăn có bổ sung L. acidophilus [15], [65]. Khái niệm này sau đó được làm rõ hơn bởi Fuller (1989). Probiotic là “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó”. Một định nghĩa khác về probiotic là “các vi sinh vật sống có ích cho sức khỏe của vật chủ khi được bổ sung một lượng vừa đủ” [54]. Đây là những nhóm vi khuẩn (VK) sống trong đường tiêu hóa của người, chúng tạo thành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của một số VSV gây bệnh, cung cấp cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch. Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc phòng và chữa bệnh [60]. Nghiên cứu về việc sử dụng VSV probiotic trong chế độ ăn uống đã được tiếp tục suốt cả thế kỷ qua. Công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột. Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các VSV này, cũng như về bảo đảm sự sống sót của các VK này khi ở trong vùng dạ dày - ruột và các loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen, 2001). 1.1.2. Các vi sinh vật probiotic thường gặp Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB. Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp: Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen và Gorbach (1999), một số loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó chủ yếu là những loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus như L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,… Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá trình sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sung thêm trong chế phẩm như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt là fructoligosaccharide, là một tá dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chế phẩm propiotic. Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (như L. acidophilus hay L. sprorogenes,…) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L. acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…). Sử dụng chế phẩm probiotic - lactic là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu hóa, giúp duy trì hệ VSV có lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ những tác dụng trong cơ thể người [12], [49].  Bacillus subtilis B. subtilis là VK ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng được sử dụng qua đường uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi dùng kháng sinh (KS). B. subtilis có tác dụng hồi phục hệ VSV tự nhiên trong đường tiêu hóa của người sau khi dùng KS kéo dài. Các chế phẩm B. subtilis được bán ở hầu hết các nước Châu Âu, mặc dù người ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của B. subtilis có thể vượt qua rào chắn đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis đã được biết như làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [63].  Bacillus clausii [17] - Thuộc giống Bacillus, G+, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các MT dinh dưỡng P P thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp VK tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Bào tử của B. clausii có thể qua dạ dày với tỉ lệ sống sót cao, có thể sống được trong MT dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ. Chúng đề kháng rất tốt với nhiều loại KS. Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian điều trị KS. - Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trưởng và tiếp tục sinh sôi nảy nở trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại được khoảng trống rối loạn hệ VK trong đường ruột. Đồng thời sự ST của B. claussi sẽ tái lập được điều kiện kị khí, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đường ruột (như Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác nhau. - B. clausii thường được dùng tạo chế phẩm probiotic cho người như chế phẩm Enterogermina ở dạng lỏng. Bào tử được bào chế dưới dạng hỗn dịch không màu, không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho trẻ em. Nấm men được sử dụng làm probotic như Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii. Trong các chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản. Ngoài ra, chúng còn tiết enzyme tiêu hóa như amylase, protease,…[15]. S. boulardii: được dùng như probiotic từ năm 1950. Là thành phần chính của một số chế phẩm probiotic như ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp). Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu chảy do KS và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori. S. boulardii tác động thông qua cơ chế: + Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra. + Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và Naminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải. + Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào T.  Nấm mốc trong chế phẩm probiotic có vai trò tạo sinh khối chứa nhiều acid amin, sản xuất enzyme amylase, protease nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn ở động vật nuôi [15]. 1.1.3. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác động thông qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa. Điển hình là các điều kiện như pH thấp, acid mật, kháng sinh,…  Chịu pH thấp Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu. Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều kiện áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được chọn lọc để sử dụng như trong chế phẩm probiotic cần phải chịu được môi trường pH thấp ít nhất 90 phút. Sống sót ở pH 3,0 trong 2 giờ và nồng độ acid 1000 mg/l được xem như là khả năng chống đỡ đối với acid tối ưu đối với các chủng probiotic [43]. Tiếp đến, chúng phải gắn vào biểu mô và phát triển được trong ruột trước khi chúng có thể bắt đầu phát huy vai trò đối với sức khỏe vật chủ. Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzyme trong đường miệng như lysozyme. Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để sàng lọc khi muốn tuyển chọn các dòng probiotic [40].  Chịu acid mật Acid mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm người), quá trình tổng hợp acid mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol. Cơ thể tổng hợp khoảng 8 mg cholesterol một ngày và dùng 4 mg cholesterol để tổng hợp acid mật. Tổng cộng có khoảng 20 – 30 g acid mật tiết vào ruột mỗi ngày [68]. Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột. Tại đây, chúng chịu sự tác động của acid mật. Khi acid mật đi vào khu vực tá tràng thì số lượng VSV sẽ giảm. Khả năng chịu đựng acid mật là một trong những đặc tính cần thiết của VSV có hoạt tính probiotic [54].  Chịu kháng sinh Kháng sinh được ứng dụng phổ biến trong điều trị một số bệnh cho người cũng như vật nuôi. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do KS mang lại thì phương pháp trị liệu KS có một số hạn chế nhất định như là tác động loại bỏ không phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ VSV có lợi trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị liệu này đã dẫn đến thay đổi sự cân bằng hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này. Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được chỉ định uống trong thời gian điều trị bệnh bằng kháng sinh, để phòng mất cân bằng hệ VSV trong đường ruột. Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu đựng được kháng sinh [14].  Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột Các chủng VSV probiotic khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau lên đường tiêu hóa. Chúng chỉ có thể tác động được khi chúng có thể ST và phát triển tốt trong đường tiêu hóa. Do vậy, bên cạnh khả năng sống sót thì chúng phải có khả năng bám vào thành biểu mô ruột, nhờ đó chúng mới không bị rửa trôi ra ngoài cùng với phân [34]. Sự kết bám với tế bào biểu mô ruột là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư lâu dài của VK probiotic trong đường ruột, chống lại sự loại bỏ do nhu động ruột và tạo được một ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột (Pedersen và Tannock 1989; Freter 1992; Alander và cộng sự 1997) [31], [35]. Bên cạnh khả năng sống sót và phát triển được trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa, vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt tính kháng khuẩn như các acid hữu cơ, ethanol, bacteriocin, H 2 O 2 ,… Những chất này được sản R R R R sinh cùng với quá trình ST và phát triển của chúng trong đường tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ sinh thái đường ruột. Ngoài ra, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol, lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng nhiều enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn diễn ra dễ dàng. Bên cạnh đó, chúng còn giúp hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư, các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch cơ thể chủ, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,…[12],[49]. Theo tổ chức lương thực và thực phẩm Quốc Tế (FAO) [61]. Một chủng VSV được sử dụng tạo chế phẩm probiotic cần phải đảm bảo tiêu chuẩn sau đây: - Giống dùng cho probiotic phải mang tính đại diện và được công nhận chung về tính an toàn cho người và vật nuôi (GRAS microorganism) [28], [51]. - Có nguồn gốc từ người được chứng minh an toàn cho người. - Có khả năng sống sót trong điều kiện acid ở dạ dày, nồng độ acid mật và kháng sinh trong ruột. - Có khả năng kết bám vào biểu mô ruột, định cư và tăng trưởng nhanh về số lượng trong ruột người. - Góp phần điều chỉnh tích cực chức năng của ruột. - Khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol và lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được diễn ra dễ dàng, hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết và khử các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại [12],[52]. - Tạo ra chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng mầm bệnh ở người như sản sinh acid L - lactic và những chất ức chế VK gây hại. - Có khả năng tiết ra các chất có hoạt tính sinh học có thể kích thích đáp ứng miễn dịch, làm gia tăng chức năng phòng thủ của mạng lưới tế bào chủ. - Có khả năng tồn tại trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản bằng đông khô. 1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên đường tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ,…  Cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh Hệ vi sinh vật ở đường tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác nhau, một trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng KS dài ngày dẫn đến việc tiêu diệt các VSV có lợi trong ruột. Để khắc phục điều này, người ta thường bổ sung các VSV có lợi thông qua sử dụng probiotic. Các VSV probiotic sẽ phát triển, chiếm ưu thế trong đường ruột bằng cách cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sản sinh. Từ đó, ức chế và tiêu diệt được VSV gây hại, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Trong một nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp thường xuyên các VSV có lợi dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật nuôi với liều lượng thích hợp (1,2 tỷ CFU/ kg thức ăn/ ngày), sự cân bằng của hệ VSV đường ruột được duy trì [7], [13], [23], [56].  Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lượng cạnh tranh vị trí bám với VK gây bệnh, chúng còn tác động nhờ vào khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như KS, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, acid béo, …), diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol,… Đặc biệt, nhiều chủng VSV còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn [53]. Những chất này có tác dụng ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh ở đường ruột.  Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột. Một số chủng VSV probiotic khi được bổ sung vào đường tiêu hóa có vai trò tăng cường hoạt động chuyển hóa của một số chủng VK đường ruột khác. Chẳng hạn như khi sử dụng L. rhamnosus dưới dạng sữa lên men, chúng kích thích hoạt động enzyme và khả năng biến dưỡng của VK đường ruột [56].  Điều hòa phản ứng miễn dịch Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng điều hòa phản ứng miễn dịch thông qua ảnh hưởng lên lympho bào B. Như khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hóa 3H - thymidine trong tế bào lách ở P P chuột. Ngoài ra, L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159 cũng có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [56]. Ngoài ra, VSV probiotic còn tác động lên hệ tiêu hóa của người cũng như vật nuôi bằng những cơ chế khác, như đồng hóa lactose trong sữa,... Sự không dung hòa lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người thiếu khả năng sản xuất enzyme lactase hay βgalactosidase. Lactase cần thiết để đồng hóa lactose trong sữa, phân giải chúng thành các phân tử đường glucose và galactose đơn giản. Các cá thể thiếu lactase sẽ không tiêu hóa được sữa và thường gây ra những khó khăn trong quá trình tiêu hóa, đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Triệu chứng thường thấy là khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp bẻ, đầy hơi, nôn và buồn nôn,… khi dùng sữa. Một vấn đề khác có liên quan đến việc không dung hòa lactose là tình trạng thiếu canxi do không dùng sữa. Ngoài ra, VK khu trú trong ruột kết không lên men tiêu hóa được lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây ra các triệu chứng như đau bụng, sưng phù và tiêu chảy [22]. Các dòng probiotic đã được chứng minh là có thể giải quyết vấn đề không dung hòa được lactose nhờ khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ β-galactosidase ở ruột non. Do vậy, người ta cho các bệnh nhân không dung hòa được lactose sử dụng probiotic. Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ được đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [53]. 1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm probiotic Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau. Một trong những chế phẩm probiotic được biết đến phổ biến với tên thường gọi là “men vi sinh”. Chúng tồn tại ở các dạng như cốm, bột, lỏng, viên nén,… chứa VSV có thể ở dạng sống, chết đông khô, xác VK. Các sản phẩm probiotic có thể phối hợp nhiều chủng VK (như L. acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…) hoặc chỉ sử dụng một chủng VK ( như L. acidophilus hay L. sprorogenes,…) [12], [49]. Một số chế phẩm thông dụng ở dạng men tiêu hóa trên thị trường hiện nay như Antibio (Hàn Quốc), Probio (Việt Nam), Acidophilus (Mỹ), Biolactyl (Việt Nam), Lactéol (Pháp), Bio - acimin (Việt Nam), Biolactyl (liên doanh Pháp), L – bio - 3D (Việt Nam), Bioflora (Pháp),… Các chế phẩm này được sử dụng nhằm khắc phục: các chứng bệnh về đường tiêu hóa, một số hạn chế do điều trị bằng KS dài ngày mang lại, điều trị tiêu chảy cấp, tăng cường khả năng miễn dịch,… Tuy nhiên, thực tế cho thấy chất lượng các chế phẩm probiotic trên thị trường hiện nay đang là một vấn đề đáng lo ngại. Theo Yeung P.S.M và cộng sự, có một số sản phẩm thương mại probiotic ghi trên nhãn không đúng với nội dung (xem bảng 1.1), có đến 28/44 sản phẩm nghiên cứu có tên không đúng với nội dung ghi trong nhãn, trong đó có 9/16 sản phẩm trên nhãn là L. acidophilus nhưng khi kiểm nghiệm bằng phương pháp lên men carbonhydrat lại cho kết quả là một loài khác [9], [58]. Bảng 1.1. Kết quả khảo sát một số chế phẩm probiotic [58] Số sản phẩm không Loài không được công bố nhưng có đúng tên trong sản phẩm 7/15 sản phẩm dược Phương pháp L. paracasei; L. leichmannii; E. Lên faecium; S. cerevisiae; L. rhamnosus carbonhydrat men 6/19 sản phẩm thực L. plantarum; L. delbrueckii, phẩm chức năng P. pentosacceus; E. faecium, API rapid ID KIT L. rhamnosus 5/13 sản phẩm thực L. plantarum; L. delbrueckii, P. API rapid ID KIT phẩm chức năng pentosaceus, E. faecium, L. rhamnosus; L. fermentum 9/15 sản phẩm thực L. phẩm chức năng johnsonii; L. rhamnosus, paracasei; L. crispatus L. DNA – DNA homology Theo kết quả kiểm tra mới đây (2011) của Thanh tra Sở Y tế Tp. Hồ Chí Minh: khoảng 50% men vi sinh trên thị trường Tp. Hồ Chí Minh chứa men độc, thậm chí nhiều men thực chất chỉ là bột mì có chứa độc tố [66]. Theo kết quả kiểm nghiệm thuốc của tác giả Phạm Hùng Vân (2007) thì có đến 4/10 chế phẩm probiotic cho người đã sử dụng không đúng chủng được ghi trên nhãn thuốc. Đặc biệt, các sản phẩm này đã bổ sung nhầm VK gây hại vào các chế phẩm probiotic. Điển hình là chế phẩm Biosubtyl DL (dạng gói bột do Viện Vắc xin Đà Lạt sản xuất) và chế phẩm Subtyl (dạng viên nén, sản xuất tại Việt Nam). Hai chế phẩm đã ghi thành phần trên nhãn là vi khuẩn B. subtilis, nhưng thực tế lại là Bacillus cereus, một loài VK gây bệnh đường tiêu hóa do có nhiều dòng mang độc tố gây nôn ói và tiêu chảy sau khi uống sớm nhất là nửa tiếng [17], [67]. Theo kết quả nghiên cứu khác của tác giả Nguyễn Thị Minh Tâm (2008): có 4/14 chế phẩm probiotic khảo sát đã công bố trên nhãn là L. acidophilus nhưng kết quả định danh bằng API50CHL cho thấy VK phân lập được không liên quan đến loài này [9]. Kết quả kiểm nghiệm thuốc mới đây của Cục Quản lý Dược cho biết 2 loại men tiêu hóa: thuốc bột Biolac (lô sản xuất 030710, ngày sản xuất 15/7/2010, có hạn dùng 14/7/2012, số đăng ký QLSP-0046-08) và thuốc viên nang Biolac 500mg (lô sản xuất 321210, ngày sản xuất 10/12/2010, hạn dùng 9/12/2012, số đăng ký QLSP-0046-08) không đạt tiêu chuẩn chất lượng về định tính, độ nhiễm khuẩn và độ đồng đều khối lượng. Do vậy, Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế có quyết định đình chỉ lưu hành và yêu cầu thu hồi trên toàn quốc [65]. Tác dụng và hiệu quả lâm sàng của các chế phẩm probiotic phụ thuộc gần như hoàn toàn vào đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng VSV được sử dụng. Chỉ những loài nào đã được nghiên cứu lâm sàng đầy đủ mới bảo đảm an toàn và lợi ích sử dụng được chứng minh một cách khoa học. Vì vậy, việc công bố sai danh pháp của VSV trong chế phẩm probiotic là một điều không thể chấp nhận được. Để bảo đảm quyền lợi cho người tiêu dùng, cần phải có một tiêu chuẩn kiểm tra các sản phẩm chức năng mà trong đó chỉ tiêu định danh phải được quan tâm đúng mức, xây dựng đủ cơ sở khoa học cho công tác kiểm nghiệm. 1.2.Vi khuẩn LACTIC 1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý và phân loại Nhìn chung vi khuẩn lactic là vi khuẩn G+, không tạo bào tử, kị khí tùy ý và hầu hết P P không di động. Chúng thuộc loại đa khuyết dưỡng, được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm lên men như sữa chua, kim chi, dưa muối chua, nem chua,… LAB tồn tại khá hạn chế trong một số MT do nhu cầu dinh dưỡng cao của nó [10]. Về mặt hình thái, các nhóm LAB tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hình que hoặc hình cầu [10]. Về mặt sinh lí, chúng tương đối đồng nhất: thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrat và tiết ra acid lactic. Khác với các VK đường ruột sinh acid lactic, LAB là nhóm kị khí không bắt buộc, chúng không có cytochrome và enzyme catalase. Tuy nhiên, chúng vẫn có thể ST được khi có mặt oxy do có enzyme peroxidase [18]. Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được xếp vào 4 họ: Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, Streptococcaceae, thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus; Pediococcus Họ II: Enterococcaceae Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococceae Giống: Streptococcus; Lactococcus